竹筍皮中抑菌活性成分的初步研究

竹筍皮中抑菌活性成分的初步研究

蘆筍又名石蠟，是天門冬屬白合科多年生草本植物。這是一種類似于藥食的蔬菜。我國(guó)的《神農(nóng)本草經(jīng)》將蘆筍列為“上品之上”。蘆筍中含有許多活性成分,如天門冬酰胺、天門冬氨酸、葉酸、核酸、果糖、低聚糖、黃酮類物質(zhì)等藥用成分?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明,蘆筍不僅可以提高人的體力,消除疲勞,醫(yī)治食欲不振等疾病,而且對(duì)尼古丁中毒、心臟病、動(dòng)脈硬化、神經(jīng)病、皮炎、結(jié)核病等也有食療作用。更重要的是它具有抗癌作用,是世界十大名菜之一,在國(guó)際市場(chǎng)上有“蔬菜之王”的美稱。蘆筍近年來受到人們的廣泛關(guān)注和贊賞,這不但得益于它有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,而且得益于它有極強(qiáng)的藥學(xué)價(jià)值。研究表明蘆筍具有抗腫瘤、降血脂、抗衰老、抗疲勞、抗突變、抗菌及防癌抗癌功效。據(jù)統(tǒng)計(jì),蘆筍在加工罐藏品和速凍品過程中,占原料重量15%～25%的蘆筍皮被去掉,蘆筍皮中的營(yíng)養(yǎng)成分種類與去皮筍相同,有多種營(yíng)養(yǎng)成分的含量超過去皮筍,但這一寶貴資源沒有得到合理利用,不僅造成了資源浪費(fèi),還增加了企業(yè)處理廢棄料的成本。本課題組對(duì)蘆筍皮進(jìn)行了一系列的研究,結(jié)果表明蘆筍皮具有抗疲勞、降血脂的功能,另外還對(duì)蘆筍皮中的膳食纖維和黃酮類物質(zhì)進(jìn)行了提取純化。經(jīng)過長(zhǎng)期保存的蘆筍皮未發(fā)現(xiàn)有任何的生霉生蟲現(xiàn)象,這可能與它自身含有抑菌成分有關(guān),而目前對(duì)于蘆筍皮抗菌功能的研究基本屬于空白。大量報(bào)道黃酮類物質(zhì)具有抗菌性,例如李春美等研究的柚皮提取物抗菌性能的研究以及李云燕等發(fā)表的板栗殼色素抑菌性能的研究,均與提取物中所含的黃酮類物質(zhì)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在這一假設(shè)的基礎(chǔ)上,運(yùn)用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,研究蘆筍皮的抗菌功效,為天然抗菌劑提供原料,并可提高蘆筍的綜合利用價(jià)值。1材料和方法1.1材料表面蘆筍皮山西省聞喜縣綠色食品廠;營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;菌種自制。1.2試劑乙醇溶液、蒸餾水和氯化鈉(分析純)。1.3回用儀器、光催化染料植物粉碎機(jī)、電熱恒溫水浴鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、空氣浴振蕩器、超凈工作臺(tái)、手提式壓力消毒器、2100型分光光度計(jì)、菌落計(jì)數(shù)器、分析天平。1.4方法1.4.1提取液的制備稱取一定量粉碎后的蘆筍皮粉,置于三角瓶中,加入一定量的蒸餾水或一定濃度(90%)的酒精溶液,配制成料液比為1:20的溶液,然后在90℃的恒溫水浴鍋中浸提1h后,過濾即得提取液。1.4.2培養(yǎng)基制備取45g營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基粉加入到1000ml蒸餾水中,加熱待完全融化后分裝,并經(jīng)121℃,15min高壓滅菌后備用。1.4.3無菌生理鹽水的制備準(zhǔn)確稱取0.9gNaCl加入100ml蒸餾水中充分溶解,而后經(jīng)121℃,15min高壓滅菌后備用。