細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法原理

一、細(xì)胞培養(yǎng)：1.細(xì)胞培養(yǎng)：從活的機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，分散成單個(gè)細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)的生長(zhǎng)條件，在體外建立無(wú)菌、適溫和一定營(yíng)養(yǎng)條件等，使其在體外環(huán)境中繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。2.細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件：無(wú)菌條件、細(xì)胞生長(zhǎng)條件、細(xì)胞檢測(cè)條件、細(xì)胞保存條件。3.無(wú)菌條件：1）凈化工作室：凈化工作間是基于無(wú)菌條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)操作的場(chǎng)所，設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為萬(wàn)級(jí)，專供細(xì)胞培養(yǎng)、凍存以及細(xì)胞治療用。①細(xì)胞培養(yǎng)間：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。每周乳酸、過(guò)氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒②潔凈層流罩：層流罩是可提供局部高潔凈環(huán)境的空氣凈化的設(shè)備。主要由箱體、風(fēng)機(jī)、初效空氣過(guò)濾器、中效空氣過(guò)濾器、高效空氣過(guò)濾器、阻尼層、燈具等組成。③傳遞窗：該裝置是一種潔凈室的輔助設(shè)備，主要用于潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間小件物品的傳遞，以減少潔凈室的開(kāi)門次數(shù)，把對(duì)潔凈區(qū)的污染降低到最低程度。④無(wú)塵服層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室的總體要求：經(jīng)濟(jì)、有序、高效、安全。相關(guān)制度：I.準(zhǔn)入制度：沒(méi)有經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員不得單獨(dú)進(jìn)入凈化室工作。進(jìn)入凈化室后要保持安靜，不得大聲喧嘩。II.安全制度：謹(jǐn)慎使用酒精燈，實(shí)驗(yàn)人員自覺(jué)維護(hù)室內(nèi)設(shè)備的安全使用，對(duì)室內(nèi)的儀器如CO2孵箱等要經(jīng)常注意機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)情況，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)檢修或報(bào)告請(qǐng)人檢修。離開(kāi)時(shí)斷開(kāi)必要的儀器電源。III.衛(wèi)生消毒制度：一般情況下細(xì)胞間每天消毒一次，方法為紫外線消毒（每次30分鐘至1小時(shí)）一次，另外每周用10％乳酸在緊閉門窗下熏蒸30分鐘；實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)及時(shí)清理所用物品，注意臺(tái)面整潔；層流凈化室實(shí)施值日生負(fù)責(zé)制。IV.出入制度：總體原則為進(jìn)出凈化室應(yīng)按次序開(kāi)、關(guān)門，只有將前面打開(kāi)的門關(guān)閉后才允許打開(kāi)下一個(gè)門，使緩沖間起到應(yīng)有的作用。所有進(jìn)出層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室的物品均應(yīng)通過(guò)傳遞窗進(jìn)行，紫外燈照射15分鐘2）無(wú)菌操作的儀器設(shè)備：①超凈工作臺(tái)：工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣經(jīng)過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。使用前開(kāi)啟柜內(nèi)紫外燈照射10－30分鐘，預(yù)工作10－15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺(tái)面空間呈凈化狀態(tài)。使用完畢后，要用70%酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈。②生物安全柜：既能使操作造成無(wú)菌、無(wú)塵的局部空氣環(huán)境，保證檢驗(yàn)、檢測(cè)不受污染，又能保證被研究的對(duì)象（如病菌、細(xì)菌等）不外溢，保護(hù)周圍環(huán)境及操作人員安全。廣泛應(yīng)用于低、中等危險(xiǎn)度（病原體1--3，DNA重組P1--P3）的臨床細(xì)菌學(xué)，病毒學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、生物學(xué)及生命科學(xué)的研究，加工、檢驗(yàn)部門。③高壓滅菌鍋：121℃，20min，適用于耐高溫耐高壓，不怕潮濕的物品（器械、細(xì)菌培養(yǎng)基等）④電熱干燥箱：干熱消毒，主要用于玻璃器皿消毒。⑤紫外線：主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒。⑥過(guò)濾除菌設(shè)備：0.45um和0.22um濾膜，大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過(guò)法除菌。4.培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)條件：營(yíng)養(yǎng)需要、生存環(huán)境（37℃、5%CO2、pH7.2-7.4）、無(wú)污染、無(wú)毒①玻璃器皿的清洗：浸泡、刷洗、浸酸和清洗四個(gè)步驟浸泡（自來(lái)水）→刷洗（洗衣粉）→泡酸（24小時(shí)）→流水沖洗→蒸溜水浸泡和沖洗→60-80℃烘干②CO2培養(yǎng)箱：37℃，5%CO2，用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣；保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈，定期消毒（90℃，14h)；箱內(nèi)蒸餾水槽中保持足夠的滅菌蒸餾水以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。③水：一級(jí)水：基本上不含有溶解或膠態(tài)離子雜質(zhì)及有機(jī)物。二級(jí)水經(jīng)過(guò)石英設(shè)備蒸餾或離子交換混合床處理后，再經(jīng)0.2um微孔濾膜過(guò)濾來(lái)制取。一級(jí)水用于有嚴(yán)格要求的分析試驗(yàn)，包括對(duì)顆粒有要求的試驗(yàn)，如高壓液相色譜用水。二級(jí)水：可含有微量的無(wú)機(jī)、有機(jī)或膠態(tài)雜質(zhì)?？捎枚啻握麴s或離子交換等方法制取。二級(jí)水用于無(wú)機(jī)痕分析等試驗(yàn)量分析等試驗(yàn)，如原子吸收光譜分析用水。三級(jí)水：適用一般實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)工作。可以用蒸餾、離子交換等方法制取。④平衡鹽溶液：主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖配制而成作用：維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度，提供細(xì)胞生存所需的無(wú)機(jī)離子，主要作為合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)溶液以及用于洗滌細(xì)胞組織等。常用：生理鹽水（0.9%），PBS，Hanks液Hanks液是生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的無(wú)機(jī)鹽溶液和平衡鹽溶液，主要用于配制配制培養(yǎng)液、稀釋劑和細(xì)胞清洗液，而不能單獨(dú)作為細(xì)胞、組織培養(yǎng)液。⑤pH調(diào)節(jié)液：碳酸氫鈉HEPES：一種可以保持細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中pH值較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑，通常使用濃度為10～15mM。⑥消化液：胰蛋白酶溶液：主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞游離分散開(kāi)來(lái)，常用濃度為0.25%或0.5%胰蛋白酶，不含Ca2+\Mg2+\血清的平衡鹽溶液配制，pH8左右，濾器過(guò)濾除菌。EDTA溶液：作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，可用EDTA和胰酶的混合液，EDTA溶液的使用濃度為0.02%，Hanks液溶解后高壓滅菌，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶（EDTA不能被血清中和）。膠原酶溶液：膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對(duì)象是膠原組織，因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，不受Ca2+\Mg2+\血清抑制，可采用磷酸緩沖液配制。⑦抗生素溶液：通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效，鏈霉素主要對(duì)革蘭陰性菌有效。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。⑧培養(yǎng)基：是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限；成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低。缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。RPMI-1640適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，主要針對(duì)淋巴細(xì)胞。DMEM（H）高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長(zhǎng)，適于生長(zhǎng)較快、附著較困難腫瘤細(xì)胞等⑨血清：人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有：多種蛋白質(zhì)、多種金屬離子、激素、促貼附生長(zhǎng)物質(zhì)、各種生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)移蛋白、不明成分。質(zhì)量鑒定：a.理化性質(zhì)：如如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應(yīng)小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。b.微生物檢測(cè)：包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對(duì)支原體、病毒的檢測(cè)，支原體是一種很小的微生物，可通過(guò)孔徑22um的濾膜。支原體、病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺(jué)，細(xì)胞也能生長(zhǎng)繁殖，但會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢測(cè)支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。常用血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，胎牛血清品質(zhì)最高。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明、淡黃色、無(wú)沉淀物、無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）56℃30分鐘血清的消毒：過(guò)濾除菌逐步解凍法：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50ml無(wú)菌離心管可分裝40～45ml。