轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理與方法

2023/11/24Copyright?Jiangyong轉(zhuǎn)基因西紅柿請(qǐng)您欣賞1.2023/11/24Copyright?Jiangyong抗蟲害作物2.2023/11/24Copyright?Jiangyong3.4.2023/11/24Copyright?Jiangyong番木瓜優(yōu)良抗病品種5.2023/11/24Copyright?Jiangyong金大米6.2023/11/24Copyright?Jiangyong地雷探測(cè)草擬南芥7.2023/11/24Copyright?Jiangyong不會(huì)引起過敏的大豆8.2023/11/24Copyright?Jiangyong轉(zhuǎn)基因芥菜可減輕土壤污染9.2023/11/24Copyright?Jiangyong彩色玉米10.2023/11/24Copyright?Jiangyong巨型鮭魚11.2023/11/24Copyright?Jiangyong熒光魚12.2023/11/24Copyright?Jiangyong超級(jí)奶牛13.2023/11/24Copyright?Jiangyong培育出人耳的小鼠14.2023/11/24Copyright?Jiangyong轉(zhuǎn)基因豬15.2023/11/24Copyright?Jiangyong16.17.轉(zhuǎn)基因熊貓狗18.轉(zhuǎn)基因技術(shù)王海玲2021.10.2419.簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)的中心環(huán)節(jié)即為DNA重組技術(shù)，其最終目的是將DNA片段轉(zhuǎn)入為一個(gè)生物體，從而使該生物體具有表現(xiàn)某種性狀。轉(zhuǎn)基因通過獲取基因、重組基因和表達(dá)基因等過程來實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因打破了物種的界限，使不同種的生物的遺傳物質(zhì)在分子水平上重新組合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體的改造。20.轉(zhuǎn)基因的方法和原理目的基因制備和載體系統(tǒng)幾種有效的轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)基因生物的篩選與鑒定21.根本步驟1.別離獲得目的基因；2.在體外進(jìn)行DNA重組，將外源DNA連接到能自我復(fù)制又帶有選擇標(biāo)記的載體上；3.將重組DNA轉(zhuǎn)移入受體細(xì)胞；4.篩選出含有目的DNA的受體細(xì)胞克??；22.1、目的基因制備和載體系統(tǒng)目的基因來源：基因組DNA別離、化學(xué)合成、PCR擴(kuò)增、cDNA文庫及DNA文庫中制得。載體：質(zhì)粒、λ噬菌體、柯氏質(zhì)粒、YAC載體等工具酶：限制性內(nèi)切酶、連接酶、DNA聚合酶等23.1.目的基因的別離〔1〕基因的獲得①化學(xué)合成法②PCR擴(kuò)增〔2〕未知基因的獲得①構(gòu)建基因組文庫，篩選目的基因②構(gòu)建cDNA文庫，篩選目的基因③mRNA差異顯示技術(shù)篩選差異表達(dá)基因④差異蛋白質(zhì)譜表達(dá)技術(shù)篩選功能基因……24.

