細胞培養(yǎng)基的生產和過程控制及細胞膜的滲透性實驗報告

細胞培養(yǎng)基的生產和過程控制細胞培養(yǎng)基作為生物制品生產的重要原材料之一，其質量對生物制品有重要的影響。細胞培養(yǎng)基的生產工藝和細胞培養(yǎng)基的原材料選用、生產過程及檢驗過程中的質量控制對于細胞培養(yǎng)基的產品質量具有直接影響。其中原材料的成份及其質量直接決定了細胞培養(yǎng)基產品的質量及安全性，選擇合適的物料是實現(xiàn)細胞培養(yǎng)基功能過程中需要解決的基礎問題。生產工藝的選擇（如原料的研碎、混合技術等）及生產過程中的質量控制等直接影響產品的溶解性、批生產量及批次間差異，進而影響產品的質量。cGMP稽查員在對國內細胞培養(yǎng)基生產企業(yè)進行cGMP審計時指出，細胞培養(yǎng)基的生產工藝及設備應經過驗證，原材料必須做鑒別試驗，記錄應真實反映生產過程的實際情況，生產過程偏差處理應包括對出現(xiàn)偏差之前涉及到的批次均應進行調查等等。這些要求是基于FDA對生物制藥用原料的質量要求方面提出，遠遠高于國內對藥用原料的要求。隨著對人用和動物保健用生物制品安全性要求的提高，嚴格執(zhí)行GMP規(guī)范進行細胞培養(yǎng)基生產是國內細胞培養(yǎng)基行業(yè)發(fā)展的必然趨勢。1.1細胞培養(yǎng)基的原料選擇及質量控制1.1.2原材料的原料選擇由于動物細胞培養(yǎng)基產品屬于藥用原料，《哺乳類動物細胞培養(yǎng)基行業(yè)標準》對細胞培養(yǎng)基產品的微生物限度、內毒素含量進行了限定，所以細胞培養(yǎng)基所用原料宜采用注射級、藥用級原料。對于部份沒有注射級和藥用級的原料，細胞培養(yǎng)基制造者針對自身產品質量要求，制定一些重要指標（微生物限度、內毒素、重金屬等）進行原材料的質量控制。1.1.2原材料的質量控制細胞培養(yǎng)基生產企業(yè)建立完善的原材料質量標準，對于原材料的來源、檢驗、使用、及銷毀等有明確的可追溯記錄。在質量控制過程中，藥用級原材料的質量標準應參考中國藥典相關標準，對于非藥用級原材料應根據(jù)生產工藝需要與供應商一起共同確定質量標準，質量標準應包括如下內容：指定的物料名稱和企業(yè)內部使用的物料代碼、藥典專論的名稱（如有）、經批準的供應商以及原始生產商、印刷包裝材料的樣張、物料質量標準依據(jù)及其編號、取樣、檢驗方法或相關規(guī)程編號、定性和定量的限度要求、貯存條件和注意事項、復驗前的最長貯存期。原材料的質量檢測主要從材料、人員、方法三個方面進行控制：具有必要的檢測試劑、設備和設施，如鱟試劑、分析天平、潔凈操作室或取樣柜。擁有相應操作資質和能力的檢驗人員，如相應檢測人員應具備化驗員資質并經過全面的技能培訓。選擇具有法律效力的檢測方法以及對應的操作規(guī)范，在檢測方法的選擇方面藥用原料應優(yōu)先采用藥典方法，非藥用原料應采用經過驗證有效的檢測方法，在確定檢測方法后應制定相應標準操作文件，用于規(guī)范試驗操作。應嚴格控制細胞培養(yǎng)基的原材料質量管理，并建立相應完善的原材料質量管理文件體系。原材料的質量管理方面，應明確規(guī)定責任范圍和流程方法，它們是保證原材料質量的基礎。原材料質量管理文件體系內容通常包括兩個方面，一方面是明確原材料質量責任應歸屬的部門及人員，以實現(xiàn)分工明確；另一方面是明確原材料的取樣、檢驗、放行、判定不合格、異常情況、偏差、驗證等事務具體流程，確保流程正確，方法無誤，為質量控制提供依據(jù)。