勿直接由–20℃至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。⑩谷氨酰胺：細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50%，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)的谷氨酰胺。完全培養(yǎng)基的組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、青/鏈霉素(各100單位/mL)、碳酸氫鈉(2g/L)、谷氨酰胺、生長(zhǎng)因子。每次配液量以兩周左右為宜，一次配液不要太多，防止?fàn)I養(yǎng)成分（主要為谷氨酰胺）損失，2-8℃保存無(wú)血清培養(yǎng)基：由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。5.細(xì)胞檢測(cè)條件：倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器、高速離心機(jī)、移液器6.細(xì)胞保存條件：液氮罐、凍存管二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)1.無(wú)菌操作技術(shù)antiseptictechnique：工作環(huán)境及表面的處理、細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理、培養(yǎng)液的處理、實(shí)驗(yàn)者的操作技術(shù)。1）常用細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)物品的滅菌方法：?培養(yǎng)液等易失活物質(zhì)：過(guò)濾；抗生素?平衡鹽溶液及其它需要滅菌的液體：121℃,20分鐘；過(guò)濾?布類、玻璃制品、金屬器械、細(xì)胞培養(yǎng)耗材等：121℃,20分鐘，然后烘干；?玻璃瓶：干熱滅菌170℃,4小時(shí)。?操作臺(tái)面：紫外線；70%酒精涂擦?實(shí)驗(yàn)者：70%酒精涂擦2）?無(wú)菌培養(yǎng)室每天紫外線照射消毒30-50min每周用10％乳酸在緊閉門窗下熏蒸30分鐘。?超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用70％酒精擦洗，然后紫外線消毒10-30min。?在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線?應(yīng)盡量避免瓶口在超凈臺(tái)中敞開(kāi)直立?同一根吸管或滴管不應(yīng)連續(xù)用于幾個(gè)不同的細(xì)胞系2.培養(yǎng)細(xì)胞的觀察：1）肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及渾濁度2）倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)3.體外細(xì)胞培養(yǎng)分型：1）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時(shí)不能按照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，僅大致分成以下四型：成纖維細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型、游走細(xì)胞型、多型細(xì)胞型。2）懸浮型：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)來(lái)源：自血、脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌細(xì)胞特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形、單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)(尤以正常細(xì)胞)3）培養(yǎng)細(xì)胞的“一代生存期”：從細(xì)胞接種后到再次傳代培養(yǎng)之前的這一段時(shí)間。a.潛伏期(latentphase)b.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(logarithmicgrowthphase)c.停滯期(stagnatephase)4.細(xì)胞傳代：體外生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞受營(yíng)養(yǎng)條件、生長(zhǎng)空間等因素的限制，當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)一部分細(xì)胞和更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，此過(guò)程稱傳代（subculture）。每次傳代以后，細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程都會(huì)受一定的影響。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，傳代方法有3種：1)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代：離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液混勻后再傳代。2)半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）：此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。3)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代：采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。5.細(xì)胞計(jì)數(shù)：培養(yǎng)的細(xì)胞在般條件下要求有定的密度才能生長(zhǎng)良好一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每mL細(xì)胞數(shù)表示。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×104鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液；最適濃度為5～10×105細(xì)胞/ml，此范圍外計(jì)數(shù)誤差偏大。血球計(jì)數(shù)儀：自動(dòng)計(jì)數(shù)6.細(xì)胞活力的測(cè)定：總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力?；罴?xì)胞率=（細(xì)胞總數(shù)-死細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%臺(tái)盼藍(lán)法：活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。7.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇：細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。其原則是慢凍快融。1）常用的低溫保護(hù)劑是DMSO（終濃度5-20%），它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存液（10ml體系：含7ml培養(yǎng)基、2mlFBS、1ml甘油或DMSO）常用凍存液：包含10％二甲基亞砜（DMSO）的完全培養(yǎng)基2）慢凍程序：標(biāo)準(zhǔn)程序：當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)，1～2℃/min當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，5～10℃/min當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中一般程序：先將凍存管放入4℃冰箱，約30min；接著置于-20℃冰箱，約1-2h；置于-80℃超低溫冰箱中放置過(guò)夜；置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。簡(jiǎn)易法：-80℃冰箱過(guò)夜；液氮罐長(zhǎng)期保存。8.培養(yǎng)細(xì)胞的污染和檢測(cè)：1）細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒。無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等是主要的污染源。預(yù)防和避免污染是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵之一。2）在出現(xiàn)以下情況時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞可能有污染：?培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變?培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁?光鏡觀察到菌絲和顆粒?細(xì)胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢等3）細(xì)菌的污染和檢測(cè)：肉眼直接觀察法、培養(yǎng)檢查法、顯微鏡觀察法、PCR檢測(cè)法培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁、pH下降。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。4）真菌的污染和檢測(cè)：真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中最常見(jiàn)的一種，最常見(jiàn)的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見(jiàn)培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(zhǎng)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見(jiàn)絲狀、管狀或樹(shù)枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。5）支原體的污染和檢測(cè)：支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過(guò)濾除菌無(wú)法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開(kāi)始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對(duì)青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無(wú)明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。a.DNA熒光染色法：利用熒光染劑（bisbenzimide,Hoechst33258）檢測(cè)支原體污染。此染劑會(huì)結(jié)合到DNA之(A-T)rich區(qū)域，因?yàn)橹гw之DNA中A-T含量占多數(shù)（55～80%），所以可將其染色而檢測(cè)。被支原體污染之細(xì)胞經(jīng)染色后，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一熒光小點(diǎn)，即為支原體DNA，證明有支原體污染。特點(diǎn)︰簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測(cè)步驟?？梢詡蓽y(cè)不易培養(yǎng)之支原體，較直接培養(yǎng)法快，約一星期即可知道結(jié)果。缺點(diǎn)：有時(shí)仍會(huì)有熒光背景，影響判讀。b.掃描電鏡法6）病毒的污染和檢測(cè)：細(xì)胞的直接觀察；動(dòng)物接種檢查；電子顯微鏡觀察；免疫學(xué)檢查；PCR技術(shù)7）非同種細(xì)胞的污染8）黑膠蟲污染9）污染的清除：a.細(xì)菌/真菌：抗生素，預(yù)防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。b.支原體：I.用MRA處理細(xì)胞，效果好；II.用清洗純化法清除支原體污染，結(jié)合敏感抗生素，可達(dá)到更好的效果；III.藥物輔助加溫處理，對(duì)細(xì)胞有不良影響；IV.使用支原體特異性血清，比較麻煩。9.