中國兩個省的耳豆根結(jié)線蟲鑒定

中國兩個省的耳豆根結(jié)線蟲鑒定

根結(jié)線蟲（meloidol.）廣泛分布于世界各地，是一種嚴重的植物寄生蟲線蟲。世界每年由根結(jié)線蟲所引起經(jīng)濟上重要農(nóng)作物的損失占總損失的5%。目前防治根結(jié)線蟲病的方法除了化學(xué)防治外,還包括植物檢疫、抗性品種、輪作、生物防治等一些非化學(xué)性防治措施。對于非化學(xué)性防治措施,根結(jié)線蟲種的準確鑒定是重要的前提條件。迄今為止,全世界已報道的根結(jié)線蟲種已超過90個,中國報道的種類也超過了50種。據(jù)調(diào)查研究,我國分布最廣泛、最常見的根結(jié)線蟲與世界各地類似,包括南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)、爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)、花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)和北方根結(jié)線蟲(M.hapla)。近年來,另一種根結(jié)線蟲,即象耳豆根結(jié)線蟲(M.enterolobii)越來越受到人們的重視。該線蟲是1983年在我國海南省儋州市象耳豆樹上發(fā)現(xiàn)的1個新種,該種在報道之后的20余年很少被研究。近來研究發(fā)現(xiàn)該線蟲可以寄生豆科、茄科、葫蘆科中的多種經(jīng)濟作物及番石榴等熱帶水果,還可以寄生攜帶Mi抗性基因的番茄,而且在海南省的三亞、瓊海和澄邁等地也被發(fā)現(xiàn)。象耳豆根結(jié)線蟲已經(jīng)成為我國熱帶、亞熱帶地區(qū)作物的一個重要潛在病原物。根結(jié)線蟲的傳統(tǒng)鑒定方法主要根據(jù)形態(tài)學(xué),特別是會陰花紋進行,但由于其較大的變異性導(dǎo)致有時結(jié)果不夠準確。象耳豆根結(jié)線蟲會陰花紋變異較大,部分會陰花紋形態(tài)與南方根結(jié)線蟲會陰花紋形態(tài)相似,如果僅根據(jù)該特征,有可能將象耳豆根結(jié)線蟲誤定為南方根結(jié)線蟲。因此,筆者結(jié)合形態(tài)學(xué)、同工酶及分子生物學(xué)手段對從廣東省和海南省采集到的根結(jié)線蟲樣品進行鑒定,旨在明確象耳豆根結(jié)線蟲除了分布在上述4個地區(qū)外,是否在其它地方也有分布,為準確鑒定及控制該線蟲提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1采集根結(jié)線蟲群體2003年至2005年在廣東省的廣州、佛山、江門、番禺、開平、陽江、廉江、湛江、遂溪、雷州、徐聞和海南省的?？?、瓊山、定安、屯昌、瓊中等地采集根結(jié)線蟲群體。在解剖鏡下,從根結(jié)選取單卵塊,接種于預(yù)先培植于消毒土的感病品種番茄(滿豐1號)根部,進行活體保存,待用。1.2陰道植物陰血菌的分離和制作觀察雌蟲、雄蟲和2齡幼蟲的形態(tài)特征。采集經(jīng)純化的根結(jié)線蟲種群,在解剖鏡下,用鑷子和解剖針分離成熟雌蟲,將雌蟲置于清水中,并移入硬塑料板上按常規(guī)方法制作會陰花紋,修正和清洗制作好會陰花紋后,用Olympus高級顯微鏡和掃描電鏡觀察會陰花紋形態(tài),并拍照保存于電腦中。1.3酶系統(tǒng)的檢測參考Esbenshade等的方法稍作改動。采用北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-Ⅲ-6B型電泳儀,DYY-Ⅲ-23A型垂直板電泳槽,凝膠板大小為125mm×100mm,凝膠厚度1mm。分離膠和濃縮膠同源,電極緩沖液是pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液。酶浸提液為20%蔗糖(W/V)和2%TritonX-100,每個種群挑取4～5個低齡雌蟲制成1個樣品。用50μL微量取樣器加樣,每孔30μL,其中含5μL溴酚蘭溶液,以已知爪哇根結(jié)線蟲作對照。