低鹽度環(huán)境下凡納濱對蝦親蝦發(fā)育特征

低鹽度環(huán)境下凡納濱對蝦親蝦發(fā)育特征

班納西泮蝦，也被稱為美國山楂對照蝦，具有較強的適應性、廣闊的口感和較強的抗逆性。是世界上日光浴最重要的品種之一。2000年以來,凡納濱對蝦產量已經占到中國養(yǎng)殖對蝦總產量的80%以上。凡納濱對蝦為廣鹽性對蝦種類,具有較強的鹽度適應能力,在鹽度1~40條件下均可生長,有純淡水、半咸水、海水等多種養(yǎng)殖模式。鑒于海水養(yǎng)殖與淡水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生態(tài)結構,特別是微生態(tài)結構方面有重大差別,因此,探討在低鹽養(yǎng)殖環(huán)境中凡納濱對蝦的發(fā)育特征,對于在低鹽條件下培育無特定病原(specificpathogenfree,SPF)種蝦具有重要的理論與實踐意義。SPF對蝦是指在嚴格控制病原侵入的養(yǎng)殖條件下培育的對蝦,不帶有目前對蝦養(yǎng)殖中能夠檢測并常出現的特定病毒。1985年由美國夏威夷海洋研究所與Tufts大學開發(fā)出的SPF對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng),能夠嚴格控制養(yǎng)殖過程中的各項環(huán)境條件,因此能夠顯著減少病害發(fā)生的機率,養(yǎng)殖安全性大大提高。中國淡水養(yǎng)殖凡納濱對蝦的年產量已經達到60萬t以上,近年來,中國一直依靠從國外進口凡納濱對蝦SPF親蝦,供不應求且價格昂貴,嚴重制約凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。有研究報道,凡納濱對蝦在較低鹽度下性腺仍能發(fā)育。袁路等發(fā)現在鹽度5的條件下雄蝦精莢能夠發(fā)育且產生具有一定活力的精子,Parnes等在低鹽度養(yǎng)殖的凡納濱對蝦中發(fā)現了1只性腺完全成熟的雌蝦。因此,在低鹽海水甚至淡水中培育SPF親蝦,建立淡水或低鹽度水SPF親蝦生產系統(tǒng),有望為凡納濱對蝦親蝦的培育提供新的途徑。本文研究了低鹽條件下養(yǎng)殖的凡納濱對蝦在不同鹽度條件下的性腺發(fā)育、人工授精的受精率、孵化率,并對其性腺發(fā)育情況做了組織學觀察,以期為在低鹽SPF生產系統(tǒng)中培育凡納濱對蝦親蝦提供理論依據和技術參數。1材料和方法1.1實驗材料1.1.1平均體質量與鹽度實驗在河北省黃驊市海壬水產種業(yè)科技有限公司進行。實驗用親蝦800尾,約9月齡,平均體質量(30±0.83)g,于2012年11月取自廣州。養(yǎng)殖期間的池水鹽度為2~3。親蝦經過降溫、運輸10h后到達河北黃驊,經消毒后入池暫養(yǎng)。1.1.2暫養(yǎng)期間的養(yǎng)殖親蝦按雌雄分開,分別于5m×4.5m×1.5m的方形水泥池中暫養(yǎng)10d,暫養(yǎng)密度為9尾/m2。暫養(yǎng)初始水溫為(21±0.5)℃,以后每天升溫1℃,雄蝦暫養(yǎng)水溫穩(wěn)定在(27±0.5)℃,雌蝦暫養(yǎng)水溫穩(wěn)定在(28±0.5)℃。暫養(yǎng)期間養(yǎng)殖水的鹽度為3。養(yǎng)殖用水使用地下淡水與自然海水配置而成。暫養(yǎng)池水深保持在60cm,每天換水25%,并吸污1次。投喂沙蠶和魷魚,每天投喂4次,投喂量為親蝦體質量的8%~12%。水質指標控制在以下范圍內:pH8.0~8.6,溶解氧含量>6.0mg/L,氨氮質量濃度<0.5mg/L,亞硝酸鹽質量濃度<0.1mg/L。1.2實驗方法1.2.1眼柄鹽化實驗親蝦暫養(yǎng)10d后,將雌蝦與雄蝦稱重,分別移入10個5m×4.5m×1.5m的方形水泥池中,每池60尾蝦。