2.良好載體需要滿足的條件

1、必須有自身的復(fù)制子；2、載體分子上必須有限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)，以供外源DNA的插入；3、載體應(yīng)具有可供選擇的遺傳標(biāo)志，以區(qū)別陽性重組子和陰性重組子；4、載體分子必須有足夠的容量；5、可通過特定的方法導(dǎo)入細(xì)胞；6、對(duì)于表達(dá)載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)順序、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等DNA調(diào)控元件。25.質(zhì)粒載體質(zhì)粒〔plasmid〕是能自我復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們?cè)诩?xì)菌中以獨(dú)立于染色體外的方式存在。每個(gè)質(zhì)粒都有一段DNA復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，它能幫助質(zhì)粒DNA在宿主細(xì)胞中復(fù)制。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞中能達(dá)10～100個(gè)拷貝；低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞中只有1－4個(gè)拷貝。質(zhì)粒要成為克隆載體，就必須進(jìn)行遺傳改造，使之成為一個(gè)具有單一的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)、多個(gè)選擇性標(biāo)記。26.質(zhì)粒載體pBR3221.大小為4361bp，含有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素這樣兩個(gè)抗生素抗性基因2.在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，還具有BamHI、HindⅢ和SalI三個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。3.PstI識(shí)別位點(diǎn)在氨芐青霉素抗性基因4.pBR322帶有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒只在大腸桿菌里進(jìn)行復(fù)制功能。27.pUC19質(zhì)粒長(zhǎng)2686bp，帶有pBR322的復(fù)制起始位點(diǎn)，一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)大腸桿菌乳糖操縱子β－半乳糖苷酶基因〔lacZ’〕的調(diào)節(jié)片段，一個(gè)調(diào)節(jié)lacZ’基因表達(dá)的阻礙蛋白的基因lacI，還有多個(gè)單克隆位點(diǎn)。pUC19的篩選將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布到含有氨芐青霉素、IPTG和X－gal的固體培養(yǎng)基上，那些帶有自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)胞由于能夠形成具活性的β－半乳糖苷酶，所以菌落是藍(lán)色，如果插入有目的DNA片段，無法形成雜合β－半乳糖苷酶，菌落時(shí)白色的。28.λ噬菌體λ噬菌體染色體是長(zhǎng)約49kb的雙鏈DNA，該DNA的兩個(gè)5’末端都是由12個(gè)bp組成的單鏈互補(bǔ)粘性末端，當(dāng)λ噬菌體DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，這兩個(gè)粘性末端互相結(jié)合，在連接酶作用下封閉成環(huán)在λ噬菌體基因組中位于左邊的基因〔A-J〕編碼噬菌體頭部和尾部的蛋白質(zhì)，中間的基因〔J-N〕與重組和生長(zhǎng)過程有關(guān)，但與裂解生長(zhǎng)過程無關(guān)，因此對(duì)裂解生長(zhǎng)過程來說，中間區(qū)的DNA是非必需的，可以被缺失或置換，因此可以在這個(gè)區(qū)域克隆外源DNA，右邊的基因涉及λ基因的表達(dá)、調(diào)節(jié)、DNA合成晚期功能調(diào)節(jié)以及宿主細(xì)胞裂解等。29.λ噬菌體載體分類：插入型載體和置換型載體。插入型載體：具有單一的酶切位點(diǎn)，可供外源DNA的插入。置換型載體：有成對(duì)的酶切位點(diǎn)，在兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的DNA片段，可被外源DNA片段置換。λ噬菌體載體可以克隆較大DNA片段，最大長(zhǎng)度約為24kb，只需將λ噬菌體DNA、尾巴和純化的空的頭，混在一起就可以在體外產(chǎn)生具有侵染性的噬菌體顆粒。30.柯氏質(zhì)粒Cosmid柯氏質(zhì)?？煽寺y帶40kb大小的DNA片段，并在大腸桿菌中復(fù)制保存，綜合了質(zhì)粒載體和噬菌體載體二者的優(yōu)點(diǎn)?？率腺|(zhì)粒上帶有多個(gè)單克隆位〔RE2〕，兩個(gè)cos位點(diǎn)，DNA復(fù)制起始位點(diǎn)和抗生素抗性基因，在兩個(gè)cos位點(diǎn)之間還有一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)〔RE1〕。31.2、遺傳轉(zhuǎn)化的方法1、應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的方法2、應(yīng)用于動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的方法32.