1.4.4培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)菌將滅菌后的培養(yǎng)基倒平板,而后在空氣中敞口放置約30min,后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,選擇生長(zhǎng)良好、數(shù)量較多的一種菌作為優(yōu)勢(shì)菌;取優(yōu)勢(shì)菌的一個(gè)菌落接種到平板培養(yǎng)基上純化,又經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,作為配制菌懸液的目標(biāo)菌。1.4.5菌懸液的稀釋在無菌狀態(tài)下,向滅過菌的試管中加9ml無菌生理鹽水,然后用接種環(huán)挑取1～2個(gè)大小適宜的菌落,經(jīng)空氣浴振蕩器充分振蕩1h后即可得一定濃度的菌懸液,此時(shí)菌懸液濃度約為1×105～1×106CFU/ml。取1ml制備好的菌懸液,采用10倍稀釋法稀釋為10-1、10-2后待用。菌落總數(shù)(個(gè)/平皿)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)1.4.6最低抑菌體積分?jǐn)?shù)用平板稀釋法測(cè)定蘆筍皮提取物的抑菌率,進(jìn)而確定最低抑菌體積分?jǐn)?shù)。取適量原液加入到無菌培養(yǎng)皿中,定量加入溫度約45℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15ml,使提取液的體積分?jǐn)?shù)分別為20%、15%、10%、5%、2.5%、1.25%,后用無菌吸管吸取0.1ml的菌懸液加入到上述平板培養(yǎng)基中并涂布均勻,經(jīng)37℃、24h恒溫培養(yǎng)后進(jìn)行觀察,以完全無菌生長(zhǎng)的最低體積分?jǐn)?shù)作為蘆筍皮提取液最低抑菌體積分?jǐn)?shù),以乙醇,無菌蒸餾水作對(duì)照。1.4.7最大抑菌時(shí)間測(cè)定向兩支無菌試管中分別加入9ml蘆筍皮水提取液和乙醇提取液及1ml菌懸液,振蕩使混合均勻充分,在560nm處定時(shí)測(cè)定其吸光度,以乙醇、無菌蒸餾水作對(duì)照,找出最大抑菌時(shí)間,同時(shí)以蒸餾水作空白對(duì)照。1.4.8最低抑菌體積分?jǐn)?shù)將蘆筍皮提取物經(jīng)121℃,15min熱處理后測(cè)定其抑菌活力,取經(jīng)高溫處理后的適量提取液加入到無菌培養(yǎng)皿中,定量加入溫度約45℃的培養(yǎng)基15ml,此時(shí)提取液的體積分?jǐn)?shù)為最低抑菌體積分?jǐn)?shù),并加入經(jīng)稀釋后的菌懸液0.1ml,涂布均勻后經(jīng)37℃、24h培養(yǎng)后進(jìn)行觀察,同時(shí)做一空白對(duì)照,最后計(jì)數(shù)并計(jì)算抑菌率。1.4.9成膜微生物培養(yǎng)平板用0.1mol/L檸檬酸和2.0%的NaOH溶液分別調(diào)整培養(yǎng)基pH為5、6、7、8、9,用平板菌落計(jì)數(shù)的方法,制成含一定濃度蘆筍皮提取物溶液的不同pH值環(huán)境的微生物培養(yǎng)平板。經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)24h后,觀察平板中菌落的生長(zhǎng)情況,菌落越少,說明其抑菌效果越好,同時(shí)做不加蘆筍皮提取液的平行實(shí)驗(yàn),計(jì)算出抑菌率。2結(jié)果與分析2.1通過提取蘆筍皮提取物的最小細(xì)菌體積比率和細(xì)菌率的測(cè)定結(jié)果2.1.1菌懸液濃度對(duì)最低抑菌體積分?jǐn)?shù)的測(cè)定沒有起到控制蘆筍皮提取液占整個(gè)培養(yǎng)基的體積分?jǐn)?shù)與它的抑菌率有重要關(guān)系,大多數(shù)的食品防腐劑在加入食品中時(shí),都要考慮其適宜添加量,添加量過高或過低其防腐效果都會(huì)受到影響。在此選擇幾個(gè)體積梯度,以期找到其提取液的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)的大致范圍,為以后精確測(cè)定抑菌成分并制定適宜添加量做準(zhǔn)備。