1.2細胞培養(yǎng)基生產生產工藝傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)基生產工藝即生產過程通常分為物料配比、物料干燥、物料研碎、物料混合、物料包裝、成品的檢驗等6個階段，下面結合過程中的質量控制對此工藝進行介紹：1.2.1物料配比物料配比是根據(jù)配方要求將各種原料按比例配制的過程。配制需嚴格執(zhí)行配方，才能保證細胞培養(yǎng)基產品功能的實現(xiàn)及降低批間差，而實現(xiàn)低誤差的物料配比過程需從以下幾個方面進行控制：1)提供與生產工藝規(guī)程匹配且經過審核的、有效力的物料配方，生產部門根據(jù)配方制定配比操作記錄，經質量管理部門審核后，方可投入生產作業(yè)使用；2)具有詳細明確的經過驗證的設備、設施、工序操作規(guī)程以及相關管理規(guī)程，如通過編制設備、設施的驗證、使用、維護、維修操作規(guī)程來明確操作方法和流程，通過編制相應管理文件，來明確人員責任；3)具有足夠的在校驗有效期內的精確度合理的計量器具，及與產品質量要求相匹配的生產環(huán)境設施，如為降低細胞培養(yǎng)基微生物、內毒素限度使用潔凈廠房進行生產等；4)足夠的經過合理培訓具有上崗資質的操作人員和設備管理人員（操作員上崗證、計量員證），各崗位操作人員配備足夠，能夠確保操作過程實現(xiàn)雙人操作雙人復核；5)配備足夠的基層管理人員以及現(xiàn)場QA，起到指導和監(jiān)督作用。1.2.2物料干燥基于細胞培養(yǎng)基產品營養(yǎng)豐富，且不是無菌制劑的特性，為避免微生物滋生破壞細胞培養(yǎng)基成份，需控制細胞培養(yǎng)基中的水分含量，依據(jù)行業(yè)標準要求，其干燥減重質量分數(shù)應低于5.0%，而原料干燥是控制其含水量的最重要環(huán)節(jié)。目前常用的干燥方法有常壓干燥和冷凍干燥。常壓干燥包括烘干干燥、鼓式干燥、帶式干燥，由于國內細胞培養(yǎng)基生產廠家普遍采用球磨缸進行生產，由于各缸獨立，無法使用鼓式干燥、帶式干燥的方式進行連續(xù)烘干作業(yè)，所以普遍采用烘干干燥的方式按批進行物料干燥。冷凍干燥主要用于不能耐受高溫的貴細物料的干燥處理。1.2.3物料研磨細胞培養(yǎng)基顆粒越細，同質條件下比表面積越大，其溶解性越好，而其成品細度是由物料的研磨過程直接決定。對于物料的研磨，傳統(tǒng)普遍采用藥用球磨機，其主要優(yōu)點是結構簡單、操作方便、易于清潔及使物料混合作用（能夠實現(xiàn)缸體內各種成份的均勻分布）。球磨缸內的研磨球材質通常有陶瓷、瑪瑙、不銹鋼（304或316L）。但是球磨機也存在批量小、噪音大、難以控制溫度、粉狀物料不易取出且取料過程會產生大量粉塵等缺點。目前國內一些細胞培養(yǎng)基生產企業(yè)在球磨缸取料工序裝備了全密閉自動取粉裝置，較好的解決了粉塵污染問題，也進一步降低了由于物料的裸露可能帶來的引入異物及物料受潮的風險。1.2.4物料混合混合設備首先必須具備能夠實現(xiàn)物料均勻性的功能。在上述物料研磨過程中，可能存在投料微量誤差、過程參數(shù)細微差異以及其他不可控因素，上述因素的累積會導致不同研磨單元內物料可能出現(xiàn)一定的差異（外觀、理化性質、培養(yǎng)性能），這些差異將直接影響產品的使用，造成使用者生產效率及產品的批間差異。