原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：來(lái)源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。1）原代培養(yǎng)（primaryculture），也稱初代培養(yǎng)。即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。完成了從體內(nèi)環(huán)境到體外環(huán)境的過(guò)渡和適應(yīng)過(guò)程，恢復(fù)了分裂增殖與生長(zhǎng)發(fā)育的能力。特點(diǎn)：a.性質(zhì)：I.性狀似體內(nèi)，II.細(xì)胞異質(zhì)性，III.細(xì)胞活躍移動(dòng)，分裂不旺盛；IV.相互依賴型強(qiáng)，獨(dú)立生存能力差，不易單個(gè)培養(yǎng)。b.發(fā)展過(guò)程：調(diào)整組成，經(jīng)過(guò)選擇，形成相對(duì)均一的細(xì)胞系。意義：a.原代培養(yǎng)的最大優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，具有二倍體的遺傳性，而且大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出原來(lái)組織的特性。b.利用原代培養(yǎng)做各種實(shí)驗(yàn)，如藥物測(cè)試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的試驗(yàn)效果很好。c.原代培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系（株）必須經(jīng)過(guò)的階段。2）原代細(xì)胞的取材：基本要求：a.注意新鮮和保鮮（取材時(shí)盡量能在4~6h內(nèi)制作成細(xì)胞）b.嚴(yán)格無(wú)菌c.用鋒利的器械切碎組織，減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷d.去除材料上的血液、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織e.盡量選用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)（胚胎組織易于成熟個(gè)體組織，分化低易于分化高的組織，腫瘤組織易于正常組織。）3）原代細(xì)胞的分離：a.細(xì)胞懸液的分離方法：培養(yǎng)材料為血液、羊水、胸水和腹水等細(xì)胞懸液時(shí)，可采用離心法分離。一般用500～1000rpm的低轉(zhuǎn)速，時(shí)間約5～10min。如果一次離心樣品量很多，時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，但離心速度過(guò)大、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)擠壓細(xì)胞造成損傷甚至死亡。b.實(shí)體組織塊的分離方法：培養(yǎng)材料為組織塊時(shí)，首先要把組織塊剪切至盡量小，然后用機(jī)械法/消化法等使組織進(jìn)一步分散，以獲得細(xì)胞懸液。①機(jī)械分散法：②消化分離法：I.酶消化分離法:常用胰蛋白酶和膠原酶；II.非酶消化分離法:EDTA法步驟：剪切-把組織塊切碎；漂洗-無(wú)鈣鎂PBS洗2/3次；消化-加入消化液（胰酶/膠原酶/EDTA）于37℃中適當(dāng)時(shí)間；棄消化液-傾斜自然沉降或低速離心法；終止、漂洗-加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化，漂洗2/3次后加入完全培養(yǎng)基；機(jī)械分散-采用吸管吹打或振蕩法，使細(xì)胞充分散開(kāi)以后用紗網(wǎng)過(guò)濾分瓶培養(yǎng)。注意事項(xiàng)：I.組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對(duì)胰酶的抑制作用。II.胰蛋白濃度不宜過(guò)高，作用時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免毒性作用。III.消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。③貼塊培養(yǎng)法：血管平滑肌細(xì)胞c.密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞：1.070粒細(xì)胞和紅細(xì)胞：1.092常用的淋巴細(xì)胞分離液有Ficoll淋巴細(xì)胞分離液、Percoll淋巴細(xì)胞分離液。4）原代細(xì)胞的純化：a.自然純化：即利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，而排擠其他細(xì)胞生長(zhǎng)，靠自然的增殖潛力最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，去除其他細(xì)胞。無(wú)法人為選擇細(xì)胞，時(shí)間長(zhǎng)。有些惡性腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)此方法，自然純化建立細(xì)胞系。b.人工純化：酶消化法（利用細(xì)胞對(duì)酶的耐受性不同）、反復(fù)貼壁法（利用細(xì)胞的貼壁速度不同）、培養(yǎng)及限定方法（某些細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中必須存在或必須去除某種物質(zhì)）、流式分選5）體外腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)：三個(gè)顯著特征：不受控增殖性、永生性、致瘤性6）癌細(xì)胞原代培養(yǎng)：a.成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等b.關(guān)鍵問(wèn)題：成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng)，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。I.成纖維細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)的去除：常采用機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法、膠原酶消化法等II.選擇性培養(yǎng)基：提高癌細(xì)胞體外存活，抑制成纖維細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)III.飼養(yǎng)層：在培養(yǎng)器皿底部接種能形成接觸性抑制的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，可以有利于癌細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制癌組織中正常成纖維細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)。7）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（large-scaleculturetechnology）是指在人工條件下（設(shè)定pH、溫度、溶氧等），在細(xì)胞生物反應(yīng)器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。培養(yǎng)方式：分批式培養(yǎng)、流加式培養(yǎng)（分批補(bǔ)料培養(yǎng)）、半連續(xù)式培養(yǎng)、連續(xù)式培養(yǎng)支持條件：細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)罐、微載體、無(wú)血清培養(yǎng)基三、轉(zhuǎn)染技術(shù)1.轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用：基因的結(jié)構(gòu)和功能分析、基因表達(dá)與調(diào)控、蛋白相互作用與胞內(nèi)定位、基因治療與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物2.轉(zhuǎn)染方法：化學(xué)介導(dǎo)：磷酸鈣共沉淀法、DEAE‐葡聚糖法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、納米顆粒作為載體的轉(zhuǎn)染物理介導(dǎo)：電穿孔法、顯微注射生物介導(dǎo)：病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染3.電穿孔法：通過(guò)把與細(xì)胞與DNA共同放入電轉(zhuǎn)杯中，利用高壓電脈沖促使細(xì)胞膜形成小孔，從而使DNA進(jìn)入細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率較高缺點(diǎn)：需要昂貴的儀器（電穿孔儀）。對(duì)細(xì)胞的損傷較大，每次轉(zhuǎn)染需要更多的細(xì)胞和DNA。每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化。電脈沖和場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因?yàn)檫^(guò)高的場(chǎng)強(qiáng)和過(guò)長(zhǎng)的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞注意事項(xiàng)：選擇合適的程序；由于試劑盒中的轉(zhuǎn)染buffer有一定的程度的低滲，所以細(xì)胞在轉(zhuǎn)染buffer中的時(shí)間盡可能短，操作迅速；動(dòng)作要輕柔。4.顯微注射法：（microinjection）是利用管尖極細(xì)（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復(fù)制或易位等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)。優(yōu)點(diǎn)：顯微注射法轉(zhuǎn)外源基因沒(méi)有長(zhǎng)度上的限制，目前已證明數(shù)百kb之DNA片段均可以成功產(chǎn)制出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。適用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。缺點(diǎn)：設(shè)備精密而昂貴、操作技術(shù)需要長(zhǎng)時(shí)間的練習(xí)，以及每次只能注射有限的細(xì)胞。不適合大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞研究的需要。5.磷酸鈣共沉淀法：氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定的比例混和，形成極小的磷酸鈣‐DNA復(fù)合物沉淀黏附在細(xì)胞膜表面，借助內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：便宜，對(duì)某些細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高（293T等）缺點(diǎn)：細(xì)胞有限制性；重復(fù)性不佳：pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應(yīng)時(shí)間、細(xì)胞孵育時(shí)間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因?yàn)樯踔疗x最優(yōu)條件十分之一個(gè)pH都會(huì)導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。6.DEAE-葡聚糖法：DEAE-dextran可以促使DNA結(jié)合到細(xì)胞膜上，然后通過(guò)內(nèi)吞作用(endocytosis)進(jìn)入細(xì)胞?；贒EAE‐dextran的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法適用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(transienttranfection)，但不適用于篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。DEAE‐dextran在較高濃度作用較長(zhǎng)時(shí)間會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性。一種方法為把DNA和DEAE-dextran混合后加入到細(xì)胞中，另一種方法為先用DEAE-dextran預(yù)處理細(xì)胞，然后再加入DNA。