電泳時,前1h電壓為80V,其后保持恒壓200V,整個電泳約4h。酯酶(EST)和蘋果酸脫氫酶(MDH)的染色配方及操作步驟參照Esbenshade等的方法。顯色完全后漂洗3次,在10%醋酸加上10%甘油中固定3h以上,然后掃描并貯存在電腦中。參照Esbenshade等的標準,判讀EST和MDH譜型,初步確定根結(jié)線蟲的種類。1.4評估dna1d不同體積的eppendorf管的制備采用微量DNA提取法,主要參照Liao等的方法,略加改動。首先配制WLB液,WLB液包括:2.5mmol/LDTT,1.125%吐溫20,0.025%明膠,2.5倍PCR緩沖液[125mmol/LKCl,25mmol/LTris-HCl(pH8.3),3.75mmol/LMgCl2]。然后在載玻片上滴16μL預(yù)冷的WLB液,挑入3～5條2齡根結(jié)線蟲幼蟲,用手術(shù)刀將線蟲切成多段,迅速吸取含盡量多的線蟲片段的懸浮液8μL,加到含10μL無菌水的Eppendorf管中,再向管中加入2μL預(yù)冷的1mg/mL蛋白酶K,使總體積為20μL,迅速放入-70℃冰箱10min以上。接著將Eppendorf管置于65℃恒溫60min,95℃恒溫10min,最后12000r/min離心0.5min。此時即得到DNA懸浮液,可直接用于PCR,也可保存于-20℃。2pcr擴增條件對mtDNA的COII和lRNA基因間序列,采用2對引物進行擴增。2對引物的上游引物均為C2F3,下游引物分別是MRH106和1108。其中引物MRH106位于引物1108下游約130bp處。引物序列分別為C2F3:5′-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3′;MRH106:5′-AATTTCTAAAGACTTTTCTTAGT-3′;1108:5′-TACCTTTGACCAATCACGCT-3′。PCR反應(yīng)體系:DNA模板10～20ng,ExTaq(5U/μL)0.125μL,10×PCR緩沖液2.5μL,dNTP(2.5mmol/L)2μL,引物(10μmol/L)各1μL,加無菌水至25μL。擴增條件:94℃4min;接著94℃1min,50℃1min,72℃2min共35個循環(huán);最后72℃10min。擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳分離,每100mL瓊脂糖凝膠加入5μLEB替代物GoldView。電泳緩沖液為0.5×TBE,以5V/cm電壓電泳約30min。用凝膠圖象分析系統(tǒng)照相,并儲存到電腦中。3pcr擴增條件對rDNA的IGS序列,采用引物5S和18S進行擴增。引物序列分別為5S:5′-TTAACTTGCCAGATCGGACG-3′,18S:5′-TCTAATGAGCCGTACGC-3′。PCR反應(yīng)體系及擴增產(chǎn)物電泳同本文“1.4,2)”。擴增條件:94℃4min;接著94℃0.5min,53℃0.5min,72℃1.5min共35個循環(huán);最后72℃10min。2結(jié)果與分析2.1地位變異的陰血工段,不同群體之間的陰道型或惡意程序主要特征為顯微觀察結(jié)果表明,采自海南省定安等地的6個根結(jié)線蟲群體(表1)形態(tài)相似,可能為同1個種。雌蟲蟲體膨大,呈梨形,有明顯突出的頸;頭區(qū)無環(huán)紋,與頸部稍縊縮,頭冠高,唇盤圓盤狀,略突起;排泄孔位置通常在近中食道球處;口針細長,錐體部與桿部等長,略向背面彎;口針基部球粗大;每個群體內(nèi)的會陰花紋均有一定的變異,但不同群體之間的會陰花紋變異趨勢類似,其特征為:整體卵圓形或橢圓形,線紋細且較平滑,背弓低至高,大多數(shù)會陰花紋無側(cè)線,少數(shù)具1條或2條不清晰的側(cè)線(圖1);雄蟲蠕蟲形,蟲體較小型,體環(huán)清晰;頭區(qū)高圓,略縊縮,無環(huán)紋;頭骨架中等發(fā)達;口針直,錐體部尖,桿部與基部球分界清楚;口針基部球大;中食道球卵圓形,瓣膜清楚;排泄孔位置變化較大;尾短、圓;交接刺略彎,基部圓;2齡幼蟲蠕蟲形,體環(huán)小而清晰;頭區(qū)略縊縮,無環(huán)紋,唇盤略高于中唇;口針纖細,錐體部銳尖,與桿部分界明顯;口針基部球清楚、大、圓;透明尾明顯,到尾末端漸變細,末端鈍圓,有1～3次缺刻;直腸稍膨大。