根據(jù)哺乳類細胞培養(yǎng)基行業(yè)標準中對于“批”的定義，即同一臺混合設備一次混合量所生產的均質產品為一批，物料經研磨單元研磨以后必須進行總混和均勻后才能稱為一批成品進行包裝。目前常用的物料混合設備以摻和機、雙錐混合機較為常見。1.2.5物料包裝物料的包裝分為內包裝和外包裝，主要為了實現(xiàn)如下功能：1)阻隔性功能：即密閉保存（避光、防潮、防污染、防氧化等），是指直接與產品接觸的內包裝，在選擇內包裝材料時其阻隔性是關鍵，高阻隔性包裝薄膜所采用的阻隔性樹脂主要有EVOH、PA、PET、PVDC、PC、MXD6和聚丙烯腈共聚物，其中PVDC是開發(fā)較早的阻隔性能優(yōu)異的材料，而包裝用薄膜材料結構包括：紙／塑料、塑料／鍍鋁塑料、紙／鋁箔／塑料和塑料／鋁箔／塑料等幾種【11】；2)產品信息的提供：產品外包裝上應明確標識品名、批號、代碼、生產日期、有效期、使用方法等基礎信息，并隨附企業(yè)質量監(jiān)管部門下發(fā)的產品合格證以及質量檢驗報告等質量證明文件；3)易于運輸?shù)姆雷o：確保外包裝物能夠抵御運輸過程中裝卸產生撞擊的沖擊，并要具備一定的堆疊強度，對于需要遠途運輸?shù)牟荒苣褪芨邷氐某善窇龊玫蜏乇Ｗo工作（填充保溫材料，包裝箱內混裝冰袋、干冰等蓄冷物）。1.2.6成品的檢驗細胞培養(yǎng)基產品生產完畢后，由質量檢測部門對該批次產品進行檢測，在這一周期內，成品處于待驗狀態(tài)，儲存條件應與合格成品一致，應專區(qū)存放專人管理，避免混淆和遺漏，在收到質量檢測部門檢測合格予以放行的通知后，轉交成品庫，移入合格品區(qū)備售。1.2.7細胞培養(yǎng)基生產的新工藝采用上述傳統(tǒng)的生產工藝（通常稱作球磨工藝）生產的產品均一性較好，物化性能穩(wěn)定以及細胞培養(yǎng)效果較好，但是存在批量小、研磨過程中的散熱難以控制、噪音及粉塵污染較大等缺點。2005年新開發(fā)了一種連續(xù)生產的針式研磨系統(tǒng)（pinmill），集“物料混合－針式研磨－研磨后混合”一體，用于工業(yè)化生產干粉細胞培養(yǎng)基，可以用來生產從10kg至4000kg不等批量的干粉細胞培養(yǎng)基。Pinmill研磨系統(tǒng)是一種高速沖擊研磨系統(tǒng)，包括一個進料口、兩個同軸帶有研磨針的轉盤以及一個出料口。當原料通過進料口投入研磨器后到達轉盤中央，在轉盤旋轉離心力的推動下往徑向外側運動同時被相互咬合且相對旋轉運動的研磨針研細。物料在進入針式研磨腔前和完成研磨離開研磨設備后都使用混合機進行了混合，以確保進入研磨器和最終產品的成份均勻性，其生產工藝流程見下圖4-1。與傳統(tǒng)的球磨生產工藝相比，pinmill生產系統(tǒng)研磨的顆粒更細，批次控制范圍大且靈活（0.5~4000kg），在研磨及研磨后顆粒輸送的過程中，采用氮氣控制機體的溫度，使研磨機的溫度保持在40℃以下，并且避免了粉塵污染、交叉污染等。該系統(tǒng)機體的拆分、組裝及清潔也較為簡單，適合cGMP生產。關于使用pinmill系統(tǒng)生產的DPM性能，如生產過程中的成份組成均質性、生產的產品性能及是否適合細胞培養(yǎng)和生物制品生產等，有詳細的驗證研究，結果顯示，pinmill生產工藝生產的產品均勻分布性滿足標準，并且均勻性與成份以及批量大小無關；生產的產品諸如溶解性、pH、滲透壓等理化性質、細胞培養(yǎng)方面及生物制品生產與球磨生產工藝相同2細胞培養(yǎng)基的質量標準和檢測方法2.1哺乳類動物細胞培養(yǎng)基行業(yè)標準介紹國內細胞培養(yǎng)基使用者一般采用經驗法或實驗法選擇培養(yǎng)基，但是這些經驗或是來自于以前的傳統(tǒng)方法、或是通過簡單的細胞培養(yǎng)實驗，因其影響因素較多，在判定的過程中，不同的使用者判定的標準也不相同，進而可能影響對產品的正確選擇。