基于雙樹枝狀放大效應(yīng)的免疫傳感器對苯并芘的快速檢測

圖15(A)聚三聯(lián)噻吩修飾電極，采用單標(biāo)記二抗構(gòu)建的體系；(B)聚三聯(lián)噻吩-PAMAM修飾電極，使用單標(biāo)記二抗構(gòu)建的體系；(C)聚三聯(lián)噻吩-PAMAM修飾電極，使用多酶-二氧化硅-二抗構(gòu)建的體系；(D)聚三聯(lián)噻吩-PAMAM修飾電極，使用多酶-亞甲基藍(lán)/二氧化硅-二抗構(gòu)建的體系使用帶氨基的聚三聯(lián)噻吩薄膜作為電極表面的第一層修飾物提供起始的氨基，再通過戊二醛偶聯(lián)PAMAM對氨基進(jìn)行化學(xué)放大，同時PAMAM的空間結(jié)構(gòu)也有利于增大表面積，減少了固定化抗原之間的位阻，PAMAM修飾后的電極表面提供了更多的抗原結(jié)合位點(diǎn)，有效地增加了抗原的固定量。在其它條件一致的情況下，圖15(A)是沒有用PAMAM構(gòu)建的體系，而圖15(B)是使用PAMAM構(gòu)建的體系，加入30L0.48MH2O2引起的信號變化，這說明PAMAM確實(shí)有利于提高傳感器的靈敏度。通過二抗把免疫信號轉(zhuǎn)換為電化學(xué)信號是電化學(xué)免疫傳感器的常用方法。然而，傳統(tǒng)的單標(biāo)記方法得到的檢測信號小，這將不利于提高傳感器的靈敏度。用納米二氧化硅制備多標(biāo)記二抗主要是由于二氧化硅良好的生物相容性和表面易改性。然而二氧化硅導(dǎo)電性很差，不利于電子在酶和電極之間的傳遞。本論文中使用的核殼納米粒子以亞甲基藍(lán)為內(nèi)核，亞甲基藍(lán)是良好的電子中介體，可以有效地提高二氧化硅的電子傳遞能力。不僅如此，納米材料的應(yīng)用使得一個二抗分子可以同時連接多個酶分子，當(dāng)待測物濃度相同時，多標(biāo)記二抗構(gòu)建的系統(tǒng)得到的信號比單標(biāo)記的系統(tǒng)要大許多，這就實(shí)現(xiàn)了有效信號的放大，極大地提高了傳感器的靈敏度。核殼納米二氧化硅，核殼粒子的作用不僅僅是偶聯(lián)二抗與多個酶分子，其內(nèi)核材料亞甲基藍(lán)是良好的電子中介體，它能夠加速電子傳遞過程，這將有利于電子在電極表面的傳遞，而電子的傳遞是酶信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枴榱苏f明多標(biāo)記方法的優(yōu)越性，本論文進(jìn)行了一組對照實(shí)驗(yàn)，控制其他條件相同，對照實(shí)驗(yàn)C使用多酶-二氧化硅-二抗，對照實(shí)驗(yàn)D使用多酶-亞甲基藍(lán)/二氧化硅-二抗。從循環(huán)伏安圖上可以看出，使用多標(biāo)記二抗構(gòu)建的體系在加入30L0.48MH2O2后，電位-0.4V處的還原峰，電流值的變化為相同條件下單標(biāo)記二抗的兩倍，這說明多標(biāo)記二抗3.9對苯并芘的競爭檢測對待測物進(jìn)行分析檢測是免疫傳感器的最終目的，無論是傳感器構(gòu)建的設(shè)計過程還是對檢測條件的優(yōu)化都是為了得到更穩(wěn)定、靈敏度更高的分析方法。本論文構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器屬于酶標(biāo)免疫傳感器，傳感器通過酶分子將免疫反應(yīng)的生物信號轉(zhuǎn)換為電信號。供氫體HQ在電極表面的氧化還原反應(yīng)中，HQ為還原態(tài)，生成的自由基為氧化態(tài)，反應(yīng)方程如下所示：當(dāng)H2O2從溶液中擴(kuò)散到電極表面，被固定在電極表面上的辣根過氧化物酶(HRP)被還原，辣根過氧化物酶是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，HRP(Fe3+)催化還原H2O2，本身生成不穩(wěn)定的還原態(tài)HRP-I，這是一個兩電子反應(yīng)，反應(yīng)如下式所示[17]：HRP(Fe3+)+H2O2HRP-I+H2OHRP-I在電子傳遞介體作用下從電極得到電子，進(jìn)行兩步單電子還原反應(yīng)，最終再被還原回HRP(Fe3+)，反應(yīng)方程表示如下[18]：HRP-I+HQ(Red)HRP-II+Q(Ox)HRP-II+HQ(Red)HRP+Q(Ox)在整個反應(yīng)中，HRP酶并沒有被消耗掉，而是起催化的作用。