基因克隆、表達(dá)技術(shù)在遺傳育種中的應(yīng)用

基因克隆、表達(dá)技術(shù)在遺傳育種中的應(yīng)用

基因是細(xì)胞內(nèi)dna分子具有遺傳效應(yīng)的特定鈉序列的總稱，是具有遺傳效應(yīng)的dna分子的片段。基因控制蛋白質(zhì)合成,是不同物種以及同一物種的不同個體表現(xiàn)出不同的性狀的根本原因,即所謂“種瓜得瓜,種豆得豆”,“一母生九子,九子各不同”。基因通過DNA復(fù)制及細(xì)胞分裂把遺傳信息傳遞給下一代,并通過控制蛋白質(zhì)的合成使遺傳信息得到表達(dá)?；蚩寺〖夹g(shù)包括了一系列技術(shù),它大約建立于20世紀(jì)70年代初期。美國斯坦福大學(xué)的伯格(P.Berg)等人于1972年把一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后,再用DNA連接酶把這2種DNA分子連接起來,于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子,從此產(chǎn)生了基因克隆技術(shù)。1973年,科恩(S.Cohen)等人把一段外源DNA片段與質(zhì)粒DNA連接起來,構(gòu)成了一個重組質(zhì)粒,并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌,第一次完整地建立起了基因克隆體系。因克隆程序可概括為:分、切、連、轉(zhuǎn)、選。“分”是指分離制備合格待操作的DNA,包括作為運(yùn)載體的DNA和欲克隆的目的DNA片段;“切”是指用序列特異的限制性內(nèi)切酶切開載體DNA,或者用物理方法切割載體DNA,從而得到目的基因;“連”是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來,形成重組的DNA分子;“轉(zhuǎn)”是指通過特殊的方法將重組的DNA分子送入宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增;“選”則是從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的個體。因此基因克隆、表達(dá)技術(shù)又稱為分子克隆、基因的無性繁殖、基因操作、重組DNA技術(shù)以及基因工程等。它最基本的特點(diǎn)是分子水平上的操作和細(xì)胞水平上的表達(dá)?；蚩寺〉姆椒ㄓ幸韵聨追N:1鳥槍法“鳥槍法”是一種由生物基因組提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超聲波等)或酶化學(xué)方法(如限制性內(nèi)切核酸酶)將生物細(xì)胞染色體DNA切割成為基因水平的許多片段,繼而將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合,將重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增,獲得無性繁殖的基因文庫,再結(jié)合篩選方法,從眾多的轉(zhuǎn)化子菌株中選出含有某一基因的菌株,從中將重組的DNA分離、回收。這種方法可以說是利用“溜散彈射擊”原理去“命中”某個基因。由于目的基因在整個基因組中太少太小,在相當(dāng)程度上還得靠“碰運(yùn)氣”,所以人們稱這個方法為“鳥槍法”或“散彈槍”實(shí)驗(yàn)法。鳥槍法也有很大的局限性,真核生物基因大都由有編碼功能的序列———外顯子和無編碼功能的序列———內(nèi)含子,兩者比例為1∶4構(gòu)成。因?yàn)橛袃?nèi)含子的存在,這樣獲得的結(jié)構(gòu)基因不宜在原核宿主組織中表達(dá)。所以,要獲得真核生物的目的基因,準(zhǔn)確的說要獲得真核生物目的基因的編碼序列,不宜用“鳥槍法”。2庫法2.1般操作程序基因組文庫法是一種直接從基因組中分離目的基因的方法。所謂基因組文庫(genelibrary或genebank),是指匯集某一基因組所有DNA序列的重組DNA群體。高等真核生物染色體基因組文庫通常是以λ噬菌體作為載體構(gòu)建的,有時也可以柯斯質(zhì)粒作為載體構(gòu)建。利用λ噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的一般操作程序如下:(1)選用識別序列均為4個核苷酸的2種限制性內(nèi)切核酸酶,對從某一高等真核生物組織細(xì)胞中提取的染色體基因組DNA進(jìn)行部分酶解,得到10~30kb的DNA限制性片段,利用凝膠電泳法等從中分離出大小為20kb左右的隨機(jī)片段群體。