因此，采用統(tǒng)一的質量管理規(guī)范是控制產品質量的一個基本前提，2007年10月1日國家發(fā)展和改革委員會批準的《哺乳類動物細胞培養(yǎng)基》（HG/T3935-2007）國家化工行業(yè)標準正式實施，為國內動物細胞培養(yǎng)基產品質量及檢測方法提供了統(tǒng)一的標準，該標準對哺乳類動物細胞培養(yǎng)基的檢測項目和方法做出了明確的規(guī)定。2.2細胞培養(yǎng)基的檢測方法2.2.1澄清度檢查法該方法依據(jù)中國藥典2010版二部附錄IXB澄清度檢查法制定。澄清度是檢查藥品溶液的渾濁程度，即濁度，藥品溶液中如存在細微顆粒，當直射光通過溶液時，可產生光散射和光吸收的現(xiàn)象，致使溶液微顯渾濁，所以澄清度可在一定程度上反映藥品的質量和生產工藝水平。水是培養(yǎng)基的溶劑，細胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份只有完全溶解于水才能被細胞吸收攝取，細胞才能生長增殖，因此培養(yǎng)基是否溶解以及培養(yǎng)液是否透明澄清直接影響培養(yǎng)基使用。通過對水溶解后的培養(yǎng)基的澄清度檢查，判斷細胞培養(yǎng)基的溶解性。此法是用規(guī)定級號的濁度標準溶液與供試品溶液比較，以判定細胞培養(yǎng)液的澄清度或其渾濁程度。2.2.2pH值測定法各種細胞的正常功能及一切生物化學反應，都是在適當和穩(wěn)定的酸堿環(huán)境下進行的，因此細胞培養(yǎng)基的pH值是細胞生長的重要參數(shù)，pH值偏低或偏高都會影響細胞生長。該法依據(jù)中國藥典2010年版二部附錄ⅥHpH值的測定法進行。由于各酸度計的精度與操作方法有所不同，應嚴格按各儀器說明書與注意事項進行操作，并在使用之前注意校正。在工業(yè)化使用時，由于傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)基中含有pH指示劑如酚紅等，通常依據(jù)“眼睛”觀察培養(yǎng)液顏色來判定pH，或是簡單的使用pH試紙測定，但是上述方法存在較大的主觀因素，影響正確判定，并且在配制的過程中，不同區(qū)域還可能存在一定的水質區(qū)別等，采用pH儀器檢測可以消除人的主觀因素，準確性高。此外，在檢測過程中，添加碳酸氫鈉后的培養(yǎng)基在測定的過程中，暴露在空氣中的時間也會對所測pH的準確性有一定的影響。2.2.3干燥減量測定方法細胞培養(yǎng)基具有吸濕性，在空氣中放置時水份會很快升高，干燥減量表示產品中的含濕量。細胞培養(yǎng)基是有菌制劑，其豐富的營養(yǎng)成份有利于微生物生長，保持培養(yǎng)基中的低水份含量可以防止微生物的繁殖。檢測細胞培養(yǎng)基中水份的含量采用的方法是干燥減量法。該測定方法是依據(jù)中國藥典2010年版二部附錄ⅧL干燥失重測定法制定，具體是指產品在規(guī)定條件下干燥后所減失重量的百分率。減失的重量主要是水分、結晶水及其他揮發(fā)性物質等。由減失的重量和取樣量計算供試品的干燥失重。2.2.4滲透壓通常動物細胞必須生活在等滲環(huán)境中，借助K＋、Na＋維持滲透平衡。