大連地區(qū)分離的micromonosporaauraniaca小單胞菌

大連地區(qū)分離的micromonosporaauraniaca小單胞菌

放線菌是多種生理活性物質(zhì)的生產(chǎn)菌。這些活性物質(zhì)的生產(chǎn)具有許多用途，用于醫(yī)藥和植物園。它被廣泛用于抗細(xì)菌、抗真菌和腫瘤藥物?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的數(shù)萬種微生物來源的生物活性物質(zhì)中,約有70%是由放線菌所合成的。隨著從土壤放線菌中發(fā)現(xiàn)新的天然活性物質(zhì)的減少,和抗藥性等問題的加劇,海洋微生物資源(放線菌)成為發(fā)現(xiàn)新藥的新來源。近年來,海洋放線菌的多樣性研究取得了很大的進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)了很多海洋特有的放線菌種屬,也鑒定了很多海洋放線菌生產(chǎn)的獨(dú)特的代謝產(chǎn)物。這些研究極大地促進(jìn)了海洋放線菌的應(yīng)用,也加深了對(duì)海洋環(huán)境中放線菌的分布及特征的認(rèn)識(shí)。大連市具有綿長(zhǎng)的海岸線,總長(zhǎng)度占遼寧省海岸線總長(zhǎng)度的73%,蘊(yùn)藏著豐富的海洋放線菌資源。但是,對(duì)于大連地區(qū)的海洋放線菌資源的研究還非常不充分,近期的工作主要集中在海洋動(dòng)植物,主要是海綿共附生放線菌的研究,對(duì)海泥樣品的研究還非常不足,只有王書錦等對(duì)大連黑石礁地區(qū)和凌水橋地區(qū)的海洋放線菌的調(diào)查和初步的活性研究報(bào)告。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)大連長(zhǎng)?？h、星海灣、小平島等多處海域的海泥樣品進(jìn)行了海洋放線菌的分離,于海泥樣品中分離了239株海洋放線菌,本文對(duì)其中的2株海洋小單胞菌進(jìn)行了研究,為進(jìn)一步開發(fā)利用大連地區(qū)的海洋放線菌資源奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1樣品的采集星海灣地區(qū)和小平島地區(qū)的樣品采自海面下10～30m處的海泥,長(zhǎng)?？h的海泥樣品采集自退潮后離岸200m處5～10cm深的海灘。1.2菌株鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹1.2.1海洋放線菌的分離海泥樣品采集后于低溫保存并立即送實(shí)驗(yàn)室分離,樣品預(yù)處理采用分散與差速離心法。分離培養(yǎng)基M1-M12采用文獻(xiàn)推薦的培養(yǎng)基配方,結(jié)合另外3種培養(yǎng)基:HV、SC和MarineAgar,共15種培養(yǎng)基用于海洋放線菌的分離。所有的培養(yǎng)基均以天然海水配制。1.2.2抗菌活性實(shí)驗(yàn)供試菌株Staphylococcusaureus(1.89),Escherichiacoli(1.797),Pseudomonasaeruginosa(1.2031),Candidaalbican(2.538)及Aspergilusniger(3.2915)購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(括號(hào)內(nèi)為菌種編號(hào)),Bacillussubtilis由韓國(guó)明知大學(xué)徐胄源教授贈(zèng)送。按照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行抗菌活性鑒定,測(cè)量抑菌圈的大小。1.2.316SrDNA的PCR擴(kuò)增和序列分析基因組DNA的提取按照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行,采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16SrDNA全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物測(cè)序委托大連寶生物公司進(jìn)行,所得到的序列利用Blast程序進(jìn)行相似性比較。采用MEGA3.1軟件,用Neighbor-Joining法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。1.2.4形態(tài)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng)特征和生理生化特征根據(jù)放線菌分類和鑒定手冊(cè)進(jìn)行。1.2.5耐鹽性實(shí)驗(yàn)和低溫生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)2株小單胞菌于28℃液體TSB培養(yǎng)基中,150r/min搖床振蕩培養(yǎng)3d后,取20μL接種固體培養(yǎng)基進(jìn)行耐鹽性和低溫生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。耐鹽性實(shí)驗(yàn)中菌株接種于添加終濃度(質(zhì)量與體積百分比)為0、3、6、9、12的NaCl的Bennett固體培養(yǎng)基上,于28℃培養(yǎng)1周,觀察生長(zhǎng)狀況。