優(yōu)點(diǎn)：相對(duì)簡(jiǎn)單；重復(fù)性比磷酸鈣沉淀法好；基于DEAE-dextran的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法不僅可以轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞也可以轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞。缺點(diǎn)：濃度高時(shí)有一定細(xì)胞毒性；不適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)要除掉血清。7.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過(guò)靜電作用將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA-脂復(fù)合體，也能被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸附，再通過(guò)膜的融合或細(xì)胞的內(nèi)吞作用，偶爾也通過(guò)直接滲透作用，將DNA傳遞進(jìn)入細(xì)胞，形成包涵體或進(jìn)入溶酶體其中一小部分DNA能從包涵體內(nèi)釋放，并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，再進(jìn)一步進(jìn)入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。脂質(zhì)體是磷脂分散在水中時(shí)形成的脂質(zhì)雙分子層，又稱為人工生物膜。優(yōu)點(diǎn)：適用于把DNA轉(zhuǎn)入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染效率高，比磷酸鈣法高5-100倍；能夠把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞；轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性好，可重復(fù)性高。缺點(diǎn)：價(jià)格較貴，不適應(yīng)于大批量轉(zhuǎn)染；陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性相對(duì)較高，對(duì)部分細(xì)胞可能會(huì)干擾細(xì)胞的代謝。注意事項(xiàng)：a.細(xì)胞密度，70%-90%融合度為佳b.需用無(wú)血清培養(yǎng)基c.換液，降低毒性d.每種細(xì)胞的DNA與脂質(zhì)體的比例需要優(yōu)化。8.納米顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染：利用納米顆粒吸附或者包裹DNA9.病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染：腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒載體，適用于其他方法較難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞，特別是免疫相關(guān)細(xì)胞，比如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。利用產(chǎn)生的“假病毒”顆粒感染靶細(xì)胞，從而把目的基因?qū)爰?xì)胞。10.腺病毒：無(wú)包膜的線性雙鏈DNA病毒，在自然界分布廣泛。其基因組長(zhǎng)約36kb，兩端各有一個(gè)反向末端重復(fù)區(qū)（ITR），ITR內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號(hào)。E1區(qū)的缺失可造成病毒在復(fù)制階段的流產(chǎn)。E3為復(fù)制非必須區(qū)，其缺失則可以大大地?cái)U(kuò)大插入容量。構(gòu)建腺病毒的要素：a.腺病毒基因組質(zhì)粒（骨架質(zhì)粒）：保留了腺病毒大部分基因，但是缺失了E1，E3和包裝信號(hào)缺失了E1區(qū)，不能獨(dú)立復(fù)制；b.穿梭質(zhì)粒：含有多克隆位點(diǎn)缺失E1，不能復(fù)制有包裝信號(hào)；c.目的基因片段d.包裝細(xì)胞：293或293T（由293細(xì)胞派生，同時(shí)表達(dá)SV40大T抗原）293細(xì)胞是一株轉(zhuǎn)染腺病毒E1A基因的人腎上皮細(xì)胞系，可以持久地分泌產(chǎn)生腺病毒E1蛋白，激活同源重組體產(chǎn)生包裝腺病毒。故293細(xì)胞是生產(chǎn)、擴(kuò)增腺病毒的必要條件方法步驟及關(guān)鍵點(diǎn)：將目的基因克隆到穿梭質(zhì)?！诖竽c桿菌BJ-5183中制備重組腺病毒質(zhì)粒→在HEK-293細(xì)胞中包裝重組腺病毒→高滴度重組腺病毒的擴(kuò)增和純化腺病毒載體特點(diǎn)：I.插入DNA片段較長(zhǎng)II.宿主范圍廣，可感染分裂和非分裂細(xì)胞對(duì)人致病性低III.不整合到染色體中，無(wú)插入致突變性IV.能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因V.與人類基因同源，故其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物能夠有效折疊和修飾VI.能有效進(jìn)行增殖，滴度高，外源基因表達(dá)效率高VII.病毒顆粒穩(wěn)定，易于濃縮和純化VIII.表達(dá)時(shí)間短，需反復(fù)刺激IX.具有免疫原性，可能刺激宿主11.逆轉(zhuǎn)錄病毒：是RNA病毒，但有逆轉(zhuǎn)錄酶，可使RNA轉(zhuǎn)錄為DNA,再整合到宿主細(xì)胞基因組。它有三個(gè)基因：gag-編碼病毒的核心蛋白；pol-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；env-編碼病毒的被膜糖蛋白特點(diǎn)：①就目前所知，在大多數(shù)情況下，逆轉(zhuǎn)錄病毒的腫瘤基因（oncogene）都能夠在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄；②逆轉(zhuǎn)錄病毒的寄主范圍相當(dāng)廣泛，包括無(wú)脊椎動(dòng)物，其中有的還能夠在人體細(xì)胞中生長(zhǎng)；③逆轉(zhuǎn)錄病毒不但感染效率高，而且通常不會(huì)導(dǎo)致寄主細(xì)胞的死亡，被它感染的或轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞能夠持續(xù)許多世代，保持正常生長(zhǎng)和保持病毒感染性的能力。優(yōu)點(diǎn)：能夠整合到宿主細(xì)胞，形成穩(wěn)定表達(dá)；假病毒。缺點(diǎn)：只能感染能夠分裂的細(xì)胞；整合的時(shí)候會(huì)導(dǎo)致宿主基因組突變，有潛在的致瘤性。12.慢病毒：（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。優(yōu)點(diǎn)：分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均能感染；能夠整合到基因組；免疫原性弱。缺點(diǎn)：整合時(shí)同樣有可能導(dǎo)致宿主基因組突變13.轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)：a.免疫熒光b.流式細(xì)胞術(shù)c.WesternBlotd.PCR14.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：是指外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，存在于游離的載體上，不整合到細(xì)胞的染色體上。外源基因?qū)爰?xì)胞1-2天后收獲細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和分析。一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：DNA整合到宿主細(xì)胞的染色體中。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過(guò)一些選擇性標(biāo)記反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的篩選藥物：G418，zeocin，Puromycin等。最常用：G418-一種氨基糖苷類抗生素，它通過(guò)抑制轉(zhuǎn)座子Tn601，Tn5的基因，干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對(duì)原核和真核等細(xì)胞產(chǎn)生毒素。篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆：篩選之前確定G418濃度→加藥時(shí)間和維持濃度→挑選單克隆的優(yōu)化→篩選后鑒定轉(zhuǎn)染后質(zhì)粒整合到基因組是隨機(jī)的，一般兩月后（傳代10代以上）還表達(dá)目的蛋白的可以認(rèn)為是整合了質(zhì)粒的。15.細(xì)胞轉(zhuǎn)染注意事項(xiàng)：a.如為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，必需應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，轉(zhuǎn)染當(dāng)日的細(xì)胞密度以70‐90%（貼壁細(xì)胞）或2×106-4×106細(xì)胞/mL（懸浮細(xì)胞）為宜，最好在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一次新鮮培養(yǎng)液.。b.用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無(wú)蛋白質(zhì)，無(wú)RNA和其它化學(xué)物質(zhì)的污染，OD260/280比值應(yīng)在1.8左右。c.有血清時(shí)的轉(zhuǎn)染：在開(kāi)始準(zhǔn)備DNA和陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑稀釋液時(shí)要使用無(wú)血清的培養(yǎng)基，因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。d.培養(yǎng)基中的抗生素：抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。e.一般在轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)，靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?4-48小時(shí)后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。f.如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，則可對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物，常用的真核表達(dá)基因載體的標(biāo)志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）等。16.影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染的主要因素：a.細(xì)胞狀態(tài)：健康的細(xì)胞培養(yǎng)物是成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細(xì)胞密度。一般推薦在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將細(xì)胞傳代，這樣可提供正常細(xì)胞代謝，增加對(duì)外源DNA攝入的可能。一定要避免細(xì)菌、支原體或真菌的污染。b.血清：血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下效率較低，因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。因此在轉(zhuǎn)染前最好去除血清。c.DNA質(zhì)量：DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，帶少量的鹽離子、蛋白、代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。d.轉(zhuǎn)染技術(shù)：轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等。17.細(xì)胞轉(zhuǎn)染常見(jiàn)問(wèn)題：a.