雖然大多數(shù)細胞對滲透壓具有有一定的耐受性，但是培養(yǎng)液滲透壓過高容易使細胞脫水萎縮，培養(yǎng)液滲透壓過低容易使細胞膨脹破裂，控制培養(yǎng)基的滲透壓范圍對于細胞培養(yǎng)具有重要的作用。檢測通常采用冰點滲透壓儀進行，當供試品溶液的毫滲透壓摩爾濃度太大或大于儀器的測定范圍時，用適宜的溶劑稀釋至可測定的毫滲透壓摩爾濃度范圍。2.2.5細菌內毒素檢測方法細菌內毒素是許多病原性細菌所產生的毒素。細胞培養(yǎng)基中細菌內毒素過高，對生物制品的質量如純度、引起副反應等方面有影響，而且會降低生物制品的產率。細菌內毒素檢查法通常利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。其檢查包括凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。通常當測的結果有爭議時，以凝膠法結果為準。2.2.6微生物限度細胞培養(yǎng)基不是無菌產品，其中的微生物在一定條件下會吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質滋生繁殖，導致培養(yǎng)基變質失效。控制細胞培養(yǎng)基中細菌和霉菌，是延長培養(yǎng)基有效期的方法之一，也是對生產企業(yè)的產品、原料、輔料、設備器具、工藝流程、生產環(huán)境和操作者的衛(wèi)生狀況進行衛(wèi)生學評價的綜合依據(jù)之一，對其的檢測是非常必要的。檢測方法依據(jù)中國藥典2010年版附錄ⅪJ微生物限度檢查法進行，檢查項目為細菌數(shù)、霉菌數(shù)。2.2.7細胞生長試驗細胞在體外進行培養(yǎng)時，失去了機體的調節(jié)和控制作用，因此，細胞培養(yǎng)液除滿足細胞的營養(yǎng)要求外，還必須使其生存環(huán)境接近活體的環(huán)境。其中培養(yǎng)液及外環(huán)境的培養(yǎng)條件如溫度、滲透壓、酸堿度等均能影響細胞的生長。細胞培養(yǎng)基的功能就是滿足細胞體外生長增殖需求，因此細胞培養(yǎng)效果的檢驗是產品質量優(yōu)劣的一個直觀表述，是必檢項目，這也是一個產品性能特性表述的要求。細胞培養(yǎng)檢測方法是：細胞在37℃恒溫條件下，在含體積分數(shù)為3%～10％小牛血清的細胞培養(yǎng)液中生長72h，觀察細胞形態(tài)并進行細胞計數(shù)；細胞生長72h后，更換不含小牛血清的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察細胞形態(tài)并進行細胞計數(shù)。培養(yǎng)過程中加血清培養(yǎng)主要檢測培養(yǎng)基的培養(yǎng)質量，不加血清培養(yǎng)主要檢測培養(yǎng)基的有無毒害物質。細胞生長實驗不但在使用一個新的產品時是必須進行的檢測項目，在更換不同批次時，為檢測是否有批間差也必須進行；此外，即使是同一個批次，分次購買時，或是存放擱置較長時間再次使用時，也需進行該項目檢測，以防止培養(yǎng)基在貯存、運輸過程中可能發(fā)生的質量變化。該行業(yè)標準中的檢測項目為生物制品廠家控制原材料質量提供一定的依據(jù)，但是隨著生物制品安全性要求的提高，其所檢內容還有待完善，如添加一些諸如動物蛋白、抗生素等的檢測，為生物制品廠家控制原材料的安全性提供更高的保障。