移入當天雌蝦剪除單側眼柄。實驗設置1、8、15、23和30這5個鹽度梯度,各組從暫養(yǎng)期間的鹽度3起每天調整2度至各設定梯度,鹽化后穩(wěn)定3d開始投喂活餌,剪除雌蝦眼柄,進行實驗。促熟期間的水溫雄蝦控制在(27±0.5)℃,雌蝦控制在(28±0.5)℃。1.2.2產卵后卵巢形態(tài)觀察和發(fā)育情況觀察雌蝦剪除眼柄后每天觀察并記錄其性腺發(fā)育情況。根據雌蝦卵巢的形態(tài)、大小及色澤等特征,將其卵巢發(fā)育劃分為形成期、增殖期、小生長期、大生長期、成熟期和恢復期等6期。形成期和增殖期在體外觀察時幾乎看不出卵巢的形態(tài)和色澤。小生長期后卵巢體積明顯增大,外觀清晰。至成熟期外觀觀察可見卵巢幾乎占滿整個頭胸部,并向背部延伸至尾節(jié),呈暗紅色。第1次產卵后的卵巢進入恢復期,體積變小,卵巢萎縮。實驗中發(fā)現性腺發(fā)育達到成熟期的個體后用眼標進行個體標記,統(tǒng)計各鹽度梯度下的雌蝦性腺發(fā)育情況。從每個鹽度梯度中挑選發(fā)育成熟的3尾雌蝦,活體解剖取出卵巢,使用Bouin’s氏液固定24h,梯度酒精脫水后石蠟包埋。切片厚度7μm,HE染色,Nikon顯微鏡觀察并拍照,對不同鹽度梯度下發(fā)育成熟的對蝦卵巢進行組織學觀察比較。1.2.3精莢的發(fā)育情況每隔15d統(tǒng)計1次雄蝦精莢發(fā)育情況。將精莢發(fā)育成熟的雄蝦進行眼柄標記。采用成熟的精莢進行人工授精。在下個時間段進行精莢發(fā)育情況統(tǒng)計時,使用過的精莢按照成熟的精莢進行統(tǒng)計。精莢發(fā)育情況依據肉眼觀察可從外形上劃分為以下四個階段:Ⅰ未發(fā)育階段,其特征為少量不透明乳白色黏液,沒有精子和精子團;透過表皮,可以看到一小點白色的區(qū)域。Ⅱ早期發(fā)育階段,其特征為大量黏液,其中有薄而硬的片狀物質但沒有精子和精子團;精莢剛剛開始發(fā)育,肉眼可見呈白線狀。Ⅲ晚期發(fā)育階段,其特征為精莢呈白色,白色柔軟具有精子團,但還不足夠成熟。Ⅳ成熟階段,其特征為精莢飽滿凸出,精莢變硬呈乳白色,用手輕輕擠壓時,精莢可隨用力方向上下移動。1.2.4雄蝦人工授精采用精莢移植方法進行人工授精。選用各個鹽度梯度下性腺發(fā)育成熟的雄蝦精莢,與各鹽度梯度下發(fā)育成熟的雌蝦進行人工授精,所有的人工授精組合重復3次以上。人工授精后的雌蝦單獨置于100L塑料桶中進行產卵及孵化,統(tǒng)計總卵量、受精率、未受精率、孵化率等指標。2結果與分析2.1不同鹽度組的睪丸、幼蝦及其發(fā)育成熟個體數本實驗從剪除單側眼柄至實驗結束共73d。實驗期間各鹽度梯度組的雌蝦發(fā)育成熟情況及實驗結束時的存活情況分別如圖1及表1所示。在1至30范圍內的5個鹽度梯度中,均觀察到性腺發(fā)育成熟的凡納濱對蝦雌蝦。其中,鹽度1組在剪除眼柄后第18天發(fā)現有雌蝦性腺發(fā)育成熟,但實驗33天時雌蝦全部死亡,期間共發(fā)現3尾性腺發(fā)育至成熟期的雌蝦及3尾發(fā)育至IV期的雌蝦。8和15鹽度組分別于剪除眼柄后15天和18天發(fā)現有雌蝦性腺發(fā)育成熟。剪除眼柄后73天,8、15、23和30四個鹽度組的性腺發(fā)育至成熟期的個體數都達到了實驗雌蝦總數的70%。鹽度23實驗組在第13天發(fā)現性腺發(fā)育成熟的個體,且該組性腺發(fā)育成熟的個體數最多,共有51尾雌蝦發(fā)育至成熟期,發(fā)育成熟比例達到85%。鹽度30實驗組的雌蝦性腺發(fā)育時間較早且集中,第15天發(fā)現首個性腺發(fā)育成熟個體;第46天時發(fā)現最后一尾性腺發(fā)育成熟的雌蝦;至實驗結束,發(fā)育成熟比例達到76.7%。