菌懸液的濃度對(duì)最低抑菌體積分?jǐn)?shù)的測(cè)定有很大影響,原因是菌懸液濃度過高,平板內(nèi)生長(zhǎng)的菌落數(shù)過多,給計(jì)數(shù)帶來很大困難,所以可以對(duì)菌懸液做10倍及100倍稀釋,然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),并計(jì)算抑菌率。如圖1所示,當(dāng)蘆筍皮水提取液的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%時(shí),抑菌率可達(dá)到94.3%,當(dāng)蘆筍皮水提取液的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到20%時(shí),幾乎所有菌的生長(zhǎng)都受到抑制,抑菌率達(dá)到99.9%,所以可初步估計(jì)蘆筍皮水提取液的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)為20%。2.1.2驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)1:乙醇提取液最低抑菌體積分?jǐn)?shù)采用與蘆筍皮水提取液最低抑菌體積分?jǐn)?shù)測(cè)定相同的體積分?jǐn)?shù)梯度和測(cè)定方法。結(jié)果如圖2所示。當(dāng)菌懸液為原液時(shí),10%的乙醇提取液就可以完全抑制菌落的生長(zhǎng),當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí),也只有十幾個(gè)菌落生長(zhǎng),將菌懸液稀釋10倍、100倍后計(jì)數(shù),并計(jì)算出抑菌率,當(dāng)蘆筍皮乙醇提取液體積分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí),就可抑制97.2%的細(xì)菌生長(zhǎng),而當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到5%時(shí),幾乎沒有菌生長(zhǎng),所以可初步估計(jì)蘆筍皮乙醇提取液的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)為5%。由圖1和2可見,蘆筍皮的乙醇提取液與水提取液的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)分別為5%和20%,且當(dāng)提取液取為相同體積分?jǐn)?shù)時(shí),醇提液比水提液有更高的抑菌活性。這可能是由于蘆筍皮抗菌性功能成分在乙醇中比在水中有更高的溶解度,進(jìn)而可以推測(cè)其發(fā)揮抗菌功能的并不是單一組分,而是幾種或幾類抗菌因子的混合物。2.2采用分光光度法測(cè)定了抗菌性與抗菌活性以及作用時(shí)間之間的關(guān)系2.2.1不同作用時(shí)間文蘆筍皮提取液在560nm處的吸光度隨提取液與細(xì)菌作用時(shí)間的延長(zhǎng)而變化,主要是由于溶液中所含有的菌體數(shù)量越大,溶液的渾濁度越高,故而吸光度也大,剛開始加入菌體的提取液,其中菌體數(shù)目最大,所以剛開始時(shí)吸光度最大,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),蘆筍皮提取液殺滅加入其中的細(xì)菌,菌體解體,致使吸光度下降,達(dá)到一個(gè)最低值后,提取液對(duì)細(xì)菌的這種抑制作用逐漸削弱,吸光度又開始緩慢上升。蘆筍皮水提液吸光度隨時(shí)間的變化如圖3所示。經(jīng)過12、24、36h,其吸光度由最初的1.100,變?yōu)?.027、1.035、1.124,其對(duì)照組蒸餾水的吸光度依次為0.009、0.014、0.017、0.021,呈逐漸上升趨勢(shì)?？梢钥闯?