DB13-T 5688-2023 蜜蜂微孢子蟲病綠色防治技術(shù)規(guī)程

65.020CCS

B

1613 DB13/T

5688—2023蜜蜂微孢子蟲病綠色防治技術(shù)規(guī)程 河北省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB13/T

5688—2023 本文件按照GB/T

1.1—《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1定起草。本文件由河北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件起草單位：石家莊贊皇縣蕊源蜂業(yè)有限公司、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所、石家莊市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本文件主要起草人：王強(qiáng)、王榮申、王岳森、魏月、王岳峰、孟君麗、許亞改、王占江、陳海軍、郭偉婷、張艷紅、杜義明、劉旭東、孫繼強(qiáng)、姚慧敏、謝峰、馬麗榮、路偉、張晨、賈二國、王聰敏。IIDB13/T

5688—20231 范圍本文件規(guī)定了蜜蜂微孢子蟲病綠色防治的術(shù)語和定義、技術(shù)流程圖、診斷與鑒定、防控等技術(shù)要求。本文件適用于蜜蜂微孢子蟲病癥狀、形態(tài)及分子生物學(xué)診斷和綜合防治。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用適用于本文件。GB/T

19168

蜜蜂病蟲害綜合防治規(guī)范SN/T

1683

蜜蜂微孢子蟲病診斷方法OIE

陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1蜜蜂微孢子蟲是一種侵染成年蜜蜂中腸上皮細(xì)胞引起蜜蜂發(fā)病的致病性真菌，包括蜜蜂微孢子蟲和東方蜜蜂微孢子蟲2個(gè)種。3.2消毒指為殺滅包括蜜蜂疫病病原體或寄生蟲而采取的一種措施，適用于可能被直接或間接污染的場(chǎng)所、工具及各種物體。[來源：OIE

陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典，有修改]。3.3監(jiān)測(cè)指系統(tǒng)而持續(xù)地收集、整理和分析與蜜蜂微孢子蟲病有關(guān)的信息，并及時(shí)向相關(guān)人士傳遞信息以便采取相應(yīng)的措施。[來源：OIE

陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典，有修改]。4 蜜蜂微孢子蟲病綠色防治技術(shù)蜜蜂微孢子蟲病綠色防治技術(shù)流程圖(1)：DB13/T

5688—2023圖1 蜜蜂微孢子蟲病綠色防治技術(shù)流程圖5 診斷與鑒定5.1診斷流程當(dāng)觀察到蜂群出現(xiàn)典型癥狀時(shí)，應(yīng)遵循先通過個(gè)體癥狀觀察初步確診，再取樣后通過顯微鏡鑒PCR鑒定方法。5.2 癥狀5.2.1 蜂群癥狀5.2.1.1急性重癥感染當(dāng)蜂群感染處于后期重癥階段時(shí)有如下癥狀：a)

0.5

cm

變稀、顏色變深現(xiàn)象；b)

蜂群表現(xiàn)：在蜂巢入口處及養(yǎng)蜂場(chǎng)地面，會(huì)見到患病爬行的和死去的蜜蜂，且蜂群群勢(shì)急速下降。5.2.1.2 輕度感染CTAB0.03

Tris0.05

EDTA0.01

NaCl1.1

ddH2OpH8.0DB13/T

5688—2023除了部分成年蜜蜂在蜂箱外爬行外，沒有其他異常表現(xiàn)。5.2.2 蜜蜂個(gè)體癥狀蜜蜂個(gè)體感染病原后可通過如下癥狀進(jìn)行初步判斷。a)

病蜂活動(dòng)狀況，患病蜜蜂表現(xiàn)出行動(dòng)遲滯，腹部膨大，飛翔無力等癥狀；b)

用鑷子從具有典型癥狀的蜜蜂腹部末端夾出中腸及后腸仔細(xì)觀察，健康蜜蜂中腸呈棕色，環(huán)紋明顯，并且具有彈性和光澤。如觀察到蜜蜂中腸膨大，呈乳白色，環(huán)紋不清，失去彈性和光澤，可初步確定為蜜蜂微孢子蟲病。5.3 實(shí)驗(yàn)室鑒定5.3.1 顯微鏡鑒定5.3.1.1 樣品處理將采集的蜜蜂樣本，分離腹部置于研缽中，加入5

～10

mL蒸餾水研磨。取研磨的組織涂片，在明場(chǎng)或相差光學(xué)顯微鏡下以～倍進(jìn)行檢查。5.3.1.2鑒定5.3.1.2.1初診如在視野中見到長約5

μm～7

μm3

μm～4

μm診。5.3.1.2.2 鑒別按SN/T

1683相關(guān)方法與酵母、真菌孢子、脂肪體或馬氏管變形蟲囊包進(jìn)行鑒別。5.3.2 PCR

5.3.2.1 DNA

提取緩沖液配方見表1：表1表1

提取緩沖液配方a)

1

離心管中并勻漿；b)

離心管中加入

μL

4

μL

20

mg/mL

的蛋白酶

K

溶液，置于

℃水浴

3

hc)

加入等體積（

μL）的苯酚:氯仿為

1

:

1

的混合液并輕輕混勻，13000

rpm

離心

mind)

將上清液移至另一個(gè)新管中，沉淀物重復(fù)用苯酚:氯仿為

1

:

1

的混合液混勻并離心

1

次，合并

2

次的上清液；e)

加入預(yù)冷的

600

μL

的乙醇后加入

30

μL

3mol/L

的

NaOAc，輕輕混勻，置于-20℃下過夜；f)