分析不同鹽度組的雌蝦性腺發(fā)育統(tǒng)計資料,可以看出,在實驗第22天時,各實驗組的雌蝦性腺發(fā)育成熟個體數量從高到低依次為:鹽度23組、鹽度30組、鹽度8組、鹽度15組。此后,鹽度30實驗組的雌蝦性腺發(fā)育成熟個體數超過23實驗組;62天后,鹽度23實驗組的雌蝦發(fā)育成熟個體數再次超過了30實驗組;23實驗組和30實驗組的雌蝦發(fā)育數量呈交叉上升趨勢。鹽度8實驗組的發(fā)育成熟的雌蝦總數始終多于15實驗組,而小于23和30兩個鹽度組。總體來看,15鹽度組的雌蝦性腺發(fā)育速度最慢。15鹽度以上,隨著鹽度增加,雌蝦性腺發(fā)育速度呈加快趨勢。鹽度8組的性腺發(fā)育速度稍快于鹽度15的雌蝦,但這兩個實驗組雌蝦同時期的發(fā)育尾數比較接近,差異不明顯。2.2組織病理學觀察取發(fā)育成熟的凡納濱對蝦雌蝦進行解剖觀測,可見發(fā)育成熟的卵巢位于身體背面,腸道上方,心臟下方。卵巢分為前葉、側葉和后葉三部分,前葉向前延伸至額角基部,側葉充塞在心臟、肝胰腺之間,一對后葉向后延伸至尾節(jié)前方為止。發(fā)育成熟的卵巢幾乎占滿整個頭胸部及背部,呈暗紅色,向后延伸至尾節(jié)。由圖2組織學切片觀察,可見卵巢內充滿成熟的卵子。對不同鹽度條件下培育的凡納濱對蝦雌蝦成熟卵巢進行組織學觀察。在8uf02d30四個鹽度實驗組中,成熟卵巢卵室內的卵細胞形狀均不規(guī)則,具有明顯的輻射狀皮質棒,細胞核模糊,核仁溶解,大量的卵黃顆粒充斥在卵細胞中。不同鹽度條件下培育的雌蝦性腺成熟期的卵細胞在形態(tài)結構、細胞大小等方面未見明顯差異。2.3雄蝦精莢發(fā)育情況按照1.2.3所述精莢發(fā)育期的劃分標準,不同鹽度條件下培育的凡納濱對蝦雄蝦的性腺在實驗期間的發(fā)育情況如圖3所示。在同一發(fā)育時期,鹽度23和30實驗組的雄蝦精莢發(fā)育明顯好于鹽度8和15實驗組。鹽度30實驗組的雄蝦精莢發(fā)育最快,到實驗第25天時,處于發(fā)育晚期及發(fā)育成熟的雄蝦已經達到62%;而同一時期,鹽度8和15兩個實驗組的雄蝦精莢大部分仍處于發(fā)育早期。鹽度23實驗組的雄蝦精莢發(fā)育速度稍快于15實驗組,兩個鹽度組在不同時期的雄蝦發(fā)育比例比較接近。鹽度8實驗組的雄蝦精莢發(fā)育最慢。分析實驗期間各組雄蝦精莢發(fā)育情況,可以看出,在所有鹽度實驗組中雄蝦精莢都能夠正常發(fā)育。到實驗55天時,8鹽度組中處于發(fā)育晚期及成熟期的雄蝦比例達到50%。15和23鹽度組在發(fā)育40天時,達到發(fā)育晚期及成熟期的雄蝦比例即超過50%,而30鹽度組在25天時達到發(fā)育晚期的雄蝦數量已經超過50%。由此可見,在8~30的鹽度范圍內,凡納濱對蝦雄蝦精巢都能夠正常發(fā)育成熟,但隨著鹽度的降低,精莢發(fā)育成熟所需要的時間明顯延長。2.4實驗結果與討論選用各鹽度條件下培育并發(fā)育成熟的雄蝦精莢與各個實驗組中發(fā)育成熟的雌蝦,分別進行人工授精。結果表明,各個實驗組的雄蝦精莢與30鹽度組的雌蝦進行人工授精,均可正常產卵、受精并孵化出無節(jié)幼體;鹽度23實驗組的雄蝦與同鹽度組的雌蝦人工授精后,在24鹽度下孵化出無節(jié)幼體;用任何鹽度組的雄蝦精莢與15與8鹽度組的雌蝦進行人工授精,都沒有觀察到孵化出的無節(jié)幼體(表2)。由表2可看出,本次實驗得到的凡納濱對蝦受精卵的最低孵化鹽度為24。鹽度30實驗組培育的雌蝦與鹽度23實驗組培育的雄蝦人工授精后在鹽度30條件下的受精率較高,達到85.25%,其余各實驗組合的受精率均較低。不同鹽度實驗組培育的親蝦受精后的孵化率均較低,30鹽度組的雌蝦與同鹽度條件下培育的雄蝦人工授精后的孵化率在所有組合中最高,也只有11.72%。