轉(zhuǎn)染效率低：I.沒(méi)有使用優(yōu)化條件：優(yōu)化陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑和DNA的量。II.存在抑制劑：不要在用于制備DNA‐陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基中使用抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。III.不恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度：轉(zhuǎn)染時(shí)融合度應(yīng)為70%‐90%。IV.陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑凍結(jié)：不要使用凍結(jié)的或儲(chǔ)存溫度低于4℃的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑。V.質(zhì)粒純化的問(wèn)題。b.細(xì)胞死亡率高：I.DNA量太高II.陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑量太高III.在轉(zhuǎn)染過(guò)程中使用抗菌素：在轉(zhuǎn)染過(guò)程中不要使用氯霉素，青霉素或鏈霉素，因?yàn)殛?yáng)離子脂質(zhì)體試劑使細(xì)胞更敏感。IV.細(xì)胞太少V.對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，篩選抗生素加入的太快：在加入篩選性抗生素前至少預(yù)留24‐48小時(shí)使細(xì)胞表達(dá)抗性基因。四、基因沉默技術(shù)1.基因沉默技術(shù)：從DNA或者RNA水平抑制基因表達(dá)的技術(shù)。主要包括：基因打靶技術(shù)、反義寡核苷酸技術(shù)、鋅指核酸酶技術(shù)和TALEN技術(shù)、RNAi技術(shù)。2.基因打靶技術(shù)：基因打靶是利用DNA同源重組原理，在基因組中的某一特定部位進(jìn)行定點(diǎn)的基因重組，是研究基因的功能的有效手段。包括基因敲除（geneknockout）和基因敲入（geneknockin）。基因敲除：主要目的是為了抑制某個(gè)基因的表達(dá)。基因敲入：引入某個(gè)基因的表達(dá)（疾病基因），也可以用來(lái)抑制某個(gè)基因的表達(dá)。同源重組(homologousrecombination):是將外源基因定位導(dǎo)入受體細(xì)胞染色體上的方法，因?yàn)樵谠撟挥信c導(dǎo)入基因同源的序列，通過(guò)單一或雙交換，新基因片段可替換有缺陷的基因片段，達(dá)到修正缺陷基因的目的。位點(diǎn)特異性重組:發(fā)生在兩條DNA鏈特異位點(diǎn)上的重組，重組的發(fā)生需一段同源序列即特異性位點(diǎn)(又稱附著點(diǎn)；attachmentsite，att)和位點(diǎn)特異性的蛋白因子即重組酶參與催化?；虼虬屑夹g(shù)步驟：a.構(gòu)建打靶載體；b.將載體導(dǎo)入ES細(xì)胞；c.將基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎；d.將10-20個(gè)胚泡植入小鼠子宮；e.獲得子代小鼠，篩選帶有靶基因的小鼠。常用方法：PCR、Southern印跡、Northern印跡；f.雜合小鼠（+/-）間雜交，獲得子二代小鼠（+/+、-/-、+/-）；g.篩選的-/-、+/-子二代小鼠。3.反義寡核苷酸：是一類經(jīng)人工合成或構(gòu)建的反義表達(dá)載體表達(dá)的寡核苷酸片段，長(zhǎng)度多為15-30個(gè)核苷酸，通過(guò)堿基互補(bǔ)原理，與目的基因的DNA或者mRNA結(jié)合。目前普遍認(rèn)為反義核酸可以在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)3個(gè)水平上發(fā)揮作用。其機(jī)制為:(1)在細(xì)胞核內(nèi)以堿基配對(duì)原理與基因組DNA結(jié)合,從復(fù)制與轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮反義阻止作用。(2)阻礙mRNA與核糖體的結(jié)合,從而阻礙翻譯(3)改變mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),從而阻礙核糖體的結(jié)合;(4)與mRNA的5’末端編碼區(qū)(主要是起始密碼AUG)結(jié)合,阻止RNA的翻譯;(5)結(jié)合到前體RNA的外顯子和內(nèi)含子的連接區(qū),阻止其剪切成熟;(6)作用于mRNA的polyA形成位點(diǎn),阻止成熟和轉(zhuǎn)運(yùn)4.鋅指酶技術(shù)：鋅指核酸酶能夠識(shí)別并結(jié)合指定的位點(diǎn)，高效且精確地切斷靶DNA。隨后細(xì)胞利用天然的DNA修復(fù)過(guò)程——“同源定向修復(fù)”或“非同源末端連接”來(lái)治愈靶的斷裂，就能夠進(jìn)行基因組編輯，包括基因修復(fù)、基因刪除和定向的基因添加。鋅指核酸酶（ZFN）：由一個(gè)DNA識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。DNA識(shí)別域是由一系列Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯(lián)組成（一般3~4個(gè)），每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基。優(yōu)點(diǎn)：傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)依賴細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源重組，其效率只有10-6，而鋅指核酸酶的基因敲除效率能達(dá)到1-20%；周期短；可構(gòu)建knockout細(xì)胞；缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴5.TALEN（Transcriptionactivator-likeeffectornucleases,轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶）：一種人工核酸酶，是用于定向基因打靶的一種新技術(shù)，有轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（TALE）和核酸酶構(gòu)成。TALE蛋白中間含有一個(gè)重復(fù)區(qū)域，該區(qū)域由33‐35個(gè)氨基酸的重復(fù)單元組成。每個(gè)重復(fù)單元的氨基酸序列高度保守，除了第12位和13位的兩個(gè)氨基酸可變，即重復(fù)單元可變的雙氨基酸殘基（RVD）。TALE單體通過(guò)RVD識(shí)別DNA靶點(diǎn)上的堿基，有如下一一對(duì)應(yīng)關(guān)系：NI=A,HD=C,NG=T,NN=G/A。核酸酶（nucleases）:主要是FokI，一種IIS型的核酸內(nèi)切酶，具有特異的識(shí)別位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域(突變)和切割位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域，二聚化后才具有切割活性?；玖鞒蹋篴.確定靶點(diǎn)，選擇目標(biāo)基因外顯子中相隔17-18bp的兩段14-18bp序列作為靶點(diǎn)，靶點(diǎn)識(shí)別單元串聯(lián)b.TAL靶點(diǎn)識(shí)別域的克隆構(gòu)建c.將TAL靶點(diǎn)識(shí)別域克隆入特定的真核表達(dá)載體以表達(dá)重組核酸酶d.將重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入（卵）細(xì)胞e.篩選突變體6.CRISPR-Cas技術(shù)：一種來(lái)源是細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。CRISPR/CAS系統(tǒng)是一種廣泛存在于細(xì)菌與古細(xì)菌中的，由RNA介導(dǎo)的、可遺傳的獲得性免疫系統(tǒng)。這種免疫系統(tǒng)為宿主細(xì)胞提供了對(duì)外源DNA（如噬菌體、質(zhì)粒）的免疫功能。一個(gè)典型的CRISPR/CAS基因座由一個(gè)編碼Cas蛋白的操縱子以及一個(gè)重復(fù)擬間隔序列組成。重復(fù)擬間隔序列由多個(gè)相同的重復(fù)序列及穿插其間的間隔序列組成，間隔序列可以特異性地識(shí)別外源核酸。CRISPR（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，重復(fù)擬間隔序列）：是一個(gè)特殊的DNA重復(fù)序列家族,廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR位點(diǎn)通常由短的高度保守的重復(fù)序列(repeats)組成,重復(fù)序列的長(zhǎng)度通常21~48bp,重復(fù)序列之間被26~72bp間隔序列(spacer)隔開(kāi)。CRISPR就是通過(guò)這些間隔序列（space）與靶基因進(jìn)行識(shí)別。Cas（CRISPRassociated）：存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guideRNA引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與folk酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。CRISPR/CAS系統(tǒng)首先將外源核酸加工成一定長(zhǎng)度的間隔序列，進(jìn)而將這些間隔序列整合于其基因組中成簇的短回文重復(fù)序列中，形成規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPRs）。當(dāng)這些序列被轉(zhuǎn)錄并加工成成熟的crRNA時(shí)，便可以引導(dǎo)CAS蛋白對(duì)再次入侵的外源核酸進(jìn)行識(shí)別以及切割。第一步：間隔序列的獲得。當(dāng)細(xì)菌被外來(lái)的病毒或質(zhì)粒入侵時(shí)CRISPR/CAS系統(tǒng)能夠識(shí)別入侵者攜帶的外源核酸中的特殊片段（該特殊片段中存在原型間隔序列毗鄰基序，即PAM，并將PAM旁的原型間隔序列加工整合入自身基因組中的CRISPR序列中。第二步：Pre-crRNA的轉(zhuǎn)錄與加工。CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Pre-crRNA，之后tracerRNA與pre-crRNA結(jié)合形成雙鏈復(fù)合物。該復(fù)合物在Cas9的存在下，被雙鏈RNA特異的核糖核酸內(nèi)切酶切割，最終產(chǎn)生成熟的crRNAs。第三步：CRISPER系統(tǒng)對(duì)入侵核酸的切割。成熟的crRNA、tracerRNA與Cas9結(jié)合形成一個(gè)三元的沉默復(fù)合物。而后三元聚合體在crRNA的引導(dǎo)下與入侵的雙鏈DNA中目的序列進(jìn)行結(jié)合，由Cas9蛋白于原型間隔序列處進(jìn)行切割，導(dǎo)致入侵噬菌體或質(zhì)粒DNA降解。優(yōu)勢(shì)：只需合成一個(gè)sgRNA就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。編碼sgRNA的序列不超過(guò)100bp，因此比構(gòu)建TALENs和ZFNs更簡(jiǎn)單方便。較短的sgRNA序列也避免了超長(zhǎng)、高度重復(fù)的TALENs編碼載體帶來(lái)的并發(fā)癥。7.RNA干擾技術(shù)：是指細(xì)胞利用外源性或內(nèi)源性小干擾RNA激發(fā)相關(guān)的酶復(fù)合物，對(duì)同源性mRNA進(jìn)行切割、降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因表達(dá)。Dicer是RNaseIII家族中的一員，能特異識(shí)別雙鏈RNA，并以ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解19-21bp的雙鏈RNAs。RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體-RISC（RNA-inducedsilencingcomplex）：由核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、解旋酶等構(gòu)成，作用是對(duì)靶mRNA進(jìn)行識(shí)別和降解。第一步（起始階段）：dsRNA在ATP參與下被Dicer切割加工成21~23nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA（siRNA）。