發(fā)酵米粉中微生物的分離純化及鑒定

發(fā)酵米粉中微生物的分離純化及鑒定

以水稻為原料，通過自然發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵粉末，口感清新、光滑、彈性，品質(zhì)優(yōu)于無發(fā)酵粉末。但是,由于目前發(fā)酵米粉的生產(chǎn)基本上是手工作坊式的,生產(chǎn)規(guī)模小,產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。要對其進行大規(guī)模生產(chǎn),實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,通過人工模擬自然發(fā)酵的過程,是一種可行的方法。要模擬自然發(fā)酵的過程,就必須先弄清楚在發(fā)酵過程中起作用的微生物以及這些微生物的特性。國內(nèi)對粉條生產(chǎn)相關的微生物報道較少。1980年,北京大學生物系與北京粉絲廠合作對綠豆粉絲生產(chǎn)的酸漿法進行了研究。研究發(fā)現(xiàn),酸漿法是乳酸菌產(chǎn)生的淀粉凝集素起到沉淀淀粉的作用,該凝集素可將淀粉凝集成塊狀,加速淀粉的沉淀而使之有效地與蛋白等成分分離。其后再沒有更深入的研究。秦禮康等人將綠豆粉絲生產(chǎn)的酸漿法應用于馬鈴薯淀粉的生產(chǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)淀粉沉淀時間縮短了6倍,30min內(nèi)淀粉收率增加31.1%,淀粉白度提高16.6%,劣質(zhì)淀粉比例減少10.9%。施安輝等人對貴州等地引起腐敗的微生物進行了分離研究。結(jié)果表明,引起腐敗的微生物主要是芽孢桿菌(包括枯草芽孢桿菌、醋酸芽孢桿菌和馬鈴薯芽孢桿菌等),無芽孢桿菌(主要是乳酸桿菌和乳酸鏈球菌),酵母菌和霉菌等。因此,本文第一次系統(tǒng)地對發(fā)酵米粉發(fā)酵過程中的主要微生物進行了分離純化并用試劑盒對其進行了鑒定。為進一步研究發(fā)酵米粉的發(fā)酵機理提供前提條件。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗材料發(fā)酵米粉由常德發(fā)酵米粉廠提供。選取了三家不同工廠的不同發(fā)酵階段(原料米、浸泡3h、發(fā)酵24h、發(fā)酵48h、發(fā)酵72h等)樣品。1.1.2材料和培養(yǎng)基培養(yǎng)基:MRS肉湯培養(yǎng)基(BectonDicknson,USA);M17肉湯培養(yǎng)基(BectonDicknson,USA);DRBC瓊脂培養(yǎng)基(Oxoid,England);瓊脂粉。儀器設備:恒溫培養(yǎng)箱,真空泵,真空罐,電子天平,無菌操作臺,滅菌鍋,顯微鏡等。1.1.3iii50chl鑒定系統(tǒng)試劑:過氧化氫,革蘭氏染色試劑。試劑盒:API50CHL鑒定系統(tǒng),API20STREP鑒定系統(tǒng),ID32CAPI鑒定系統(tǒng)。軟件:APILABPlusV3.3.3。1.2方法1.2.1分離純度方法1.2.1.u3000制備導電材料稱取MRS肉湯培養(yǎng)基28.5g、瓊脂粉7.5g于500mL三角瓶中,加入500mL蒸餾水,攪拌均勻并用電爐加熱至固體完全溶解,封口,121℃滅菌15min。室溫冷卻至50℃倒平板及試管,待冷卻凝固后以劃線法接種,37℃真空罐中恒溫培養(yǎng)72±3hr,鏡檢后,挑取形態(tài)不同的單菌落轉(zhuǎn)接5次,所得菌種穿刺接種于試管培養(yǎng)基于4℃冰箱保藏。1.2.1.攪拌、冷卻稱取M17肉湯培養(yǎng)基24.2g、瓊脂粉7.5g于500mL三角瓶中,加入475mL蒸餾水,攪拌均勻并用電爐加熱至固體完全溶解,封口,121℃滅菌15min。室溫冷卻至50℃加入25mL10%滅菌后的乳糖,倒平板及試管,待冷卻凝固后以劃線法接種,37℃真空罐中恒溫培養(yǎng)(72±3)h,鏡檢后,挑取形態(tài)不同的單菌落轉(zhuǎn)接5次,所得菌種穿刺接種于試管培養(yǎng)基于4℃冰箱保藏。1.2.1.攪拌、冷卻稱取DRBC瓊脂培養(yǎng)基15.75g于500mL三角瓶中,加入500mL蒸餾水,攪拌均勻并用電爐加熱至固體完全溶解,封口,121℃滅菌15min。室溫冷卻至50℃倒平板及試管斜面,待冷卻凝固后以劃線法接種,28℃恒溫培養(yǎng)72±3h,鏡檢后,挑取形態(tài)不同的單菌落轉(zhuǎn)接5次,所得菌種接于斜面試管培養(yǎng)基于4℃冰箱保藏。