主要形態(tài)特征與Yang等和劉昊等對象耳豆根結(jié)線蟲形態(tài)的描述基本相符。主要形態(tài)測量值與Yang等報道相比,除雌蟲最大體寬偏小(306.0～693.6μm,375.7～809.7μm)和雄蟲交接刺偏長外(29.0～35.1μm,27.3～32.1μm),其余基本相符。故初步判斷這6個根結(jié)線蟲群體為象耳豆根結(jié)線蟲。2.2gdh蛋白表達6個根結(jié)線蟲群體的2種同功酶表型一致,即Est2條主要酶帶,為VS1-S1型;MDH單1條酶帶,為N1a型。其中GDN1的酶譜圖見圖2。以往的研究已經(jīng)證明Est-MDH表型是根結(jié)線蟲鑒定的可靠依據(jù)之一,因此根據(jù)已建立的Est-MDH表型圖譜,可判定這6個根結(jié)線蟲群體均為象耳豆根結(jié)線蟲。2.3coiii/lna基因文庫擴增利用引物C2F3和MRH106對6個根結(jié)線蟲群體mtDNA的COII/lRNA基因間序列進行擴增,擴增圖譜見圖3-a。從擴增圖譜可見,所有線蟲群體都擴增獲得1條約850bp的亮帶。同時用引物C2F3和1108對6個根結(jié)線蟲群體的COII/lRNA基因間序列進行擴增,擴增圖譜見圖3-b。從擴增圖譜可見,所有線蟲都擴增獲得1條約700bp的亮帶?？梢?目的片段大小與文獻報道的象耳豆根結(jié)線蟲一致。2.4nas和18s間的igs擴增利用引物5S/18S對象耳豆根結(jié)線蟲GDN1的rDNA的5S和18S間IGS區(qū)進行擴增,擴增圖譜見圖4。從擴增圖譜可見,該線蟲擴增獲得1條大約800bp的亮帶,目的片段與龍海等報道的象耳豆根結(jié)線蟲一致。3根結(jié)線蟲與傳統(tǒng)鑒定方法分類鑒定本研究運用比較形態(tài)學(xué)、同工酶電泳、mtDNA-PCR、rDNA-IGS-PCR相結(jié)合的方法,在海南省定安的木豆、海南省?？诘哪径购头瘛V東省番禺的辣椒和南瓜及廣東省遂溪的豇豆上發(fā)現(xiàn)了象耳豆根結(jié)線蟲Meloidogyneenterolobii。據(jù)報道,迄今象耳豆根結(jié)線蟲的發(fā)生地僅局限在中國海南省的儋州、三亞、瓊海和澄邁4個地方。本研究不僅在海南省的定安和?？诎l(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲,而且在廣東省也發(fā)現(xiàn)該線蟲。這是首次在海南省外發(fā)現(xiàn)該線蟲,推測該線蟲在我國南方亞熱帶、熱帶地區(qū)可能有較廣的分布。本次調(diào)查新發(fā)現(xiàn)豆科(Leguminosae)的木豆和葫蘆科(Cucurbitaceae)的南瓜是該線蟲的寄主新記錄。目前已記載象耳豆根結(jié)線蟲可以侵染多種蔬菜、熱帶水果等經(jīng)濟作物,包括豆科的象耳豆、菜豆、豇豆和大豆;葫蘆科的黃瓜和西瓜;茄科(Solanaceae)的番茄、茄子、辣椒和煙草;桃金娘科(Myrtaceae)的番石榴和蓮霧;番荔枝科(Annonaceae)的番荔枝以及攜帶Mi抗性基因的番茄,造成嚴重的生產(chǎn)損失。這些研究表明該線蟲寄主范圍廣、毒性強,是熱帶、亞熱帶地區(qū)一些重要經(jīng)濟作物的一種重要病原物,因此應(yīng)該進一步開展該線蟲的調(diào)查,尤其是在我國的熱帶和亞熱帶地區(qū),了解該線蟲的分布情況及新的潛在寄主,為采取有效的檢疫措施防止該線蟲傳播提供必要的依據(jù)。對根結(jié)線蟲的鑒定,傳統(tǒng)方法主要是根據(jù)會陰花紋的特征進行鑒定,然而一些研究認為會陰花紋變異很大,僅根據(jù)會陰花紋有可能造成誤定;同工酶,尤其酯酶和蘋果酸脫氫酶已經(jīng)成為根結(jié)線蟲鑒定的一種重要手段,但是這一方法也具有一定的局限性。該方法需要活力旺盛的低齡雌蟲,而且有的種會產(chǎn)生多種酶譜帶類型,給鑒定帶來