第二步（效應(yīng)階段）siRNA在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體RISC?；罨腞ISC在單鏈siRNA引導(dǎo)下識(shí)別互補(bǔ)的mRNA，并在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶進(jìn)步降解一步降解，從而干擾基因表達(dá)。重要特征：a.RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制；b.RNAi具有很高的特異性；c.只有dsRNA才能誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi；d.只有針對(duì)編碼區(qū)的dsRNA才能產(chǎn)生有效的和特異性的干擾；e.RNAi作用迅速，mRNA快速降解；f.RNAi效應(yīng)的依賴性，只有連續(xù)產(chǎn)生dsRNA才能產(chǎn)生長(zhǎng)期效應(yīng)，否則只產(chǎn)生短暫沉默反應(yīng)。siRNA設(shè)計(jì)原則：a.AA-N19設(shè)計(jì)原則:siRNA雙鏈設(shè)計(jì)時(shí)，一般在靶mRNA起始密碼下游100～200bp至翻譯終止密碼上游50～100bp的范圍內(nèi)搜尋AA序列，并記錄每個(gè)AA3’端相鄰19個(gè)核苷酸作為候選siRNA靶位點(diǎn)。b.建議設(shè)計(jì)的siRNA不要針對(duì)mRNA的5’和3’端非編碼區(qū)c.GC含量在30%‐50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。d.設(shè)定負(fù)對(duì)照。作為負(fù)對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒(méi)有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒(méi)有同源性。e.靶mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能對(duì)RISC復(fù)合物產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，影響siRNA的干擾活性，在設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該盡量避免。f.選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。g.最后還應(yīng)將候選siRNA序列在GenBank表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST檢索，確認(rèn)所設(shè)計(jì)siRNA序列的唯性一性，以避免沉默脫靶現(xiàn)象。脫靶(off-target)是指siRNA所引起的除目的序列以外的其它基因沉默的現(xiàn)象。siRNA制備：a.化學(xué)合成：最貴的方法，但是卻是最方便的，主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長(zhǎng)，特別是有特殊需求的。最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究。不適用于：篩選siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究，主要是價(jià)格昂貴。b.體外轉(zhuǎn)錄：以DNAOligo為模版，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對(duì)化學(xué)合成法而言比較低，而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學(xué)合成的siRNA量的1/10就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNA所能達(dá)到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。不適用于：實(shí)驗(yàn)需要大量的，一個(gè)特定的siRNA，長(zhǎng)期研究。c.長(zhǎng)片段dsRNAs經(jīng)RNaseIII類降解：選擇通常是200-1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長(zhǎng)片斷雙鏈dsRNA，然后用RNaseIII(orDicer)在體外消化，得到一眾siRNAs“混合雞尾酒”。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。優(yōu)點(diǎn)：可以跳過(guò)檢測(cè)和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時(shí)間和金錢。缺點(diǎn)：就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因。最適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型。不適用于：長(zhǎng)時(shí)間的研究項(xiàng)目，或者是需要一個(gè)特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療d.siRNA表達(dá)載體在細(xì)胞中表達(dá)形成shRNAs：siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長(zhǎng)期研究——帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。最適用于：已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默。不適用于：篩選siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測(cè)序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作）。e.siRNA表達(dá)框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)：是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無(wú)需事前克隆到載體中。最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子。不適用于：長(zhǎng)期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）。載體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA方法的特點(diǎn)：I.操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好;II.siRNA表達(dá)載體一旦構(gòu)建成功，可以無(wú)限制的應(yīng)用于研究;III.建立可以調(diào)節(jié)表達(dá)的系統(tǒng);IV.建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞常用方法：1）磷酸鈣轉(zhuǎn)染；2）電穿孔；3）脂質(zhì)體載體介導(dǎo)（目前用的較多）；4）顯微注射技術(shù)；5）DNA載體轉(zhuǎn)染；6）病毒siRNA效果檢測(cè)：可從mRNA和蛋白質(zhì)兩方面進(jìn)行1）mRNA：RT-PCR；實(shí)時(shí)定量PCR；Northern雜交等2）蛋白質(zhì)：Western雜交；ELISA；免疫熒光等應(yīng)用：a.探索基因功能：基因沉默的工具、RNA文庫(kù)的構(gòu)建b.基因治療領(lǐng)域：病毒性疾病的治療（HIV、肝炎）、遺傳性疾病的治療、腫瘤治療c.整形外科領(lǐng)域中的應(yīng)用：消除黑色素瘤d.藥物篩選中的應(yīng)用存在的問(wèn)題：a.siRNA導(dǎo)入體內(nèi)的效率低下，如何有效將siRNA轉(zhuǎn)移入體內(nèi)成為RNAi應(yīng)用的最大障礙；b.體內(nèi)RNA遞送的靶向性；c.如何在目的基因序列上選擇21-23nt左右的序列作為siRNA的模板，從目前的研究來(lái)看，序列的選擇原則尚不清楚；d.siRNA的穩(wěn)定性；e.脫靶效應(yīng)，尤其在多基因家族中的非特異性問(wèn)題。五、流式細(xì)胞術(shù)1.流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或顆粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞（或微粒）進(jìn)行快速多參數(shù)定性或定量檢測(cè)和分選的一種細(xì)胞分析技術(shù)。流式細(xì)胞儀（FlowCytometer）以流式細(xì)胞術(shù)為理論基礎(chǔ)，是集流體力學(xué)、激光技術(shù)、電子工程學(xué)、單克隆抗體技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)和計(jì)算機(jī)等學(xué)科知識(shí)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過(guò)熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選，能夠同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞表型、功能、蛋白表達(dá)、磷酸化現(xiàn)象等，是細(xì)胞研究的工具中唯一可以多角度，深層次剖析細(xì)胞。單個(gè)細(xì)胞分析，同時(shí)多參數(shù)分析，速度快-10000個(gè)細(xì)胞/秒，分選感興趣的細(xì)胞細(xì)胞不被破壞、測(cè)量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量2.工作原理：3.散射光的測(cè)定：細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍360°立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。前向散射光(forwardscatter,FSC)：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。側(cè)向散射光（sidescatter,SSC):激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90°角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性。4.樣品要求：?jiǎn)渭?xì)胞/顆粒懸液：細(xì)胞粘連可以導(dǎo)致檢測(cè)誤差；被檢細(xì)胞或顆粒大?。?.2-50μm(FACScalibur)由機(jī)器靈敏度和上樣針的直徑?jīng)Q定；樣品中至少20000個(gè)細(xì)胞，最適濃度105-107個(gè)/毫升。5.封閉Blocking：封閉以消除非特異性染色，提高目的蛋白的準(zhǔn)確性和降低背景Mouse：Ratserum（IgG）、FcBlock(CD16/CD32)6.抗體的選擇：1）滿足抗體選擇的基本條件：流式抗體本身也是抗體，所以首先要滿足抗體選擇的最基本條件：①目標(biāo)蛋白特異性：確定目的細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記或者胞內(nèi)標(biāo)記，知道要檢測(cè)什么；②嚴(yán)格按照樣本種屬來(lái)源進(jìn)行選擇，流式抗體基本無(wú)法進(jìn)行種屬交叉反應(yīng)；③可用于流式實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明書中明確標(biāo)注經(jīng)FC實(shí)驗(yàn)測(cè)試，最好有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖和用量說(shuō)明；④抗體克隆號(hào)一般不需要關(guān)注，有特殊需要的情況下可以參考文獻(xiàn)上提到的克?。煌豢贵w多個(gè)克隆號(hào)的情況下，可以選擇熒光標(biāo)記種類最多的那個(gè)克隆。2）確定流式細(xì)胞儀的參數(shù)配置：有幾個(gè)激發(fā)光？有幾個(gè)濾光片？也就是有幾個(gè)檢測(cè)通道。了解清楚儀器的具體型號(hào)，有助于再次確定檢測(cè)通道。3）熒光抗體的選擇建議：①盡量選擇直接標(biāo)記有熒光的抗體；②熒光本身有強(qiáng)弱之分，可視抗原表達(dá)強(qiáng)弱及分群情況選擇合適的熒光。