蘆筍皮水提取液對(duì)細(xì)菌有一定抑制作用,但作用比較緩慢,并沒有出現(xiàn)大的轉(zhuǎn)折點(diǎn),在12h達(dá)到最大抑制作用,而后趨于平緩,到24h后這種抑制作用慢慢減弱,此時(shí)蘆筍皮水提取物有可能作為細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來源,供細(xì)菌生長(zhǎng)。2.2.2乙醇對(duì)黃秋葵的脫菌作用蘆筍皮乙醇提取液在560nm處的吸光度隨時(shí)間的變化如圖4所示。其吸光度由最初的0.260,經(jīng)過12、24、36h后變?yōu)?.250、0.195、0.228;其對(duì)照組90%乙醇溶液的吸光值依次為0.008、0.006、0.014、0.020。可以看出:蘆筍皮的醇提取液的抑菌作用一開始緩慢增強(qiáng),在24h達(dá)到最高,而后有逐漸降低趨勢(shì),對(duì)照乙醇溶液的抑菌作用,可知乙醇對(duì)菌本身有一定抑制作用,但作用很小,同蘆筍皮乙醇水提液比較起來,其作用可忽略,這進(jìn)一步證實(shí)蘆筍皮內(nèi)確實(shí)含有抗菌因子。綜上所述,蘆筍皮的醇提取液和水提取液都有抗菌作用,但乙醇提取液的抗菌作用明顯強(qiáng)于水提取液,并且可推測(cè)其抗菌作用主要體現(xiàn)在延長(zhǎng)菌體生長(zhǎng)延滯期,抑制細(xì)菌孢子的萌發(fā),減少了微生物在相同時(shí)間內(nèi)繁殖的代數(shù),從而抑制菌體的生長(zhǎng)。2.3ph對(duì)蘆黃皮提取物抑菌活性的影響當(dāng)蘆筍皮乙醇提取液的體積分?jǐn)?shù)為5%,水提取液的體積分?jǐn)?shù)為10%,菌懸液的稀釋度為100倍時(shí),測(cè)得的菌落總數(shù)及抑菌率隨pH的變化如圖5所示。結(jié)果表明,pH對(duì)醇提液和水提液的抑菌率有影響。當(dāng)培養(yǎng)基pH值為5、6時(shí),醇提液和水提液的抑菌率都達(dá)到了100%;當(dāng)pH值為時(shí)醇提液的抑菌率仍為100%,而水提液的抑菌率開始下降;當(dāng)pH8時(shí),醇提液和水提液的抑菌活性明顯減弱,達(dá)到一個(gè)最低點(diǎn),而后又漸漸回升;當(dāng)pH9時(shí),抑菌率又上升到90%以上。可見,蘆筍皮提取液的抑菌活性與pH值有很大關(guān)系,在酸性pH范圍內(nèi),蘆筍皮提取液的抑菌活性隨pH降低而加強(qiáng),而在弱堿性pH條件下,抑菌率明顯降低。而當(dāng)pH上升到一定值后,抑菌率又有所上升,這可能是由于強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性環(huán)境本身抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)。2.4高溫處理對(duì)蘆薈皮提取物抑菌活性的影響經(jīng)高溫處理后的蘆筍皮用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得其菌落數(shù)如表1所示,其中蘆筍皮水提取液的體積分?jǐn)?shù)為10%,蘆筍皮乙醇提取液的體積分?jǐn)?shù)為5%。對(duì)照?qǐng)D1和圖2可以看出,蘆筍皮水提取液經(jīng)高溫高壓處理后,抑菌率由原來的94.3%降低到62.5%,蘆筍皮乙醇提取液經(jīng)高溫高壓處理后,抑菌率由原來的100%下降到90%,說明蘆筍皮水提取物耐高溫能力不強(qiáng),而醇提物則有很好的耐高溫能力,經(jīng)高溫處理后,仍具有良好的抑菌作用,但抑菌活性有一定程度的下降。這可能是由于蘆筍皮乙醇提取物中發(fā)揮抗菌功能的因子數(shù)量遠(yuǎn)大于蘆筍皮水提取物,并且這些抗菌因子的耐熱性較強(qiáng),所以對(duì)于一些需經(jīng)高溫高壓處理的食品來說,蘆筍皮醇提取物這種良好的耐熱性與其保存性至關(guān)重要。3h、2h、乙醇提取液和水浴加熱浸提液最佳劑量的確定蘆筍皮的水提物及乙醇提取物中均含