在HRP酶和反應(yīng)底物H2O2的存在下，電極表面還原態(tài)的對苯二酚被氧化，氧化態(tài)的自由基大幅增加。由于電極處于對苯二酚的溶液中，被消耗的對苯二酚對溶液的濃度改變不大。因此，電化學(xué)中氧化峰的電流強(qiáng)度變化不大，而還原峰的電流強(qiáng)度隨著H2O2濃度增大發(fā)生顯著變化。酶促反應(yīng)速度與酶分子的濃度成正比。當(dāng)?shù)孜锓肿訚舛茸銐驎r，酶分子越多，底物轉(zhuǎn)化的速度越快。因此，電流信號的變化大小與電極表面HRP酶的數(shù)量成正比。而酶分子的數(shù)量與標(biāo)記二抗、固定化抗體的數(shù)量成正比[19-20]。在優(yōu)化的條件下，以上述制備的Antigen/PAMAM/NH2-3T/Au傳感器探針對苯并芘進(jìn)行檢測，在pH7.4，含有1mM對苯二酚，3.6mMH2O2的溶液中，以100mV/s的速率，從-0.6V到0.8V對其進(jìn)行CV掃描，以此來觀察陰極電流與苯并芘含量的關(guān)系，如圖16lg(I)=(0.542±0.010)+(?0.141±0.008)lgCBaP其中I為免疫傳感器的陰極電流，CBaP為溶液中苯并芘的含量，相關(guān)系數(shù)r=99.02%，該免疫傳感器對苯并芘在0.01-2ng/mL有線性響應(yīng)，檢測限為6pg/mL，該免疫傳感器具有較低的檢測限，這便說明以導(dǎo)電聚合物-PAMAM和復(fù)合納米多標(biāo)記二抗為基礎(chǔ)的雙重放大策略在電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建中具有很大的價值。圖16濃度的苯并芘下陰極電流變化圖3.10性能表征此外，通過進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)以檢測實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性，三次平行實(shí)驗(yàn)后，得出電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.85%。將所制得的Antigen/PAMAM/NH2-3T/Au傳感器探針浸泡在PH7.4的PBS中，4°C保存三十天后，再次使用時電流強(qiáng)度為剛制備時的92%，這表明該免疫探針具有較好的穩(wěn)定性，可能與帶負(fù)電的二氧化硅中包埋了帶正電的亞甲基藍(lán)有關(guān)。本論文還通過將不同量的苯并芘加入到PBS中作為樣本進(jìn)行測定，然后將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其真實(shí)含量進(jìn)行對比。分別在含有0.05,0.1,0.3,0.5和1.0ng/mL苯并芘的五個樣本中進(jìn)行檢測與對照，最終得到它們的回收率分別為97.1,99.5,98.4,100.9和14結(jié)論本文通過制備了PAMAM，用其固定抗原，利用了其樹枝狀的空間結(jié)構(gòu)優(yōu)勢，有效地提高了電極表面的抗原結(jié)合位點(diǎn)，從而提高電極表面抗原的固定量。同時用制備的亞甲基藍(lán)/二氧化硅核殼納米粒子制備二抗復(fù)合物，放大檢測信號。通過免疫競爭反應(yīng)，酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對低含量污染物苯并芘的快速檢測。5致謝感謝國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃973計劃

(2009CB421601)、國家自然科學(xué)基金(20827006)、廣東省大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項目(1056410003)和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)211項目(2009B010100001)的資助。參考文獻(xiàn)：[1]丁峰,沈偉,顧金利等.POPs污染及其治理方法[J].科技情報開發(fā)與經(jīng)濟(jì),2009,19(8):151-153.[2]王文興,童莉,海熱提.