常用熒光強(qiáng)弱排序?yàn)椋海≒E>APC>PE-cy5>Percp-cy5.5>FITC）；③可以嘗試選擇新型熒光AlexaFluor、eFluor等。因?yàn)檫@些熒光非常明亮，對(duì)激光穩(wěn)定性好，對(duì)PH值不敏感，具有水溶性。（如AlexaFluor488與FITC檢測(cè)通道相同，但是強(qiáng)度和淬滅時(shí)間上，前者明顯強(qiáng)于后者。4）多色熒光搭配的原則：①每個(gè)檢測(cè)通道只能選擇1種熒光素，各通道之間的熒光素可以隨意搭配；②所選各種熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少，否則將會(huì)導(dǎo)致補(bǔ)償難調(diào)。5）抗體劑量的確定：同一個(gè)產(chǎn)品通常會(huì)提供多個(gè)規(guī)格供您選購(gòu)，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體樣本量確定劑量：①通常情況下流式檢測(cè)一次的樣本量為1*106個(gè)細(xì)胞，流式抗體所說(shuō)的檢測(cè)用量都是以這個(gè)細(xì)胞數(shù)量為標(biāo)準(zhǔn)的，建議對(duì)樣本做細(xì)胞計(jì)數(shù)，以保證抗體標(biāo)記效果最佳；②以test為計(jì)量單位的抗體，按照總體積計(jì)算出每次加入多少ul抗體即可；③以u(píng)g為計(jì)量單位的抗體，需要根據(jù)說(shuō)明書每次抗體加入多少ug先算出能使用的次數(shù)，再通過(guò)總體積算出每次加入多少ul抗體7.對(duì)照設(shè)置：1）空白對(duì)照(negativecontrol)自發(fā)熒光/本底熒光對(duì)照未染色的細(xì)胞：以排除自發(fā)熒光的影響-自發(fā)熒光對(duì)照。2）同型/獨(dú)特性對(duì)照(isotypecontrol)抗體抗原之間是否是特異性結(jié)合，排除非特異結(jié)合：用與實(shí)驗(yàn)抗體相同種屬來(lái)源、相同劑量的抗體作為對(duì)照，消除抗體非特異性結(jié)合到組織細(xì)胞而產(chǎn)生的背景染色（Igisotypecontrol）3）補(bǔ)償對(duì)照多色分析時(shí)做每種熒光素單獨(dú)染色的細(xì)胞：細(xì)胞樣本分別用單獨(dú)的熒光抗體染色(Compensationcontrols)，來(lái)決定熒光重疊的水平，確定適合補(bǔ)償。4）陽(yáng)性對(duì)照(positivecontrol)確定操作過(guò)程的正確性8.熒光補(bǔ)償Compensation：利用電子技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號(hào)加以扣除的技術(shù)稱“熒光補(bǔ)償”所有補(bǔ)償調(diào)為“0”→調(diào)節(jié)電壓，用同型對(duì)照或陰性對(duì)照，使陰性群位于“左下角”→依單陽(yáng)群體調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償9.設(shè)門：用門選擇某一或某些特性（熒光特性或散射光特性）的細(xì)胞，對(duì)門內(nèi)的細(xì)胞群體作進(jìn)一步的分析，它是定性細(xì)胞亞群的重要方法。10.數(shù)據(jù)顯示方式：?jiǎn)螀?shù)直方圖(Histogram)：適用于單參數(shù)分析雙參數(shù)二維點(diǎn)圖(DotPlot)、等高線圖(ContourPlot)、密度圖(DensityPlot)：多參數(shù)分析11.應(yīng)用：表面標(biāo)志染色、胞內(nèi)因子染色12.流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選FluorescenceActivatedCellSorting：通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。它能夠在較短的時(shí)間內(nèi)從大量細(xì)胞群體中準(zhǔn)確挑選出目標(biāo)細(xì)胞。質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)（MassCytometry）：利用質(zhì)譜原理對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)的流式技術(shù)。六、細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)1.細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)：直接計(jì)數(shù)、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入法、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）檢測(cè)法、羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測(cè)法、MTT檢測(cè)法、CCK8、Ki672.直接計(jì)數(shù)：利用計(jì)數(shù)板或計(jì)數(shù)儀得出細(xì)胞的數(shù)目，然后對(duì)數(shù)目進(jìn)行比較。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單-不需要特定的試劑和儀器；準(zhǔn)確缺點(diǎn)：不適合樣品數(shù)量多的情況；不適合評(píng)估特定的亞群血球計(jì)數(shù)板：細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×1043.胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入法：胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，也是DNA合成的必需物質(zhì)。用同位素3H標(biāo)記TdR即3H-TdR作為DNA合成的前體能摻入DNA合成代謝過(guò)程，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度，可以反映細(xì)胞DNA的代謝及細(xì)胞增殖情況。結(jié)果判定：以液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定每分的脈沖數(shù)cpm。取各管測(cè)定讀數(shù)的平均值，即為0.1ml細(xì)胞的脈沖數(shù)。再按淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，校正成每百萬(wàn)淋巴細(xì)胞的脈沖數(shù)(cpm/106淋巴細(xì)胞)。也可以刺激指數(shù)（SI）表示試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)管脈沖數(shù)與對(duì)照管脈沖數(shù)之比，即為刺激指數(shù)。SI=試驗(yàn)孔A570nm均值/對(duì)照孔A570nm均值優(yōu)點(diǎn)：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強(qiáng)，重復(fù)性好。缺點(diǎn)：但需一定設(shè)備條件，同時(shí)還存在放射性核素污染問(wèn)題。4.5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)檢測(cè)法：Brdu是胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)加入，而后利用Brdu專一性抗體，顯示增殖細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色，可判斷增殖細(xì)胞的種類，增殖速度，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。優(yōu)點(diǎn)：不僅能用于體外實(shí)驗(yàn)，還能用于活體實(shí)驗(yàn)BrdU有一大缺點(diǎn)，就是需要變性DNA后才能與抗體結(jié)合，但這就破壞了DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，影響了其他染料的結(jié)合染色，導(dǎo)致染色彌散，準(zhǔn)確性降低等問(wèn)題。5.CFSE檢測(cè)法：CFSE是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有與細(xì)胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團(tuán)和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團(tuán)，使CFSE成為一種良好的細(xì)胞標(biāo)記物。CFSE進(jìn)入細(xì)胞后可以不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，CFSE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半。這樣，在一個(gè)增殖的細(xì)胞群中，各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度呈對(duì)遞減，利用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測(cè)通道可對(duì)其進(jìn)行分析。CFSE是一種很有價(jià)值的細(xì)胞標(biāo)記示蹤劑，不僅用于細(xì)胞增殖的體外實(shí)驗(yàn),也可用于追蹤細(xì)胞在體內(nèi)的分裂增殖過(guò)程。6.MTT檢測(cè)法：主要反映細(xì)胞的能量代謝，是檢測(cè)細(xì)胞增殖活力的一種簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的方法。其原理是在活細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖過(guò)程中，線粒體內(nèi)的脫氫酶可將黃色的MTT分解成蘭紫色的水不溶性的甲瓚(Formazan)，并沉積在細(xì)胞中，死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。7.CCK8檢測(cè)法：是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)方法。WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚產(chǎn)物formazan。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被廣泛用于些生物活性因子的一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等。優(yōu)點(diǎn)：a.使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；b.CCK-8法能快速檢測(cè)；c.CCK-8法的檢測(cè)靈敏度很高，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度；d.CCK‐8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT法；e.CCK-8法對(duì)細(xì)胞毒性??；f.CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑中為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開(kāi)即用。缺點(diǎn):a.與MTT法相比，CCK‐8的價(jià)格比較貴。b.CCK-8試劑的顏色為淡紅色,與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近,不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。8.Ki67染色法：增殖細(xì)胞核抗原(Ki-67)是1983年由Gerdes等發(fā)現(xiàn)在增殖細(xì)胞中表達(dá)的一種核抗原，是目前較為肯定的核增殖標(biāo)志物，只在增殖期表達(dá)(G1，S和G2/M期)，Go期缺失。與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)，預(yù)示將進(jìn)入分裂期的細(xì)胞數(shù)目。它在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中維持DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，在多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，其表達(dá)水平價(jià)細(xì)胞的增殖狀態(tài)可用于評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖狀態(tài)、腫瘤的生物學(xué)行為。