牡蠣多糖的制備及抗腫瘤活性研究

牡蠣多糖的制備及抗腫瘤活性研究

牡蠣是具有重要藥用價(jià)值的海洋貝類(lèi)。據(jù)分析，除了含有豐富蛋白質(zhì)的肉中的糖原和茶多酚外，還有大量的糖原和沉積物。國(guó)內(nèi)外報(bào)道了牡蠣粗提液具有抗腫瘤、抗氧化及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種作用,然而這方面的研究?jī)H停留在粗提物水平,對(duì)牡蠣多糖(Oysterpolysaccharides,OP)和其他小分子物質(zhì)的抗腫瘤活性研究較少。本實(shí)驗(yàn)以廣西北部灣產(chǎn)牡蠣為材料分離提純牡蠣多糖粗品,采用MTT法探討牡蠣多糖粗品對(duì)腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,進(jìn)一步研究牡蠣的藥用價(jià)值,為深入開(kāi)發(fā)海洋藥用資源打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1動(dòng)物蛋白酶試劑新鮮牡蠣,采自廣西北部灣海域,去殼、清洗并勻漿,置-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?動(dòng)物蛋白酶購(gòu)自廣西龐博生物有限公司,乙醇、三氯乙酸、硫酸等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。鼻咽癌?xì)胞CNE-1和人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心傳代保株。1.2電子天平自然生成RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海博通);TGL臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭離心機(jī)廠出品);電子天平;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(ThermoFormaMODEL3111);酶標(biāo)儀芬蘭labsysytem公司出品;倒置相差熒光顯微鏡和生物顯微鏡為ZEISS公司出品。2方法2.1牡蠣多糖的提取取牡蠣勻漿,調(diào)節(jié)pH約5.5時(shí),按照牡蠣組織的2‰加入動(dòng)物蛋白水解酶,置50℃水浴中酶解5h,酶解液中加入無(wú)水乙醇使乙醇濃度達(dá)到70%,進(jìn)行乙醇沉淀,4℃靜置過(guò)夜,取沉淀物4000r/min速度離心10min。所得沉淀物分別用80%、90%以及無(wú)水乙醇進(jìn)行梯度洗滌脫水,抽濾得到牡蠣多糖混合液。牡蠣多糖混合液再用加熱、動(dòng)物蛋白酶水解變性、三氯乙酸沉淀等方法將蛋白質(zhì)部分去除,活性炭脫色,經(jīng)透析即得牡蠣多糖粗品。用改良的苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量。2.2牡蠣多糖的pbs和pbs作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL,加入蓋玻片并爬片培養(yǎng)24h后,加入不同濃度的牡蠣多糖,對(duì)照組加入等量的PBS,作用24h。取出上述各組長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片,PBS洗滌,95%乙醇固定,HE染色,光鏡觀察、攝片,觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。2.3牡蠣多糖的制備和測(cè)定取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用0.5%胰蛋白酶消化,加入含小牛血清的培養(yǎng)液計(jì)數(shù)并稀釋至1×105個(gè)/mL。將稀釋的細(xì)胞懸液按100μL/孔接種至96孔板,置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24h至細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的牡蠣多糖。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔,繼續(xù)培養(yǎng)24h。加入20μL5mg/mL的MTT,置37℃、5%二氧化碳條件下孵育4h,棄盡孔內(nèi)液。每孔中加入100μL的DMSO溶解MTT產(chǎn)物。用酶標(biāo)儀振蕩30s后,于490nm處測(cè)定每個(gè)孔的OD值。實(shí)驗(yàn)中另設(shè)只加細(xì)胞而不加任何藥物的空白對(duì)照組,以PBS補(bǔ)足體積。按下列公式計(jì)算抑制率:生長(zhǎng)抑制率=(1-用藥平均A值/對(duì)照平均A值)×100%。2.4統(tǒng)計(jì)分析方法采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包中多個(gè)樣本率比較的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05代表差異有顯著性。2結(jié)果2.1牡蠣多糖的提取本實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物蛋白酶水解、醇沉、脫色、透析,提取獲得牡蠣多糖粗品,呈淡綠色粉末狀,水溶性好。