土壤污染物來源及前沿問題[J],生態(tài)環(huán)境,2005,14(1):1-5.[3]高翔云,湯志云,李建和等.國內(nèi)土壤環(huán)境污染現(xiàn)狀與防治措施[J].江蘇環(huán)境科技,2006,19(2):52-55.[4]張燕平,邱樹毅.持久性有機(jī)污染物(POPs)及其生態(tài)毒性[J].廣東化工,2009,36(10):119-120.[5]鞠熀先.電分析化學(xué)與生物傳感技術(shù)[M].科學(xué)出版社,2006.[6]李妍,張培玉.監(jiān)測環(huán)境污染的生物傳感器[J].環(huán)境研究與檢測,2010,04(23):77.[7]SBoujday,SNasri,MSalmainc,etal.SurfaceIRimmunosensorsforlabel-freedetectionofbenzo[a]pyrene[J].BiosensorsandBioelectronics,2010,26(4):1750-1754.[8]YHWu,XQLiu,LZhang,etal.Anamperometricbiosensorbasedonratcytochromep4501A1forbenzo[a]pyrenedetermination[J].BiosensorsandBioelectronics,2011,26(5):2177-2182.[9]HYao,NLi,SXu,etal.Electrochemicalstudyofanewmethyleneblue/siliconoxidenanocompositionmediatoranditsapplicationforstablebiosensorofhydrogenperoxide[J].BiosensorsandBioelectronics,2005,21(2):372-377[10]SBerchmans,PArunkumar,SLalitha,etal.Preparationofcatalytic?lmsofplatinumonAusubstratesmodi?edbyself-assembledPAMAMdendrimermonolayers[J].AppliedCatalysisB:Environmental,2009,88(3-4):557-563.[11]周卓華.羥基磷灰石/PAMAM納米復(fù)合材料的水熱合成及其形貌控制[D].上海師范大學(xué)碩士論文,2007.[12]周玉蘭,劉永利,楊華等.聚酰胺-胺型樹狀大分子化合物的合成研究[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2001,22(04):321-326.[13]司寶財.樹枝狀大分子復(fù)合磁性顆粒的制備與表征[D].哈爾濱工程大學(xué)碩士論文,2007.[14]曲祥金,李金煥,艾仕云.樹狀高分子PAMAM的合成及其性能研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2008,39(3):429-432.[15]TPZhong,PFAi,JZhou.StructuresandpropertiesofPAMAMdendrimer:Amulti-scalesimulationstudy[J].FluidPhaseEquilibria,2011,302(1-2):43-47.[16]劉志廣.儀器分析[M].高等教育出版社,2007,7:276-313.[17]王朝瑾,應(yīng)太林,吳芯芯等.辣根過氧化物酶傳感器的研究-對苯二酚為電子傳遞體[J].食品科學(xué),1998,19(8):49-51.[18]RPLiang,HDQiu,PXCai.Anovelamperometricimmunosensorbasedonthree-dimensionalsol-gelnetworkandnanoparticleself-assembletechnique[J].AnalyticaChimicaActa,2005,534(2):223-229.[19]JZXu,JJZhu,QWu,etal.Anamperometricbiosensorbasedonthecoimmobilizationofhorseradishperoxidaseandmethyleneblueonacarbonnanotubesmodifiedelectrode[J].Electroanalysis,2003,15(3)