22種中草藥對南方根結(jié)線蟲的防殺活性研究

22種中草藥對南方根結(jié)線蟲的防殺活性研究

1855年，corm第一次在英國的黃楊樹根發(fā)現(xiàn)根蟲，并于1879年首次在其名稱為根蟲。它是世界上影響最大的原生動物之一，也是人類最嚴重的疾病之一。國外20世紀80年代就已經(jīng)開展了大量植物源殺根結(jié)線蟲活性藥劑的研究,尤其是隨著標志植物源農(nóng)藥又被重新大力推廣和應(yīng)用的印楝素的發(fā)現(xiàn)和成功合成,植物源藥劑對根結(jié)線蟲的致死活性研究被一步步推向更廣的資源搜集、更深的機理研究方向發(fā)展。但是我國近代系統(tǒng)的針對殺線活性的植物源藥劑進行研究的文獻報道僅起于20世紀90年代初期。王翠萍1991年譯制了Tiyag發(fā)表的關(guān)于用香茅葉提出物浸根防治植物寄生線蟲的研究報道。隨后,我國植物源殺根結(jié)線蟲活性藥劑的研究逐步由學(xué)習(xí)和引入轉(zhuǎn)變到實驗性篩選和生理變化研究方面[7,8,9,10,11,12,13,14,15]。本研究選取了在中國傳統(tǒng)中草藥中具有殺蟲效果的22種中草藥植物,通過直接觸殺實驗研究其不同溶劑和不同提取手段條件下所得提取物的殺根結(jié)線蟲活性。1供試線蟲及材料供試植物:18科22種中草藥,具體見表1。供試線蟲:南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita),蟲樣采自西安市高陵縣通遠鎮(zhèn)蔬菜大棚基地生長的染病芹菜根系。2測試方法2.1卵囊的消毒處理剖開已感染南方根結(jié)線蟲的芹菜根系,在實驗室內(nèi)通過貝爾曼漏斗法提取蟲體,從所得蟲體中挑取卵囊,卵囊用0.2%次氯酸鈉溶液消毒0.5min后,經(jīng)無菌水沖冼。置卵囊于無菌水中孵化,取2d后孵出的線蟲(2齡線蟲,簡稱J2)供測定用。2.2提取與萃取方法不同溶劑提取:對供試植物進行粉碎、過篩(250μm)后,稱取5.0g植物粉末分別置于50mL乙醇、乙酸乙酯、石油醚和丙酮中,在25℃恒溫搖床中震蕩提取24h,所有提取液過濾去除濾渣,得澄清溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),所得固體粉末配成20%乙醇水溶液,待試驗用。不同方法提取:取粉碎后5.0g植物粉末置于100mL沸水中煮提20min;稱取5.0g植物粉末置于100mL冷水中浸泡30min,在2450MHz條件下提取2min;稱取5.0g植物粉末置于100mL冷水中浸泡30min,在25kHz/40kHz交換頻率下室溫超聲30min。各提取液過濾去渣,得澄清溶液,待試驗用。對胡黃連、狗脊水煮提取物的萃取分離:取粉碎后的100g植物粉末置于500mL沸水中煮提20min,過濾后取澄清濾液用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對萃取有殺線活性部分進行依次萃取,流程見圖1。其中各有機溶劑萃取,均經(jīng)過濃縮后再水溶,供后步萃取繼續(xù)使用,并對萃取各有效部分,記錄72h內(nèi)梯度受試濃度下線蟲的死亡率。使用DPS軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析,計算LC50值。2.3蟲體活動情況觀察試驗采用提取液與蟲樣液共混直接觸殺,蟲樣濃度1000~1200只/mL;100~400倍顯微下連續(xù)觀察72h,記錄蟲體活動變化情況。同時設(shè)置0.5%的乙酸乙酯、石油醚、丙酮的水溶液和10%、20%、30%乙醇水溶液的空白試驗。3溶劑提取試驗結(jié)果3.1有機溶劑提取所得結(jié)果見表2。通過空白試驗發(fā)現(xiàn)20%乙醇水溶液對受試南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲不存在明顯殺線活性,可以被用作有機溶劑提取成分線蟲活性觸殺試驗的載體溶液。3.2不同溶劑的萃取、殺線效果所得結(jié)果見表3。3.3不同方法的液體提取效果所得結(jié)果見表4。3.4萃取流程和流程對胡黃連水煮提取物進行萃取,在流程圖1中的水部Ⅱ和乙酸乙酯萃取Ⅴ部表現(xiàn)出強殺線蟲作用,72h內(nèi)殺線率達到100%;對狗脊水煮提取物進行萃取,在流程圖1中的水部Ⅱ、水部Ⅳ和正丁醇萃取ⅩⅢ部表現(xiàn)出強殺線作用,72h內(nèi)殺線率達到100%。