細胞間粘附分子1Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白的表達、分離與純化的開題報告

細胞間粘附分子1Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白的表達、分離與純化的開題報告一、研究背景細胞間粘附分子（intercellularadhesionmolecule，ICAM）是一組膜蛋白質(zhì)，參與細胞間黏附的調(diào)控，被廣泛應用于細胞診斷、治療等領(lǐng)域。ICAM分子包括ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3，其中ICAM-1是由于其在炎癥過程中的重要性而最為廣泛地研究和應用。ICAM-1在炎癥反應中參與免疫細胞與上皮細胞的黏附和遷移，受到多種外界刺激的調(diào)節(jié)。因此，ICAM-1是一種非常重要的研究對象?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)表明，ICAM-1的功能區(qū)分為N端、D1、D2和膜區(qū)，不同功能區(qū)分別與免疫細胞、細胞外基質(zhì)等分子發(fā)生作用。因此，對ICAM-1功能區(qū)蛋白的表達、分離與純化是進行其研究的基礎(chǔ)。但是，迄今為止，ICAM-1的表達、分離與純化還不夠完善。因此，本研究將對細胞間粘附分子1Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白的表達、分離和純化方法進行探究和優(yōu)化，以期能夠得到高效且純度較高的目標蛋白質(zhì)。二、研究內(nèi)容和方法1.表達ICAM-1功能區(qū)蛋白的重組質(zhì)粒的構(gòu)建采用RT-PCR技術(shù)從人體靜脈內(nèi)皮細胞中獲取ICAM-1的cDNA序列，設計適合亞克隆到重組質(zhì)粒中的引物，利用接頭PCR擴增ICAM-1功能區(qū)的編碼序列，將擴增產(chǎn)物克隆入攜帶His-Tag的基因表達載體中，構(gòu)建表達ICAM-1功能區(qū)蛋白的重組質(zhì)粒。2.細胞的轉(zhuǎn)染和蛋白的表達利用文獻報道的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CHO細胞中，通過Westernblotting和間接免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測ICAM-1功能區(qū)蛋白的表達情況。優(yōu)化合適的細胞培養(yǎng)條件和誘導時間，提高蛋白表達的效率。3.蛋白的分離和純化分別采用尿素-SDS凝膠和酰胺-SDS凝膠對過表達的ICAM-1功能區(qū)蛋白進行分離，優(yōu)選酰胺-SDS凝膠對目標蛋白進行分離。對目標蛋白進行不同濃度尿素溶液或甲醇/乙醇添加物處理的方法進行去鹽、去內(nèi)源性蛋白和去異物蛋白，以及純化方法的優(yōu)化，使用親和層析柱以保障蛋白純度。三、研究意義和預期結(jié)果本研究將對ICAM-1功能區(qū)蛋白的表達、分離與純化方法進行優(yōu)化，以期獲得較高純度的蛋白質(zhì)，有望在研究ICAM-1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與調(diào)控機制等方面提供一個有效的工具。同時，也為ICAM-1蛋白質(zhì)在臨床醫(yī)學中的應用提供科學依據(jù)。預期結(jié)果：1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒并實現(xiàn)了ICAM-1功能區(qū)的表達。2.針對ICAM-1功能區(qū)蛋白的分離實驗，分離純得較高的蛋白樣品，并優(yōu)化分離方法。3.成功應用親和層析柱純化ICAM-1功能區(qū)蛋白和比較不同純化方案的差異。4.獲得高效純凈的ICAM-1功能區(qū)蛋白樣品，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。四、研究進展和難點1.已利用RT-PCR技術(shù)成功擴增出ICAM-1功能區(qū)的編碼序列。2.已成功構(gòu)建ICAM-1功能區(qū)蛋白的表達載體，過表達的蛋白樣品取得的