2.3細胞培養(yǎng)基安全技術說明（MSDS）MSDS是化學品安全技術說明書，是化學品生產或銷售企業(yè)按法律要求向客戶提供的有關化學品特征的一份綜合性法律文件?；瘜W品安全說明書作為傳遞產品安全信息的最基礎的技術文件，其主要作用體現(xiàn)在：提供有關化學品的危害信息，保護化學產品使用者確保安全操作，為制訂危險化學品安全操作規(guī)程提供技術信息提供有助于緊急救助和事故應急處理的技術信息指導化學品的安全生產、安全流通和安全使用是化學品登記管理的重要基礎和信息來源隨著世界各國對產品安全和環(huán)境保護的日益重視，無論在國際貿易還是國內貿易中，只要企業(yè)生產的產品涉及到化學物質，都必須為客戶提供準確的MSDS化學品安全說明書。如果供應商提供的MSDS存在錯誤或失實，或故意隱瞞有害信息，造成用戶的人員傷亡或環(huán)境污染，用戶往往要求MSDS的提供單位承擔相應的法律責任。因此，編制MSDS必須符合買方所在國家和地區(qū)的有關危險化學品的法律法規(guī)。中國于2000年頒布了國家標準《化學品安全技術說明書編寫規(guī)定》（GB16483-2000），用于規(guī)范國內化學品生產企業(yè)編寫化學品安全技術說明書的內容和編寫要求，該內容主要包含16項：化學品及企業(yè)標識、成分/組成信息、危險性概述、急救措施、消防措施、泄露應急處理、操作處置與儲存、接觸控制/個體防護、理化特性、穩(wěn)定性和反應性、毒理學資料、生態(tài)學資料、廢棄處置、運輸信息、法規(guī)信息、及其他信息（參考文獻、填表時間、填表部門、數(shù)據(jù)審核單位）等；每項下面有詳細的說明，不同的化學品制造者據(jù)此結合產品特性制定相應的條款。哺乳類動物細胞培養(yǎng)基是一種由無機鹽、氨基酸、維生素以及其他有機化合物按一定比例組成的混合物，在貿易中屬于化學品范疇，并且每個品種中的成份及含量不同，針對每個品種都應制定相應的MSDS說明。國外的生物制藥企業(yè)在對細胞培養(yǎng)基生產企業(yè)進行質量審計時，都要求生產企業(yè)提供所使用細胞培養(yǎng)基品種的MSDS，經審計符合對方法律要求才有資格作為供應商。而國內生物制品廠家目前尚未對細胞培養(yǎng)基廠家提出該要求。細胞膜的滲透性實驗報告實驗目的：1．了解細胞膜的滲透性2．了解各種小分子物質跨膜進入紅細胞的速度實驗原理：1.細胞膜具有對物質選擇透過的生理功能。脂溶性越高通透性越大，水溶性越高通透性越??；非極性分子比極性容易透過，小分子比大分子容易透過。水分子可通過由膜脂運動而產生的間隙。非極性的小分子如O2、CO2、N2可以很快透過脂雙層，不帶電荷的極性小分子，如尿素、甘油等也可以透過人工脂雙層，盡管速度較慢，分子量略大一點的葡萄糖、蔗糖則很難透過，而膜對帶電荷的物質如：H+、Na+、K+、Cl–、HCO3–是高度不通透的。2.hemolysis（溶血現(xiàn)象）：滲入紅細胞的溶質能提高紅細胞的滲透壓，使水進入細胞，引起細胞吸水脹破；即紅細胞膜破裂，血紅蛋白從紅細胞中逸出的現(xiàn)象稱為溶血現(xiàn)象。3.isotonicsolution（等滲溶液）：滲透壓與血漿滲透壓相等的溶液稱為等滲溶液。4.Hypertonicsolution（高滲溶液）：滲透壓高于血漿滲透壓的溶液稱為高滲溶液。5.Hypotonicsolution（低滲溶液）：滲透壓低于血漿滲透壓的溶液稱為低滲溶液。6.semipermeable（半透性）：膜或膜狀結構只允許溶劑(通常是水)或部分溶質(一般為小分子物質)透過，而不允許其他溶質(一般為大分子物質)透過的特性。