1.2.1.4個顯微鏡檢查分離純化后的乳酸桿菌、乳酸鏈球菌、酵母菌用顯微鏡觀察其生理形態(tài),從形態(tài)學上初步確定其微生物種類。1.2.2鑒定方法1.2.2.過氧化氫酶的產(chǎn)生在干凈的載玻片上滴一滴9%的過氧化氫,挑取一小環(huán)分離純化得到的菌種涂布于過氧化氫溶液中,30s后觀察是否有氣泡產(chǎn)生,有氣泡產(chǎn)生者為過氧化氫酶陽性,無氣泡產(chǎn)生者則為過氧化氫酶陰性。將分離純化得到的乳酸桿菌和乳酸鏈球菌一一進行革蘭氏染色,分出革蘭氏陰性菌和陽性菌。1.2.2.酵母菌的鑒定選用過氧化氫酶試驗陰性且革蘭氏染色為陽性的乳酸桿菌和乳酸鏈球菌分別用API50CHL鑒定系統(tǒng),API20STREP鑒定系統(tǒng)進行鑒定,將分離純化的酵母菌用ID32CAPI鑒定系統(tǒng)進行鑒定。將鑒定結(jié)果記錄于試劑盒記錄單。1.2.2.4.軟件分析將上一步所得的試驗記錄用相應的軟件系統(tǒng)進行分析,得到鑒定結(jié)果。2酵母菌在米粉發(fā)酵中的應用經(jīng)分離純化、鏡檢以及乳酸菌的過氧化氫酶實驗和革蘭氏染色后的得到37株乳酸桿菌,17株乳酸鏈球菌,27株酵母菌,分析鑒定后結(jié)果統(tǒng)計于下表。由上列表格可以看出,從發(fā)酵米粉中分離純化得到的發(fā)酵微生物是以胚芽乳桿菌、屎腸球菌、釀酒酵母為優(yōu)勢菌株的乳酸桿菌、乳酸鏈球菌、酵母菌三類。我們的相關研究表明,發(fā)酵米粉浸泡液中的乳酸桿菌、乳酸鏈球菌、酵母菌的數(shù)量分別為:(8.13±0.10)logcfuml-1、(2.69±0.34)logcfuml-1、(7.95±0.16)logcfuml-1,它們是米粉發(fā)酵中的主導微生物。而且在其他的一些發(fā)酵食品中也應用到這些微生物。胚芽乳桿菌等乳酸桿菌應用在香腸加工、發(fā)酵飼料的生產(chǎn)以及一些下腳料的乳酸發(fā)酵中,是具有優(yōu)良發(fā)酵特性的乳酸菌。因而在發(fā)酵工藝的控制中應該充分發(fā)揮該菌的優(yōu)勢,使其在最大程度上改善米粉的品質(zhì)。而屎腸球菌、淺綠氣球菌等乳酸鏈球菌多為致病菌,可導致菌血癥、新生兒敗血癥等,而且大多抗藥性很強。該菌主要在其中一家工廠的發(fā)酵樣中分離得到,這與其生產(chǎn)加工環(huán)境有關。該廠家的生產(chǎn)環(huán)境以及浸泡池衛(wèi)生條件不夠好,采樣時發(fā)現(xiàn)發(fā)酵池表面有異常的泡沫并有不良氣味。因此,在工業(yè)生產(chǎn)中控制這些致病菌的生長繁殖是防止產(chǎn)品微生物危害的一個重要方面。釀酒酵母等酵母菌含有豐富的α-淀粉酶和糖化酶等,發(fā)酵過程中降解淀粉,產(chǎn)生多糖,是發(fā)酵米粉品質(zhì)優(yōu)于不發(fā)酵米粉的原因之一。酵母菌具有豐富的酶系,其酯酶、類脂酯酶、類脂酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖甙酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、α-甘露糖甙酶、β-巖藻糖甙酶等的活性都很強?？赡苁前l(fā)酵過程中改良米粉質(zhì)地的一個重要因素。3在其他食品發(fā)酵中的應用此次從發(fā)酵米粉中分離鑒定出的乳酸菌種類在國外其它發(fā)酵食品的研究中也有報道。胚芽乳桿菌能夠利用淀粉產(chǎn)酸,Muyanja在研究一種非洲高梁發(fā)酵飲料bushera時發(fā)現(xiàn)胚芽乳桿菌是其發(fā)酵后期的優(yōu)勢菌。Kunene在研究高梁發(fā)酵食品時也從原料和熟制品中分離出胚芽乳桿菌。胚芽乳桿菌還是某些天然谷物制品發(fā)酵后期的優(yōu)勢菌株。胚芽乳桿菌還被應用在多種發(fā)酵蔬菜中。Mbugua指出,在發(fā)酵過程中添加純種腸膜明串珠菌可通過其迅速酸化作用抑制革蘭氏陰性菌,從而保證產(chǎn)品的風味穩(wěn)定。德氏乳桿菌的生長具有嗜熱的屬性,通常能從較高溫度的食品原料中分離得到。德氏乳桿菌用于南非啤酒mahewu的發(fā)酵,使mahewu的發(fā)酵時間由36h縮短到6h。鑒定表明,在發(fā)酵米粉中還有鏈球菌。腸球菌屬(Enterococcus)分類學上屬于鏈球菌科,是人類和溫血動物腸道的正常棲居菌。既往曾認為腸球菌是對人類無害的共棲菌,但近年來的研究已證實了它的致病潛力。它在食品發(fā)酵中起的作用還有待進一步研究。在米粉發(fā)酵過程中,乳酸菌是主要優(yōu)勢菌,其次是酵母菌。乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵過程中