10000

rpm

離心

15

，移去上清液，沉淀用

1

的乙醇洗滌兩次g)

烘干

后加入

30

μL

ddH2O，置于

65

℃水浴

min，輕輕溶解混勻管中的沉淀物；h)

10000

rpm

離心

10s

以除去未溶解的物質(zhì)，即得蜜蜂中腸組織的

；i)

提取的

DNA

溶液置于-20

℃保存，備用。DB13/T

5688—2023標(biāo)引序號(hào)說明:A—中腸；B—小腸；C—后腸；D—蟄針。圖2

蜜蜂中腸取樣部位5.3.2.2 PCR

將前步所提取的DNA樣品稀釋5倍進(jìn)行A（表、）。將

μLPCR反應(yīng)體系準(zhǔn)確吸取至板孔中，設(shè)定反應(yīng)程序?yàn)椋篴)

94

℃

2.5

；b)

94

℃

15

s，61.8

℃

30

s，72

℃

45

s

36

個(gè)循環(huán)；c)

72

℃延伸

7

min；5.3.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的分離與鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，GoldView5.3.2.4 診斷結(jié)果與辨別通過以下凝膠中電泳條帶的位置可最終判別蜜蜂是否感染微孢子蟲病原及種類：a)

只有當(dāng)凝膠中

位置有明顯條帶時(shí)結(jié)果可信；b)

當(dāng)凝膠中在

218

bp

位置有明顯條帶時(shí)即可認(rèn)為樣品中含有東方蜜蜂微孢子蟲；c)

當(dāng)凝膠中在

321

bp

位置有明顯條帶時(shí)即可判定樣品中含有蜜蜂微孢子蟲。5.4 取樣5.4.1 取樣數(shù)量為保證所采集的樣品具有代表性，應(yīng)按以下標(biāo)準(zhǔn)確定樣品數(shù)量。a)

蜂群數(shù)量

群（含）以下的養(yǎng)蜂場(chǎng)選取

1

群取樣，每群取樣約

20～30

b)

蜂群數(shù)量

3

群取樣，每群取樣約

～

5.4.2 取樣方法不同的取樣目的應(yīng)分別遵循如下方法采集樣品。a)

非定量診斷時(shí)，直接從蜂巢入口附近選取具有典型癥狀的成年蜜蜂；b)

定量調(diào)查蜂群受感染程度時(shí)，隨機(jī)選取蜂群并隨機(jī)提取群內(nèi)

1

張巢脾，隨機(jī)抓取脾上的成年蜜蜂。5.4.3 樣品保存常溫、干燥保存于紙盒內(nèi)。6 防控6.1 養(yǎng)蜂場(chǎng)場(chǎng)址選擇養(yǎng)蜂場(chǎng)場(chǎng)址按GB/T

19168

3.1蜂場(chǎng)場(chǎng)址的選擇給出的要求進(jìn)行選擇。DB13/T

5688—20236.2 飼養(yǎng)管理6.2.1 飼料6.2.1.1 春繁飼料春繁期飼喂蜂蜜花粉時(shí)，不使用來歷不明的花粉，飼喂前應(yīng)對(duì)花粉進(jìn)行不少于20

的蒸汽消毒。6.2.1.2越冬飼料a)

飼喂越冬飼料前應(yīng)對(duì)飼料進(jìn)行顯微鏡檢查，如巢脾中的蜂蜜或花粉中發(fā)現(xiàn)有微孢子蟲則應(yīng)對(duì)巢脾及飼料進(jìn)行消毒；b)

補(bǔ)飼選擇蜂蜜或白糖，白糖需要高溫溶解；c)

越冬飼料的儲(chǔ)備量，視群勢(shì)強(qiáng)弱與越冬期長短貯備蜜脾。6.2.2 預(yù)防消毒a)

2%～3%氫氧化鈉溶液浸泡

后清水清洗晾干再使用。蜂箱消毒可用火焰噴燈灼燒至微變色；b)

巢脾、蜂箱：長期保存的巢脾應(yīng)置于空蜂箱中，蜂箱應(yīng)整齊疊放并將所有縫隙密封，然后將盛有

50

4%冰醋酸的容器放入蜂箱進(jìn)行熏蒸消毒；c)

病死蜂：隨時(shí)收集養(yǎng)蜂場(chǎng)地面的病蜂及死亡蜂，集中焚燒或深埋，并在養(yǎng)蜂場(chǎng)地面撒生石灰消毒。6.3 監(jiān)測(cè)每年從去除越冬包裝開始，直至下次越冬包裝前，應(yīng)至少每3個(gè)月對(duì)蜂群進(jìn)行1次蜜蜂微孢子蟲病的病原監(jiān)測(cè)，定量調(diào)查蜂群受感染程度。根據(jù)上兩個(gè)年度的監(jiān)測(cè)記錄及當(dāng)前監(jiān)測(cè)結(jié)果隨時(shí)調(diào)整本年度的防控措施。6.4 防治6.4.1 預(yù)防1

g食品級(jí)檸檬酸粉劑加入1000

g7

d加。6.4.2 治療當(dāng)蜂群出現(xiàn)大量因排泄不暢的爬蜂時(shí)，取4

g大黃蘇打片，溶于1000

mL濃度為1:1的蔗糖水中，噴脾，每張脾

mL。大流蜜期內(nèi)及之前1個(gè)月內(nèi)不得使用。劑量（μL）5×PCR

buffer10

One

0.2

dNTPs0.510

mM

ddH23.3對(duì)引物的正負(fù)引物各1

：反應(yīng)體系15

Forward

Reverse

bpNosema

Ceranae