Ki-67只與增殖細(xì)胞核反應(yīng)，而無(wú)組織特異性，其表達(dá)增強(qiáng)是細(xì)胞有絲分裂、增殖活性增強(qiáng)的一個(gè)可靠標(biāo)記，研究表明Ki-67的表達(dá)能可靠而迅速地反映惡性腫瘤增殖率。9.細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)：形態(tài)學(xué)檢測(cè)、AnnexinV、DNAFagmentation、TUNEL、線粒體膜電位、細(xì)胞色素C釋放、Caspase活性、凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)10.形態(tài)學(xué)檢測(cè)：1）光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡a.未染色細(xì)胞凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。b.染色細(xì)胞常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。2)熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：Hoechst33342，Hoechst33258，DAPI。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。3）透射電子顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞體積變小，表面微絨毛消失，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。11.AnnexinV/PI染色：凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。AnnexinV是一種Ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，AnnexinV具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對(duì)PS有高度的親和性。熒光染料PI（PropidiumIodide，碘化丙啶）是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)。它是一種溴化乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。盡管PI不能通過(guò)活細(xì)胞膜，但卻能穿過(guò)破損的細(xì)胞膜而對(duì)核染色。早期凋亡細(xì)胞：AnnexinV+PI-、晚期凋亡細(xì)胞：AnnexinV+PI+。PI或7AAD12.DNA片段化：凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180-200bpDNA片斷，而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)為無(wú)特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細(xì)胞的死亡，并可與壞死細(xì)胞區(qū)別。試劑盒檢測(cè)13.TUNEL檢測(cè)：細(xì)胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法。TUNEL技術(shù)的原理是染色體DNA斷裂時(shí)產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，而生物素或熒光素標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下?lián)饺氲紻NA的3'-末端，并通過(guò)一定的顯色系統(tǒng)使之顯示出來(lái)。凋亡產(chǎn)生斷裂的DNA→TdT酶標(biāo)記dUTP-Biotin→結(jié)合親和素-HRP→作用于底物DAB顯色14.線粒體膜電位：線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽(yáng)離子熒光染料如Rhodamine123、JC-1、TMRM等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。JC-1染料在正常細(xì)胞內(nèi)聚集在線粒體內(nèi)，形成多聚體，發(fā)紅色熒光；而在凋亡細(xì)胞內(nèi)，由于線粒體膜電位的破壞，不能聚集到線粒體內(nèi)，以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。15.細(xì)胞色素C釋放：用試劑盒抽提出線粒體組分和細(xì)胞質(zhì)組分，然后用細(xì)胞色素C的抗體進(jìn)行WesternBlot分析，可見(jiàn)細(xì)胞色素C有線粒體向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位。16.Caspase活性檢測(cè)：17.凋亡分析總體原則：1）因?yàn)榈蛲鍪嵌嘁蛩?、多通路參與的過(guò)程，不能根據(jù)單一指標(biāo)來(lái)判斷細(xì)胞凋亡；所以需進(jìn)行多指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)；2)由于凋亡細(xì)胞不同時(shí)間出現(xiàn)的凋亡事件不同；而每個(gè)指征維持有一個(gè)時(shí)間段，所以需要在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采樣，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；3）實(shí)驗(yàn)需要設(shè)定陽(yáng)性和陰性對(duì)照，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性。七、組織工程與干細(xì)胞工程1.修復(fù)缺損器官的方法：a.異體移植強(qiáng)免疫排斥反應(yīng)問(wèn)題，失敗率極高，加之異體器官來(lái)源有限，供不應(yīng)求。b.自體移植犧牲患者自己正常器官組織為代價(jià)。c.組織代用品人體相容性差，不能長(zhǎng)久使用，還易引起感染。2.組織工程：是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理,將人體某部分的組織細(xì)胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進(jìn)行人工培養(yǎng)繁殖、擴(kuò)增,然后移植到人體內(nèi)所需要的部位,從而達(dá)到器官修復(fù)或再造的治療目的的一種技術(shù)。3.組織工程的核心問(wèn)題是：應(yīng)用生命科學(xué)和工程技術(shù)的原理和方法，在細(xì)胞的體外培養(yǎng)過(guò)程中，誘導(dǎo)種子細(xì)胞定向分化、維持、調(diào)控乃至優(yōu)化這種分化，從而形成具有和在體組織相似功能的組織或器官。4.組織工程三個(gè)支柱：種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)支架5.組織工程的關(guān)鍵技術(shù)：a.組織構(gòu)成細(xì)胞的培養(yǎng)（種子細(xì)胞）b.生物材料及構(gòu)架制備c.生物組織工程化培養(yǎng)系統(tǒng)6.種子細(xì)胞：應(yīng)用組織工程的方法再造組織與器官所用的各類細(xì)胞統(tǒng)稱為種子細(xì)胞。種子細(xì)胞的培養(yǎng)是組織工程的基本要素，種子細(xì)胞研究的目的在于獲取足夠數(shù)量的細(xì)胞，同時(shí)保持細(xì)胞增殖、合成基質(zhì)等生物功能并防止細(xì)胞老化。組織工程種子細(xì)胞主要有三個(gè)來(lái)源：組織來(lái)源細(xì)胞：與缺損組織細(xì)胞同源的自體細(xì)胞組織特異干細(xì)胞：主要包括骨髓基質(zhì)干細(xì)胞等具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞及皮膚、肌肉前體細(xì)胞等具有定向分化潛能的專能干細(xì)胞;干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞7.生長(zhǎng)因子：細(xì)胞的增殖與分化由各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞調(diào)節(jié)，如表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、骨形成蛋白8.生物材料支架-細(xì)胞外基質(zhì)：要求生物相容性好，可以生物降解可降解高分子材料：PLA、PGA、PLGA等陶瓷類材料：多孔羥基磷灰石HA、磷酸三鈣等復(fù)合材料：將有機(jī)材料（PGA）與無(wú)機(jī)材料（HA）復(fù)合形成復(fù)合材料等生物衍生材料：生物組織經(jīng)過(guò)處理后獲得的材料稱為生物衍生材料。來(lái)源于人體的生物衍生材料保留了正常的網(wǎng)架結(jié)構(gòu),組織相容性好,是較為理想的組織工程支架材料。如膠原凝膠、脫細(xì)胞真皮構(gòu)建組織工程皮膚,纖維蛋白凝膠構(gòu)建組織工程軟骨等。9.組織構(gòu)建的三種方式：體內(nèi)構(gòu)建：種子細(xì)胞與生物材料復(fù)合后，組織尚未完全形成“成熟”時(shí)即植人體內(nèi)，組織形成與生物材料降解在體內(nèi)完成；體外構(gòu)建：在體外擬體內(nèi)環(huán)境，應(yīng)用生物反應(yīng)器形成組織與器官；原位組織構(gòu)建：?jiǎn)渭冎踩肷锊牧现Ъ苡隗w內(nèi)組織缺損部位，依靠周圍組織細(xì)胞遷移并粘附于生物材料支架，形成并再生組織，這種方式并非經(jīng)典的組織工程概念。根據(jù)所構(gòu)建組織的結(jié)構(gòu)與功能的不同，組織構(gòu)建的研究主要可劃分為兩個(gè)領(lǐng)域：（1）結(jié)構(gòu)復(fù)雜并具有不同代謝功能器官的組織構(gòu)建研究，如肝臟、腎臟、心臟等復(fù)雜器官的組織構(gòu)建。（2）結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單不執(zhí)行或僅執(zhí)行簡(jiǎn)單代謝功能的結(jié)構(gòu)性組織的組織工程化構(gòu)建研究，如：骨、軟骨、肌腱、神經(jīng)等組織的構(gòu)建。10.干細(xì)胞（Stemcell）即起源細(xì)胞，是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。11.干細(xì)胞的主要特征：形態(tài)特征和生化特征形態(tài)特征:圓形或橢圓形；生化特征:較高的端粒酶活性。增殖特征：緩慢性：增殖緩慢,機(jī)體需要時(shí)進(jìn)入分化有利于干細(xì)胞對(duì)特定的外界信號(hào)做出反應(yīng)，以決定進(jìn)行增殖還是進(jìn)入特異的分化程序；緩慢增殖使干細(xì)胞有充足的時(shí)間發(fā)現(xiàn)和糾正復(fù)制錯(cuò)誤，避免自我突變，穩(wěn)步進(jìn)入特定的分化程序。自穩(wěn)性：穩(wěn)定增殖(區(qū)別與腫瘤細(xì)胞的本質(zhì)特征)，維持自身數(shù)目的恒定干細(xì)胞維持自穩(wěn)性的機(jī)制：不對(duì)稱分裂分化特征：全能性或多潛能性全能干細(xì)胞(Totipotentstemcell)具有形成完整個(gè)體的分化潛能，如受精卵多能干細(xì)胞(pluripotentstemcell)具有分化出多種細(xì)胞組織的潛能，如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞。單能干細(xì)胞(multipotentstemcell)只能向一種或兩種密切相關(guān)的細(xì)胞類型分化，如神經(jīng)元干細(xì)胞只能分化成神經(jīng)元12.按發(fā)育階段：胚胎干細(xì)胞（Embrionicstemcells,ES）來(lái)源于受精5~7天的胚泡，全能性胚胎生殖干細(xì)胞（Embryonicgermcells,EG）受精后4-9周，多能性成體干細(xì)胞（Adultstemcells,AS）來(lái)源于機(jī)體成熟組織器官中的未分化細(xì)胞，多能/單能13.胚胎干細(xì)胞：從胚胎著床前胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)分離的一種全能性細(xì)胞，可以分化成任何一種組織類型的細(xì)胞。14.胚胎干細(xì)胞的特點(diǎn)：ES細(xì)胞具有早期胚胎細(xì)胞的特性：形態(tài)特征-體積小、核大，有一個(gè)或多個(gè)核仁；胚胎干細(xì)胞克隆緊密堆積，無(wú)明顯的界限，形似鳥巢生化特征-具有堿性磷酸酶和端粒酶活性；表達(dá)SSEA