(2)選用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶酶解λ噬菌體載體DNA。(3)經(jīng)適當(dāng)處理,將基因組DNA限制性片段與λ噬菌體載體進(jìn)行體外重組。(4)利用體外包裝系統(tǒng)將重組體包裝成完整的顆粒。(5)以重組噬菌體顆粒侵染大腸桿菌,形成大量噬菌斑,從而形成含有整個DNA的重組DNA群體,即文庫。具備了文庫,就可以用適當(dāng)?shù)哪康幕蚱巫魈结?利用高密度的噬菌斑或菌落原位雜交技術(shù),從大量的噬菌斑或菌落中篩選出含有目的基因的重組體的噬菌斑或菌落,再經(jīng)過擴(kuò)增提取其中的重組體,最后即可獲得所需要的目的基因片段。2.2cd-na信息庫的構(gòu)建方法所謂cDNA文庫,是指匯集以某生物成熟mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄而成的cDNA序列的重組DNA群體。這種方法比基因組文庫法簡單,工作量較少,不包括內(nèi)含子,以真核生物成熟mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄而成的cDNA可被大腸桿菌表達(dá)。因此,在基因工程中,cDNA文庫法是從真核生物細(xì)胞中分離目的基因的常用方法。cD-NA文庫通常以λ噬菌體和質(zhì)粒作為載體構(gòu)建。構(gòu)建cD-NA文庫的一般操作程序如下:(1)總RNA的提取。(2)mRNA的分離。(3)cDNA雙鏈的合成。(4)cDNA與載體的連接。(5)噬菌體的包裝及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化,形成大量噬菌班或菌落,從而形成以某生物成熟mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄而成的cDNA序列的重組DNA群體即cDNA文庫。同樣,具備了cDNA文庫,就可以用適當(dāng)?shù)哪康幕蚱巫魈结?利用高密度的噬菌斑或菌落原位雜交技術(shù),從大量的噬菌斑或菌落中篩選出含有目的基因的重組體的噬菌斑或菌落,再經(jīng)過擴(kuò)增,提取其中的重組體。最后即可獲得所需要的目的基因片段。采用cDNA克隆策略已經(jīng)到許多種子貯藏蛋白基因,激素或環(huán)境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因,國內(nèi)利用免疫的天麻抗真菌蛋白作探針,通過免疫雜交篩選技術(shù),從表達(dá)載體構(gòu)建天麻的cDNA文庫,篩選出天麻抗真菌蛋白基因。2.3rt-pcr檢測電子克隆法是利用目的基因在其他生物中的同源基因?qū)δ康幕蛩谏锏腅ST庫通過序列比對進(jìn)行篩選,如果能夠得到相似性比較高的EST序列,根據(jù)這些EST序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR或RT-PCR,就可以得到目的基因片段或全長cDNA,然后通過染色體步移或RACE分別得到全長基因或cDNA。功能克隆法就是根據(jù)目標(biāo)性狀的基本生化特性這一功能信息,在鑒定基因的功能后進(jìn)行克隆。其具體作法是:在純化相應(yīng)的編碼蛋白后構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫,DNA文庫中基因的篩選根據(jù)情況可采用不同的辦法進(jìn)行。這2種方法都是從文庫法里引申發(fā)展而來的。3pcr擴(kuò)增法當(dāng)已知目的基因的序列時,通常利用PCR(PolymeraseChainReaction,即多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)來分離目的基因。PCR技術(shù)是1985年由美國Cetus公司開發(fā)的專利技術(shù),它能快速、簡便地體外擴(kuò)增特定的DNA片段,具有高度的專一性和靈敏度。而一些改進(jìn)的PCR法可用于一些未知核苷酸序列核酸片段的特異擴(kuò)增。這是一種參考已知基因的序列克隆基因的方法。目前已經(jīng)知道了很多植物基因的序列,當(dāng)克隆類似基因時可先從Genebank庫中找到有關(guān)基因序列,用PCR方法克隆到不同植物的基因。但是對于只知道功能,查不到已知類似序列的基因,這一方法就無能為力。此方法簡便快速,尤其適于國內(nèi)實(shí)力不足,分離一些重要基因起步較晚的情況下,常用此方法克隆目的基因。國內(nèi)利用此方法已經(jīng)克隆到豌豆外源凝集素基因,酵母超氧化物歧化酶基因、水稻富硫10KD醇溶蛋白基因。