多糖的提取率為5.72%,98.5%的蛋白質(zhì)被去除,總糖含量為83.15%。2.2牡蠣多糖對(duì)有關(guān)肺胰腺組織中細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不同濃度的牡蠣多糖作用于鼻咽癌CNE-1細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞后,采用MTT法測(cè)定其對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。從附表可以看出,牡蠣多糖對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率出現(xiàn)明顯的量效關(guān)系,即濃度越高,抑制率越強(qiáng)。其IC50分別為138.25μg/mL和47.88μg/mL。3.3牡蠣多糖對(duì)有關(guān)檢林克氏雙、5細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞的抑制率由圖1和圖2看出:加入濃度為高濃度和低濃度的牡蠣多糖后,鼻咽癌CNE-1細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞,細(xì)胞體積變小,核漿變少,核固縮,細(xì)胞質(zhì)濃縮,數(shù)目減少,細(xì)胞的分裂指數(shù)降低。3牡蠣多糖的結(jié)構(gòu)和組成從牡蠣中分離多糖物質(zhì),首先需要除去牡蠣中富含的蛋白質(zhì)。大量文獻(xiàn)報(bào)道,去除蛋白質(zhì)常采用單一的蛋白水解酶,如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。這些工藝對(duì)蛋白水解條件如反應(yīng)體系的溫度、pH值要求苛刻,而且水解效率低,獲得的多糖純度不高。為了克服這一弊端,本課題選擇了動(dòng)物蛋白水解酶,采用乙醇沉淀、透析并結(jié)合組織蛋白酶法,將牡蠣中的多糖物質(zhì)充分溶解出來(lái),提高了牡蠣多糖的得率,保持了多糖物質(zhì)的生物活性,有利于人體的吸收。本實(shí)驗(yàn)采用的工藝表明,中性條件下酶解能力很強(qiáng),且具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短及蛋白水解效率高的優(yōu)點(diǎn)。四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和增殖的方法?；罴?xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能將淡黃色的MTT還原為藍(lán)紫色的結(jié)晶,后者的產(chǎn)量與活細(xì)胞數(shù)成正相關(guān),而死細(xì)胞或紅細(xì)胞則無(wú)這種能力,從而可用比色法推測(cè)細(xì)胞的存活和增殖程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不論是MTT實(shí)驗(yàn)還是HE染色結(jié)果,隨著牡蠣多糖濃度的增加,對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)和血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制作用越明顯,呈現(xiàn)良好的濃度依賴性。本實(shí)驗(yàn)獲得的牡蠣多糖可能是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特、作用機(jī)制特殊的多糖類(lèi)物質(zhì),有必要對(duì)其結(jié)構(gòu)和組成做進(jìn)一步的分析鑒定。從HE染色的細(xì)胞形態(tài)的變化來(lái)觀察,牡蠣多糖作用后的細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞皺縮、胞漿減少且核固縮,出現(xiàn)類(lèi)似凋亡形態(tài)學(xué)的改變。大量實(shí)驗(yàn)表明,在腫瘤血管生成過(guò)程中,受血管生成刺激因子的作用或在某些病理狀態(tài)下,內(nèi)皮細(xì)胞增殖速率和凋亡速率嚴(yán)重失衡,當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于凋亡速率時(shí),便導(dǎo)致腫瘤新生血管的形成。新生血管為腫瘤的生長(zhǎng)提供了充分的營(yíng)養(yǎng),也為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供了有利條件。惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴新生血管的形成,若能阻斷腫瘤內(nèi)新生血管的形成,則可抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤的新生血管形成是近年來(lái)腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn),也是很有希望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。所以近年來(lái),國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都在積極探索腫瘤血管形成的調(diào)節(jié)機(jī)制,并從