大果沙棘黃酮對四氧啶誘導糖尿病小鼠血糖水平的影響

大果沙棘黃酮對四氧啶誘導糖尿病小鼠血糖水平的影響

糖尿病患者對胰島素的分泌能力和身體對胰島素的敏感性逐漸降低，血糖增加是糖尿病的主要原因。攝入高熱量及高脂肪、高蛋白等結構不合理飲食會導致肥胖,隨著體重的增加及缺乏運動,胰島素抵抗會進行性加重,也會導致胰島素分泌缺陷和Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生。糖尿病并發(fā)癥是一種常見的慢性并發(fā)癥,是由糖尿病病變轉變而來,會引起一系列常見糖尿病并發(fā)疾病癥狀如:腎功能衰竭、失明、腦血管病變、心臟病等,甚至危及生命。但目前降血糖的化學藥品由于其毒副作用大,不宜長期服用,并且常伴隨不適癥狀發(fā)生。所以開發(fā)自然資源,研究中醫(yī)藥治療和改善血糖變化,預防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生有十分重要的臨床意義。目前,已有研究表明,黃酮類化合物對ALX誘導的糖尿病動物血糖、血脂具一定的降低作用,對糖尿病和高血脂并發(fā)癥的治療有一定功效。且現(xiàn)研究報道中發(fā)現(xiàn)大果沙棘(Hippophaerhamnoidesvar.sp)果中含有大量的生物活性物質(zhì),包括黃酮、多酚、類胡蘿卜素、有機酸、脂類等,其主要活性成分為沙棘黃酮,此活性因子使其具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、保肝、抑菌、保護心血管系統(tǒng)等生理功能,且具有很好的預防治療糖尿病及其并發(fā)癥的功效。為了深入探討黃酮類化合物對糖尿病小鼠血糖的影響情況,本研究選擇大果沙棘為研究對象,用四氧嘧啶(Alloxan,ALX)誘導建立糖尿病小鼠模型,研究大果沙棘總黃酮及各流份段黃酮對ALX糖尿病鼠血糖的對比影響,通過灌胃小鼠大果沙棘總黃酮BFH及各流段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ與模型組作比較,研究大果沙棘不同組分黃酮對機體血糖影響情況,以期為揭示大果沙棘黃酮的降血糖作用提供參考。1材料和方法1.1試劑與儀器大果沙棘果渣由黑龍江省孫吳縣林業(yè)局提供;四氧嘧啶(ALX)Sigma公司;麥芽糖酶(CAT)試劑盒、尿素氮(BUN)試劑盒、肝(肌)糖元(glycogen)試劑盒、胰島素(insulin)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供;昆明小鼠清潔級,雄性,體質(zhì)量(25±2.0)g,由黑龍江省腫瘤醫(yī)院提供,小鼠預先分籠飼養(yǎng),室溫(22±1.0)℃,相對濕度60%±5.0%。722s可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司;NDJ-1電熱恒溫水浴鍋北京醫(yī)療電子儀器廠;R-205B旋轉蒸發(fā)儀上海申勝儀器公司;FJ-200高速萬能粉碎機天津泰斯特儀器公司;TDL-5臺式離心機上?？婆d儀器有限公司;WI305227血糖儀北京東儀科技有限公司;Model550酶標儀美國Bio-Rad公司。1.2大果沙棘總黃酮的制備1.2.1大果沙棘果渣黃酮提取純化室將大果沙棘果渣于40℃下烘干,粉碎過40目篩。稱取相應質(zhì)量的大果沙棘果渣利用超臨界CO2萃取系統(tǒng)將其進行脫脂處理,再用70%乙醇進行提取。充分攪拌后,采用超聲功率120W超聲輔助提取3次,每次超聲時間1h,每隔30min振蕩一次,將提取得到的黃酮浸提液經(jīng)離心、過濾、濃縮、冷凍干燥,得到大果沙棘黃酮粗提物即SBPF。將SBPF粗提取物采用型號為X-5大孔樹脂動態(tài)吸附層析,吸附達到飽和后用70%乙醇溶液洗脫處理,再經(jīng)濃縮、凍干處理后得到實驗所需的大果沙棘總黃酮(BFH)。經(jīng)過上述一系列實驗處理后,再進行二次洗脫操作處理收集洗脫液,經(jīng)紫外掃描,將掃描峰形一致的洗脫液合并收集,得到大果沙棘黃酮三段流份,分別為BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ。1.2.2ALX誘導糖尿病小鼠模型的建立將小鼠先放入動物室內(nèi)適應性喂基礎飼料觀察7d,禁食12h,自由飲水。用滅菌生理鹽水配制2%ALX溶液,每只小鼠選用100mg/kg·bw劑量一次性腹腔注射ALX制作糖尿病小鼠模型。注射72h后,尾靜脈采血,測定禁食12h后空腹血糖值,選取空腹血糖值大于11.10mmol/L的小鼠為模型小鼠。1.2.3動物分組與處理選取體重(25±2)g的小鼠200只,按沙棘黃酮流份不同將小鼠平均分為四大組,每大組平均分為五小組,即基礎對照組、模型對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組,每小組10只小鼠。低、中、三個劑量組是按沙棘黃酮人體推薦攝入量、人體推薦攝入量的10、20倍分為低(2.0g/kg·bw)、中(20g/kg·bw)、高(40g/kg·bw)劑量組。