PCR擴(kuò)增法的一般操作程序如下:(1)目的基因序列的擴(kuò)增。如果目的基因序列已知,就可以通過設(shè)計引物進(jìn)行PCR;未知基因序列時,可以經(jīng)過Genebank根據(jù)保守序列設(shè)計引物擴(kuò)增。(2)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化、重組、篩選。4合成基因的研究和應(yīng)用對于堿基較少的基因,可以利用核酸合成儀直接合成基因。對于分子量較大的基因,則必需分多段合成后,再將其連接成一個整體來合成基因,工作量大大增加。如蜘蛛毒素這樣的小肽,它只有37個氨基酸,采用人工合成的辦法就較為合適,體外實(shí)驗(yàn)表明它能殺死多種對農(nóng)作物有害的昆蟲,蔣紅等1995年根據(jù)蜘蛛毒素的氨基酸序列,采用植物偏愛密碼子、人工合成并克隆了此毒蛋白的基因。此外,在醫(yī)藥領(lǐng)域,也有不少人工合成基因的成功事例?；蚧瘜W(xué)合成是一個功能強(qiáng)大的工具,可以用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究和生物科技應(yīng)用領(lǐng)域。在過去的30a中,取得了較大的進(jìn)展,已經(jīng)取得了一定的DNA序列的化學(xué)合成的碎片,從基因序列小于1kb到大于30kb。需要一種簡單,重現(xiàn)性好,成本效益較好的方法,保證成功制備理想的基因,許多PCR方法和基于非聚合酶循環(huán)反應(yīng)(PCA)的策略已經(jīng)開發(fā)為化學(xué)基因的合成。5ssr-pcr的應(yīng)用抑制性差減雜交(Suppressionsubtractivehybridization,SSH)是一種用于分離在特定組織、特定發(fā)育階段或特定環(huán)境下表達(dá)的基因的方法。它是在差減雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的,應(yīng)用2次差減雜交和2次PCR,克服了差減雜交中難以克隆低豐度mRNA的缺點(diǎn)。SSH技術(shù)不需要目的基因的序列信息和位置信息,已在小麥基因克隆中得到了廣泛應(yīng)用。Snowden和Cardner、王轉(zhuǎn)、駱蒙、YAO等分別在小麥根系、幼苗、抗病及雜種優(yōu)勢方面做了很深入的研究。應(yīng)用抑制性差減雜交技術(shù),可以有效分離出差異表達(dá)基因,為從整體水平研究基因的差異表達(dá)情況,進(jìn)行大規(guī)模、高通量的基因功能研究提供了有效的技術(shù)支持。該方法操作相對簡單,是目前大批量研究差異表達(dá)基因的適用方法。SSH技術(shù)有一些局限性,它只能用于2個樣本的比較,只能篩選在對照樣本中不表達(dá)的基因,不能反應(yīng)表達(dá)量的差別。6圖譜克隆與其他基因型的分子標(biāo)記的區(qū)別基因圖位克隆(Map-basedcloning)是一種用于分離編碼產(chǎn)物未知的目的基因的有效方法。成功應(yīng)用圖位克隆有2個必要條件:一是需要構(gòu)建一個含有大片段DNA的基因組文庫,如BAC、YAC等;二是要有可用的與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。圖位克隆法是植物獲得功能基因的非常有效的方法,許多重要的基因都是通過該方法獲得的。圖譜克隆在蘋果中也有了相當(dāng)大的成績,識別和描述的靶基因,特別是那些控制疾病和害蟲的阻力都有突破。在水稻里,通過圖譜克隆法推斷出Skp1蛋白酶與耐冷啟動相關(guān)。圖譜克隆已經(jīng)被廣泛地使用在識別基因,如擬南芥表型突變,特別是通過EMS或快中子突變誘導(dǎo)的突變。圖譜克隆的成功依賴于分子標(biāo)記的可用性,區(qū)分多態(tài)性在兩個擬南芥指標(biāo)。與圖位克隆法相似的還有定位克隆,明確蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)定位對了解蛋白質(zhì)的功能有很強(qiáng)的提示作用。近年來隨著對蛋白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)定位信號和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的深入了解,建立了根據(jù)蛋白質(zhì)分子在細(xì)胞內(nèi)的特殊定位進(jìn)行快速功能性基因克隆的方法,即細(xì)胞內(nèi)分布克隆。7技術(shù)基