3鹽度和鹽度對精莢發(fā)育的影響在全人工條件下培育凡納濱對蝦親蝦并繁育子代,經歷從成蝦養(yǎng)殖、性腺促熟、自然交尾(或人工授精)、產卵、受精及孵化和幼體培育等諸多環(huán)節(jié),每一個環(huán)節(jié)的影響因素眾多。鹽度、溫度、餌料及光照等都能影響性腺發(fā)育和產卵孵化。鹽度是影響凡納濱對蝦繁殖的主要環(huán)境因子之一,通過影響對蝦的生長、代謝、營養(yǎng)利用以及受精、孵化等方面直接或間接的影響其繁殖[21uf02d22]。在本研究中,使用池水鹽度為2~3的低鹽淡水養(yǎng)殖的凡納濱對蝦雌蝦,分別在1~30鹽度范圍內的5個梯度鹽度條件下培育,均觀察到外觀發(fā)育正常并達到成熟期的性腺,且8及以上鹽度實驗組的發(fā)育比例都達到了70%以上。在本實驗中低鹽度養(yǎng)殖的凡納濱對蝦雌蝦可以在低鹽度海水甚至幾近淡水的1鹽度水體中達到性腺發(fā)育成熟。這對于在理論上認識以及在生產實踐中利用凡納濱對蝦在低鹽度海水甚至淡水中正常繁殖具有重要意義。組織切片觀察結果顯示,各鹽度條件下培育發(fā)育成熟的雌蝦卵巢結構沒有明顯的差別,但不同鹽度組培育的雌蝦性腺發(fā)育速度不同。這說明鹽度對凡納濱對蝦雌蝦性腺的發(fā)育速度有重要影響。雄蝦精巢的發(fā)育受溫度、鹽度、餌料等多方面的影響,其發(fā)育程度的評價指標包括外觀觀察、人工授精效果等多個方面。袁路等發(fā)現凡納濱對蝦雄蝦在鹽度5的條件下可以發(fā)育成熟,不同鹽度對精莢質量、精子總數、精子活力影響顯著。姚衛(wèi)軍等發(fā)現鹽度15~30對精莢成熟期影響不顯著。在本實驗中,通過外觀觀察和人工授精的方法,發(fā)現凡納濱對蝦在8~30鹽度范圍內,精莢都能夠發(fā)育成熟,并保持一定的精子活力。精莢的發(fā)育速度與鹽度高低具有顯著相關關系,30鹽度條件下精莢發(fā)育最快;在23鹽度條件下,凡納濱對蝦雄蝦的精莢發(fā)育稍快于鹽度15實驗組,但差別不大;8的低鹽度條件下精莢發(fā)育速度明顯減慢。鹽度對凡納濱對蝦對脂肪酸及游離氨基酸的吸收、組成與分布都有影響[23uf02d24],而這些營養(yǎng)物質是性腺發(fā)育過程中的關鍵物質。在本實驗中,鹽度對性腺發(fā)育的影響主要表現在對性腺發(fā)育速度的影響,包括卵黃物質的積累以及精莢發(fā)育過程等,但在低鹽度條件下雌蝦和雄蝦的性腺都能夠發(fā)育成熟,說明鹽度對性腺發(fā)育的影響是一個漸進過程。據此可以推斷,在低鹽度甚至淡水環(huán)境中培育凡納濱對蝦親蝦具有一定的可行性。受精率和孵化率是判斷對蝦親蝦培育成功與否的基本指標。本實驗中,盡管凡納濱對蝦親蝦性腺可以發(fā)育,但人工授精后,只有30和23鹽度組的雌蝦產出的卵子孵化出了少量無節(jié)幼體,且其受精率及孵化率遠遠低于正常水平。孫麗華等認為當鹽度過高或過低時,細胞與周圍介質之間的物質平衡會被破壞,導致卵細胞受到損傷或內部結構產生一定變化,從而導致孵化率降低及畸形率升高。彭昌迪等認為鹽度低于22,凡納濱對蝦的受精卵不能正常孵化。本實驗中23鹽度組培育的雌蝦產出的卵子在24鹽度條件下獲得了2.53%的孵化率,換言之,本實驗得出的最低孵化鹽度為24,稍高于彭昌迪的研究結果。劉永認為海水相對密度1.0135~1.0145時(28℃時相對鹽度約為20.8~22.1),鹽度對凡納濱對蝦親蝦的成熟、交配和產卵影響不大,而對受精及孵化率有很大影響。本實驗能夠得到不同鹽度條件下培育成熟的雌蝦和雄蝦,但人工授精后卻不能孵化或是孵化率很低,據此推測凡納濱對蝦受精卵對孵化鹽度的要求可能比對性腺發(fā)育的鹽度要求更高。性腺能夠正常發(fā)育的鹽度條件未必可以滿足受精卵孵化的要求。當然,受精率和孵化率還與性腺成熟程度以及人工授精技術等因素有關,詳細分析這一問題還需要進行更深入細致的實驗研究。另外,調節(jié)鹽度