萃取物的半數(shù)致死劑量見表5。4中草藥提取工藝的研究對22種中草藥采用不同溶劑和不同手段提取所得成分進行了系統(tǒng)的殺根結(jié)線蟲活性研究,得出以下結(jié)論。具有強殺根結(jié)線蟲活性的提取液。72h內(nèi)受試蟲體死亡率保持在90%(BB級)以上為具有強殺線活性。其中有胡黃連、木香、蛇床子、瞿麥和吳茱萸的乙酸乙酯提取液;甘草、花椒和石榴皮的乙醇提取液;艾蒿、木香和蛇床子的丙酮提取液;胡黃連和狗脊的水煮提取液;胡黃連、木香、天門冬和石榴皮的微波提取液;天門冬和石榴皮的超聲提取液,并且胡黃連、木香、蛇床子和石榴皮在多種提取方式下,均能提取出較強的殺線活性成分,而各種中草藥的石油醚提取液則未檢出具有強殺線活性的提取部分。提取方式對殺線活性產(chǎn)生的差異。1)對同一種中草藥采用不同溶劑提取比采用不同提取手段提取所得的殺線活性的差異性要大,如艾蒿僅在丙酮提取液以及瞿麥和吳茱萸僅在乙酸乙酯提取液中具有強殺線活性,其他溶劑提取方式則均表現(xiàn)出極弱的殺線活性。所以對研究大部分中草藥植物的殺線活性來說,選取合適的溶劑是得到特定活性成分的關(guān)鍵。2)選取不同的提取手段則能夠在提高活性物質(zhì)的提取效率上產(chǎn)生積極影響。如對蛇床子、小茴香、甘草、木香、天門冬、石榴皮、貫眾和百部采用微波和超聲提取比水煮提取,明顯提高了其殺線活性物質(zhì)的提取率,大大縮短了提取時間。蟲體受試期內(nèi)活性的變化。在對22種中草藥提取液的殺線活性研究中發(fā)現(xiàn)部分中草藥提取液在72h的線蟲觸殺試驗過程中,表現(xiàn)出明顯的逐漸復(fù)活現(xiàn)象。其殺線活性在72h內(nèi)從BB級以上變化到C級以下的13種中草藥的提取液有:魚腥草的乙酸乙酯提取液和水煮提取;小茴香的石油醚、丙酮和水煮提取液;甘草的乙酸乙酯、石油醚、丙酮和水煮提取液;番瀉葉的丙酮和超聲提取液;檳榔的乙酸乙酯、丙酮和微波提取液;石榴的石油醚和丙酮提取液;白頭翁的乙酸乙酯提取液;百部的乙酸乙酯、丙酮提取液;艾蒿的乙酸乙酯提取液;吳茱萸的丙酮提取液;花椒的乙酸乙酯提取液;萹蓄的丙酮提取液;貫眾的超聲提取液。這一現(xiàn)象和結(jié)果說明這些提取液成分具有的殺線活性是暫時性的,即可能是對根結(jié)線蟲起麻痹作用,在數(shù)十小時,甚至數(shù)小時之后,麻痹作用失效和復(fù)活;也可能是由于活性成分不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)變成了其他非活性物質(zhì)。所以在觸殺實驗的過程中,必須將受試蟲體于清水中復(fù)活以確認殺線活性效果。殺線LC50值的對比。目前文獻已報道多種具有較強殺根結(jié)線蟲活性的植物源化合物,如丁琦等報道的對苯二酚、丁子香酚、苦豆堿等13種植物源化合物中具有較強殺線活力的植物源化合物L(fēng)C50<100mg/L;朱衛(wèi)剛等報道了生物農(nóng)藥阿維菌素對南方根結(jié)線蟲的LC50值為1.48mg/L。本研究中,胡黃連乙酸乙酯萃?、醪繉δ戏礁Y(jié)線蟲2齡幼蟲的LC50值為81.44mg/L,狗脊正丁醇萃取ⅩⅢ部對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲的LC50值為67.37mg/L。相對于高成本農(nóng)用生物制劑,將胡黃連和狗脊的提取物進行農(nóng)用制藥,從成本和室內(nèi)觸殺效果的角度上看不失為一個有頗有前景的開發(fā)方向。5高效殺菌活性植物提取物的篩選就22種中草藥的提取物殺根結(jié)線活性進行了系統(tǒng)研究,發(fā)現(xiàn)胡黃連、狗脊、木香、蛇床子、石榴皮、瞿麥、吳茱萸、甘草、花椒和艾蒿10種中草藥的提取物具有較強的殺根結(jié)線蟲活性,測定了胡黃連和狗脊萃取提取物的殺線LC50值,并且胡黃連、木香、蛇床子和石榴在多種提取方式下均能提取出較強的殺線活性成分,可以被用作進一步的殺線機理和活性穩(wěn)定性研究。然而作為殺根結(jié)線蟲活性植物源農(nóng)用藥劑的研究,尤其是在我國,目前僅處于殺線活性植物資源的篩選階段,從我國傳統(tǒng)