植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法〔1〕間接轉(zhuǎn)化法——農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法〔2〕直接轉(zhuǎn)化法A、基因槍轉(zhuǎn)化法B、電擊法C、花粉管通道法D、PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法33.農(nóng)桿菌:usedextensivelyforgeneticengineeringofplants.包含Ti質(zhì)粒

Tumorinducingplasmid(bacterialplasmid)T-DNA(Transferred-DNA),

可以轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物基因組.TumorinducedbyA.tumefaciens34.根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens),是一種革蘭氏陰性土壤桿菌,它含有Ti質(zhì)粒,能誘導(dǎo)被侵染的植物細(xì)胞形成腫瘤,即誘發(fā)冠癭瘤.Ti質(zhì)粒(包括Ri質(zhì)粒)上有一段轉(zhuǎn)移DNA,在農(nóng)桿菌侵染宿主植物時(shí),這段DNA可以轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞,并穩(wěn)定地保存在植物細(xì)胞染色體中,變?yōu)橹参锛?xì)胞新增加的一群基因,最終能通過有性世代遺傳給子代。35.TiPlasmidT-DNAregionLeftborderRightbordervirgenesori農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后，只留在細(xì)胞間隙中。T-DNA首先在細(xì)菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。auxin36.農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞相互作用的機(jī)制

返回37.基因槍轉(zhuǎn)化法由美國(guó)Cornell大學(xué)的Sanfor(1987)提出,它的主要原理是將包含目的基因的載體包被在微小的金屬微粒(鎢粒或金粒)外表,通過高壓驅(qū)動(dòng)力加速微粒穿透植物細(xì)胞壁,導(dǎo)入受體組織細(xì)胞內(nèi),然后通過組織培養(yǎng)再生出完整的植株.微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后,整合到染色體上并得到表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化.。返回38.電擊法的主要原理是將原生質(zhì)體在溶液中與DNA混合,然后利用高壓電脈沖作用,使原生質(zhì)體膜的某些部位被擊穿而產(chǎn)生可回復(fù)的小孔,外源DNA可通過小孔進(jìn)入原生質(zhì)體內(nèi),而且不影響經(jīng)電擊處理的原生質(zhì)體再生植物的能力.返回39.花粉管通道法是利用開花植物授粉后形成的花粉管通道,直接將外源目的基因?qū)肷胁痪邆湔＜?xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)化.返回40.PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鳥核苷酸(pLO)、磷酸鈣及高pH值條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子.PEG可促使細(xì)胞膜與DNA間接觸與粘連,并通過引起膜外表電荷的紊亂及干擾細(xì)胞間的識(shí)別,利于細(xì)胞膜間的融合以及外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體.返回41.動(dòng)物外源基因的導(dǎo)入方法

1〕顯微注射法〔microinjection〕

42.2〕逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法43.3〕胚胎干細(xì)胞法44.4〕精子載體法意大利Lavitrano等1989年首次報(bào)道利用精子作為載體獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。45.5〕細(xì)胞核移植法277次乳腺細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)；獲得29個(gè)發(fā)育為8細(xì)胞的“胚〞；13頭代孕母親；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名為“多莉〞。46.6〕生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染法47.基因轉(zhuǎn)移的方法1.細(xì)胞融合<10－62.微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移≤10－63.染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移<10－6

4.脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移≈2×10－4

5.磷酸鈣沉淀物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移10－3－10－7

6.顯微注射DNA≈1－10％7.電脈沖介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移10～30％8.激光，超聲波介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移10～50％9.重組RNA病毒感染≈10～100％10.重組DNA病毒感染≈100％48.3、轉(zhuǎn)基因苗的篩選與鑒定培養(yǎng)過程中利用標(biāo)記基因篩選標(biāo)記基因選擇標(biāo)記基因(Slectivegene)報(bào)告基因(Reportgene)抗生素類選擇基因抗除草劑類選擇基因生物平安性標(biāo)記類選擇基因……β-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus)熒光素酶基因(Luc)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Cat)綠色熒光蛋白基因(Gfp)……49.例Gus檢測(cè)原理：β－Ｄ－葡萄糖酸苷酶基因〔Gus〕，催化β－葡萄糖苷酯類物質(zhì)水解。其中很多水解產(chǎn)物具有發(fā)色團(tuán)或形成熒光物質(zhì)。例：組織化學(xué)法測(cè)定Gus活性作用底物為X-gluc,產(chǎn)物是一種不可溶的5,5-二溴，4,4-二氯靛