7.osmosis（滲透作用）：膜兩側溶液濃度存在差異，造成化學勢能差，在勢能差的驅動下，溶劑穿過對溶質不透膜的過程。實驗材料及作用：150mmol/LNaCl,蒸餾水，5mmol/LNaCl，65mmol/LNaCl，0.8mol/L甲醇，0.8mol/L乙醇，0.8mol/L丙醇，0.8mol/L乙二醇，0.8mol/L丙三醇，2%TritonX-100，氯仿(三氯甲烷)。1.NaCl的作用：將正常紅細胞懸浮于不同濃度的NaCI溶液中：等滲溶液中的紅細胞保持正常大小和雙凹圓碟形；滲透壓遞減的一系列溶液中，紅細胞逐步脹大并雙側凸起，當體積增加30%時成為球形；體積增加45%～60%則細胞膜損傷而發(fā)生溶血，這時血紅蛋白逸出細胞外，僅留下一個雙凹圓碟形細胞膜空殼，稱為血影細胞（ghostcell）。正常人的紅細胞一般在0.42%NaCI溶液中時開始出現(xiàn)溶血,在0.35%NaCI溶液中時完全溶血.2.甲醇：小分子、親脂性的非極性分子甲醇為低滲溶液，容易溶解于脂雙層，并迅速透過，提高紅細胞的滲透壓，促使水分進入細胞，引起溶血。乙醇：乙醇是脂溶性小分子，可以自由擴散進出細胞。紅細胞外有相對高濃度的乙醇，大量乙醇分子順濃度差進入紅細胞，使紅細胞內滲透壓高于紅細胞外滲透壓，水通道開放，大量水分子進入紅細胞，發(fā)生溶血。丙醇，丙二醇，丙三醇的作用與甲醇，乙醇的作用相似，都是脂溶性分子，隨著分子量的增加，分子的增大，溶血時間增加。去垢劑是一些具有親水的極性基團和疏水的非極性基團的長鏈分子。非離子型去垢劑如TritonX-100((聚乙二醇辛基苯基醚))可與脂雙層形成混合微團，它們主要與蛋白質疏水部位相互作用，一般不會引起蛋白質變性。而離子型去垢劑與蛋白結合后可改變蛋白質結構，使之變性，尤其是加熱后可使蛋白質解離為單體，如十二烷基磺酸鈉（SDS）等。多種去污劑可以溶解細胞膜上的磷脂化合物，從而使細胞膜破裂，釋放出細胞內物質。6.氯仿：氯仿是很好的脂類萃取劑，不能夠發(fā)生溶血現(xiàn)象。實驗過程：取新鮮羊血，加入適量抗凝劑備用觀察加入不同溶液之后的溶血現(xiàn)象。滲透性計時比較實驗結果分析：1.蒸餾水和150mmol/LNaCl：試劑150mmol/LNaCl蒸餾水變化不溶血，靜置半小時后分層，上層無色透明，下層紅色不透明。溶血，溶液通體一色，紅色透明溶血時間——1s以內顯微觀察完整的紅細胞無完整的紅細胞，有絮狀物質結論：Na+和Cl-不能以自由擴散方式通過細胞膜，0.15mol/LNaCl不能導致溶血；而H2O可以很快地進入細胞內，使細胞膨脹溶血。不同濃度的NaCl試劑5mmol/LNaCl65mmol/LNaCl150mmol/LNaCl變化迅速溶血溶血不溶血，靜置半小時后分層，上層無色透明，下層紅色不透明。溶血時間5s10s——顯微觀察無完整紅細胞，絮狀物質，能看見少量血影細胞無完整紅細胞，有血影細胞完整的紅細胞結論：150mmol/LNaCl溶液與羊血細胞是等滲溶液，所以不能溶血，5mmol/LNaCl與65mmol/LNaCl溶液為低滲溶液，能夠是紅細胞吸水漲裂。濃度越低，與細胞的滲透壓相差越大，滲透作用越強，越容易發(fā)生溶血。相同濃度的甲醇，乙醇，丙醇試劑0.8mol/L甲醇0.8mol/L乙醇0.8mol/L丙醇變化溶血溶血溶血溶血時間7s10s12s顯微觀察無完整紅細胞，有絮狀沉淀，血影細胞無完整紅細胞，有絮狀沉淀，血影細胞結論：血細胞在相同濃度的甲醇，乙醇，