小鼠糖尿病模型成功建立后,開始灌胃沙棘總黃酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ組分,灌胃劑量分別為2.0、20、40mg/(kg·bw·d)。給藥組每天灌胃給藥一次,正常小鼠對照組和模型組每天灌胃等體積生理鹽水,連續(xù)4周。每天測體重一次。每周測血糖一次,并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整灌胃量,灌胃期間小鼠自由取食和飲水。灌胃4周后,禁食12h,眼球采血、常規(guī)操作分離血清,再分別測定Insulin、BUN含量及麥芽糖酶活力;解剖取肝臟和肌肉制成組織勻漿,分別測定肝(肌)糖元含量。1.2.4指標的測定以上測定指標均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。2結果與分析2.1降血糖功能檢測結果實驗進行總黃酮及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組灌胃4周后對ALX糖尿病小鼠血糖的影響對比研究?？傸S酮BFH及各流份段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量對ALX糖尿病小鼠血糖的影響結果,見圖1。圖1結果顯示,BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組小鼠的血糖測量值都極顯著(p<0.01)低于模型組,且各劑量組之間降血糖功能差異顯著,BFH各劑量組降血糖功能要略優(yōu)于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組,并呈一定的量效關系。從圖1中可以看出,BFHⅢ各劑量組與模型組相比,均極顯著降低(p<0.01)。但BFH、BFHⅠ、及BFHⅡ高劑量組的血糖值比模型組均顯著(p>0.05)降低,且分別降低了58.35%、54.01%及52.73%。BFHⅢ高劑量組與模型組血糖值比較降低了36.95%,作用效果較BFH、BFHⅠ及BFHⅡ高劑量組略差。以上結果表明,在一定范圍內(nèi),BFH、BFHⅠ及BFHⅢ各灌胃組隨劑量的增加,血糖值變化呈下降趨勢,BFHⅡ劑量組變化不顯著(p>0.05),即對血糖調(diào)節(jié)作用效果越好,表明大果沙棘黃酮對糖尿病小鼠具有一定的血糖調(diào)節(jié)功能。2.2對小鼠中inin測量的影響實驗進行總黃酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組灌胃4周后對ALX糖尿病小鼠Insulin的影響對比研究?？傸S酮BFH及各流份段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量對ALX糖尿病小鼠Insulin的影響結果,見圖2。圖2結果顯示,BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組小鼠的Insulin測量值都極顯著(p<0.01)高于模型組,且各劑量組之間對Insulin的調(diào)節(jié)作用存在差異性。在一定劑量范圍內(nèi),隨著,BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量灌胃劑量的增加,調(diào)節(jié)能力增強,且增加的幅度不明顯。即BFH各劑量組調(diào)節(jié)Insulin水平的能力要低于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組,并呈一定的量效關系。從圖2中可以看出,以高劑量組為例,BFH比模型組升高了63.15%,BFHⅠ比模型組升高了50.27%,BFHⅡ比模型組升高了47.78%,BFHⅢ比模型組升高了70.96%。表明大果沙棘黃酮各劑量組對糖尿病小鼠的Insulin水平具有一定的調(diào)節(jié)功能。2.3灌胃對bun的影響實驗進行總黃酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組灌胃4周后對ALX糖尿病小鼠BUN的影響對比研究?？傸S酮BFH及各流份段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量對ALX糖尿病小鼠BUN的影響結果,見圖3。圖3結果顯示,BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組小鼠的BUN測量值都顯著(p<0.01)低于模型組,除BFHⅢ各劑量組之間調(diào)節(jié)BUN能力的變化趨勢降不明顯外,其他BFH和BFHⅠ、BFHⅡ各組均隨著灌胃劑量的增加,BUN調(diào)節(jié)能力有所增強。