低溫生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)于20℃進(jìn)行,觀察在Bennett固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)。1.2.62株海洋小單胞菌的16SrDNA序列已登陸GenBank,序列號(hào):S017(EU124501)、S186(EF577246)。2結(jié)果2.12材料和培養(yǎng)基從大連地區(qū)海泥樣品中共分離放線菌239株,其中海洋小單胞菌只得到2株,其中S017分離來自長(zhǎng)海縣海泥樣品,S186來自星海灣地區(qū)海泥樣品。S017和S186分別分離自SC培養(yǎng)基和M5培養(yǎng)基。值得指出的是,在M5培養(yǎng)基中明顯可見小單胞菌得到優(yōu)勢(shì)分離,其他菌株幾乎沒有生長(zhǎng),而M5培養(yǎng)基的成分只有瓊脂和海水,由此顯示了小單胞菌對(duì)寡營(yíng)養(yǎng)條件的偏好。其他各種培養(yǎng)基中均未分離到小單胞菌,而分離的絕大部分菌株為鏈霉菌,說明了海洋小單胞菌資源在大連地區(qū)的海泥中比較有限。2.2菌株抗菌活性的比較對(duì)所有分離的239株放線菌均進(jìn)行了瓊脂塊擴(kuò)散法抗菌活性測(cè)試。結(jié)果表明,這2株小單胞菌對(duì)6種測(cè)試菌都具有較好的抗菌活性,尤其是對(duì)銅綠假單孢菌和白色假絲酵母具有較好的拮抗活性(表1),與抗菌活性較好的鏈霉菌抑菌圈大小相當(dāng)。2.3小單胞菌的生理生化特性2株小單胞菌在Bennett保存培養(yǎng)基上的色素產(chǎn)生存在明顯差異,S017的氣生菌絲為暗桔紅色,S186的為粉桔紅色(圖1),并且經(jīng)過傳代以后仍比較穩(wěn)定。由于2株菌的抗菌活性也有所差別,本文進(jìn)一步進(jìn)行了培養(yǎng)特征和生理生化特性的研究。由表2可見,2株小單胞菌除在ISP4和ISP5上生長(zhǎng)類似外,在其他5種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)均不相同(表2)。對(duì)2株小單胞菌的生理生化實(shí)驗(yàn)研究表明,小單胞菌S017能水解淀粉,不能使牛奶凝固,而S186反之(表3)。此外,二者對(duì)木糖、山梨醇和棉籽糖的代謝也存在明顯差別:S017能很好地代謝木糖和山梨醇,但是不能代謝棉子糖,而S186正好相反(表3)。在低溫生長(zhǎng)和耐鹽性方面未見明顯差別。2株菌在20℃均正常生長(zhǎng),此外,在0～3%NaCl中均正常生長(zhǎng),最高均能耐受6%的NaCl(表3),顯示了對(duì)低溫和鹽度等海洋環(huán)境的適應(yīng)性。2.42菌株同源性分析結(jié)果對(duì)2株小單胞菌的16SrDNA序列利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,成功得到了近全長(zhǎng)的序列。利用Blastn與已知的序列進(jìn)行同源性分析結(jié)果表明,2株小單胞菌均與MicromonosporaaurantiacaDSM43813具有99%的相似性,在分類學(xué)上為同一菌種。選擇GenBank中同源性為97%～99%的DSM模式菌種,用N-J法建立系統(tǒng)發(fā)育樹,可見2株小單胞菌與M.aurantiaca共存在于同一個(gè)亞進(jìn)化分支(圖2)。3放線菌與小單胞菌的分離和活性我國(guó)學(xué)者在對(duì)與大連地區(qū)的海綿、海參、裙帶菜等海洋動(dòng)植物共附生的放線菌進(jìn)行研究時(shí),都發(fā)現(xiàn)了海洋小單胞菌的存在。王書錦等對(duì)大連黑石礁地區(qū)和凌水橋地區(qū)的海泥樣品進(jìn)行分離時(shí)也報(bào)道了海洋小單胞菌的分離,但是以上研究都未對(duì)所分離的小單胞菌進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)特征和16SrDNA序列研究。本文對(duì)從大連地區(qū)海泥樣品進(jìn)行海洋放線菌的分離研究表明,小單胞菌分離出來的數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于鏈霉菌,這可能與分離條件有關(guān),如樣品處理、培養(yǎng)基等,也可能因?yàn)樾伟皇呛Ｄ鄻悠分械膬?yōu)勢(shì)菌。2株放線菌均與M.aurantiaca有99%的同源性,但分離自大連市不同的地區(qū)。根據(jù)GenBank中的16SrDNA信息,同源性為99%的菌株于大連地區(qū)的海綿中也曾得到分離,在我國(guó)海口的紅樹林樣品中也有分離(洪葵等,未發(fā)表資料)。此外,在巴哈馬群島的海泥樣品和英國(guó)的海泥樣品中也曾有分離報(bào)道,顯示了這個(gè)種在地理分布上具有一定的廣泛性。本文的研究是具有抗菌活性的M.aurantiaca菌株首次在大連地區(qū)海泥樣品中得到分離。2株小單胞菌在培養(yǎng)特征和生理生化特性上存在明顯差別,顯示了種內(nèi)生理和代謝的多樣性。有關(guān)小單胞菌M.aurantiaca的生理活性,曾報(bào)道菌株W2b具有降解橡膠及其關(guān)聯(lián)多聚物的活性,另外菌株L5也報(bào)道過具有固氮的功能。不同菌株的生理活性可能有所不同。進(jìn)一步深入研究本文所分離的小單胞菌是否具有類似的活性,以及是否具有降解污染物等其他活性具有重要的意義。與本實(shí)驗(yàn)室從海泥樣品中分離的鏈霉菌菌株相比,本文所分離的2株小單胞菌抗菌活性較強(qiáng),尤其是S186對(duì)銅綠假單胞菌和白色假絲酵母的活性,在所有放線菌中屬于較強(qiáng)的水平。值得注意