從圖3中可以看出,BFH低劑量組與BFHⅠ、BFHⅢ低劑量組對BUN調(diào)節(jié)水平的能力幾乎相同,而BFHⅡ中、高劑量組卻優(yōu)于BFHⅠ、BFHⅢ中、高劑量組,BFHⅡ各劑量組是BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組中作用效果最顯著的,且BFHⅡ中、高劑量組是與模型組比較分別降低了31.97%,42.15%。且BFH和BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各組中模型組小鼠的BUN與模型對照組小鼠的BUN存在顯著(p<0.05)差異,說明小鼠腎臟已經(jīng)有一定的損傷。以上結果表明,在一定范圍內(nèi),BFH、BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各灌胃組均對四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠BUN有一定的調(diào)節(jié)作用,說明大果沙棘黃酮對腎臟損傷小鼠具有一定的修復作用。2.4酮bfh對alx小鼠麥芽糖酶的影響實驗進行總黃酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組灌胃4周后對ALX糖尿病小鼠麥芽糖酶的影響對比研究。總黃酮BFH及各流份段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量對ALX糖尿病小鼠麥芽糖酶的影響結果,見圖4。由圖4可見,BFH與BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ均可提高糖尿病小鼠的麥芽糖酶的水平,并且隨著各組劑量的增加,調(diào)節(jié)能力增強,且BFH各劑量對糖尿病小鼠的麥芽糖酶的調(diào)節(jié)能力明顯優(yōu)于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ對應的各劑量組。以高劑量組為例,分別比模型組升高了37.69%、69.09%、72.36%、95.96%。2.5模型小鼠肝糖元和肌糖元的調(diào)節(jié)能力實驗進行總黃酮BFH及BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組灌胃4周后對ALX糖尿病小鼠肝糖元的影響對比研究?？傸S酮BFH及各流份段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量對ALX糖尿病小鼠肝糖元及肌糖元的影響結果,見圖5。由圖5可見,BFH與BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組,對ALX糖尿病小鼠的肝糖元和肌糖元均具有一定的調(diào)節(jié)作用,并且隨著劑量的增加,調(diào)節(jié)能力增強,肝(肌)糖元的含量呈上升趨勢。BFH對增強肝糖元的能力要優(yōu)于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ。以高劑量組為例,分別比模型組提高了89.62%、73.68%、57.89%和35.08%。對肌糖元的調(diào)節(jié)能力以高劑量組為例,分別比模型組高1.17倍,1倍,73%和60%。BFH對增強肌糖元的能力要優(yōu)于BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ,這與對肌糖元的影響效果趨勢是一致的。表明BFH與BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ各劑量組對ALX誘導的糖尿病小鼠具有一定的改善作用。3大果沙棘總黃酮bfh對小鼠血糖的影響糖尿病主要由胰島素分泌的絕對或相對缺乏所引起。ALX是一種特異性的胰島B細胞毒劑,對胰島B細胞具有細胞毒作用,導致胰島素分泌不足而誘發(fā)糖尿病。并在體內(nèi)可選擇性被胰腺B細胞吸收,激活自由基鏈式反應產(chǎn)生過量的自由基。過量自由基能夠直接破壞B細胞的結構,導致胰島B細胞的損傷和壞死,胰島素水平降低而出現(xiàn)高血糖等糖尿病癥狀。本實驗通過四氧嘧啶誘導建立糖尿病小鼠模型,ALX誘導的糖尿病模型成功后,研究了大果沙棘總黃酮BFH及各流份段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ對糖尿病小鼠血糖的調(diào)節(jié)作用。結果表明,模型組小鼠血糖與正常組比較,血糖明顯升高且穩(wěn)定,表明ALX誘導的糖尿病模型具有一定的穩(wěn)定性。綜上,通過對相關測定指標血糖值、Insulin、BUN、麥芽糖酶及肝糖元和肌糖元的相關分析,實驗驗證了大果沙棘黃酮對ALX所致胰島β細胞的損傷有一定的保護作用,BFH和各流份段黃酮BFHⅠ、BFHⅡ、BFHⅢ均可以顯著(p<0.05)提高ALX糖尿病小鼠的血清胰島素水平,對腎功能損害也有一定的修復作用,表明大果沙棘黃酮對腎臟也具有一定的保護作用,對脂質(zhì)代謝異常有一定的糾正修復功能,本研究結果與現(xiàn)有同類天然植物多酚研究如葛雷的蘋果渣多酚及賈仁勇等