1例凝血因子缺陷癥及其家系基因突變的分析

1例凝血因子缺陷癥及其家系基因突變的分析

遺傳因素（f））缺陷是由f突變引起的一種正常的染色體隱性遺傳疾病，可由男女所有。發(fā)病率為1/500000。體外測定FⅦ活性(FⅦactivity,FⅦ∶C)與臨床表型無明顯的相關(guān)性,基因突變可較好的解釋其臨床表型變化。純合性和雙雜合性的基因突變臨床出血較嚴(yán)重,而雜合性突變幾乎無臨床癥狀。我們對1例遺傳性FⅦ缺陷癥及其家系成員的FⅦ基因突變進(jìn)行檢測,并研究基因突變與臨床表型的關(guān)系。1病例和方法1.1從女性方面分析服刑人員被高校思想家系來自浙江溫嶺市,調(diào)查了3代8個(gè)成員,先證者為一中年女性,有皮下出血史。2001年因急性闌尾炎術(shù)前檢查,因其凝血酶原時(shí)間(prothrombintime,PT)延長而被發(fā)現(xiàn),其父母非近親結(jié)婚,家系其他成員無出血癥狀。1.2血小板凝血指標(biāo)測定外周靜脈采血,用0.109mol/L的枸櫞酸鈉按1∶9抗凝,4℃4000r/min離心15min,分離血小板血漿,分裝后-80℃保存,用于凝血指標(biāo)的測定。按常規(guī)低滲法抽提DNA,-80℃保存,用于PCR擴(kuò)增。1.3凝固點(diǎn)法檢測fbg、因子活性PT、活化部分凝血活酶時(shí)間(activatedpartialthromboplastintime,APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen,Fbg)、因子Ⅱ活性(factorⅡactivity,FⅡ∶C)、因子Ⅴ活性(factorⅤactivity,FⅤ∶C)、因子Ⅶ活性(factorⅦactivity,FⅦ∶C)、因子Ⅷ活性(factorⅩⅢactivity,FⅧ∶C)、因子Ⅸ活性(factorⅨactivity,FⅨ∶C)、因子Ⅹ活性(factorⅩactivity,FⅩ∶C)檢測均應(yīng)用法國Stago公司試劑盒,在Stago全自動(dòng)血凝儀上用凝固點(diǎn)法進(jìn)行檢測。1.4第1和第7第3類共設(shè)計(jì)了10對引物以覆蓋FⅦ基因的外顯子及其側(cè)翼以及啟動(dòng)子區(qū)域。因第3外顯子和第4外顯子很小且其間的第3內(nèi)含子較小,用1對引物加以覆蓋;而第8外顯子又過于龐大,故將其人為分為兩個(gè)區(qū)域,分別設(shè)計(jì)了兩對引物;第1外顯子的一部分是選擇性表達(dá)的,將這部分單獨(dú)擴(kuò)增,因此也設(shè)計(jì)兩對引物;其它外顯子及啟動(dòng)子分別設(shè)計(jì)1對引物(表1),用PrimerExpress軟件自行設(shè)計(jì)引物,并在391DNA合成儀(AppliedBiosystems,USA)上合成。1.5pcr擴(kuò)增序列100μl的PCR反應(yīng)體系包括:1×PCR緩沖液,1.5mmol/LMgCl2,0.25mmol/LdNTPs,0.5μmol/L5′端和3′端PCR引物,500ngDNA模板,2.5UTaqDNA聚合酶(PCR反應(yīng)試劑均為TaKaRa公司產(chǎn)品)。PCR反應(yīng)在DNA熱循環(huán)儀(Perkin-ElmerCetus9600,USA)上進(jìn)行,反應(yīng)條件:95℃變性30s;根據(jù)引物的不同分別在57～60℃退火30s;72℃延伸30s,30個(gè)循環(huán)。其中3、4號引物所擴(kuò)增序列內(nèi)部存在二級結(jié)構(gòu),采用降落PCR法擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:97℃變性20s;62℃退火45s;72℃延伸90s,5個(gè)循環(huán);95℃變性20s;60℃退火45s;72℃延伸90s,25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物5μl在1.6%瓊脂糖凝膠上電泳,用DL2000標(biāo)記鑒定。1.6abi37測序PCR產(chǎn)物進(jìn)行割膠純化(德國QIAGEN公司DNA膠回收試劑盒),以制備測序模板,采用雙脫氧鏈終止法在ABI377測序儀上進(jìn)行測序,用Chromas軟件在Blaster上將測序結(jié)果與正常序列進(jìn)行比對,尋找基因突變。發(fā)現(xiàn)基因突變的序列反向測序證實(shí)。1.7pgemt-行走方便將含突變序列克隆入pGEMT-easy質(zhì)粒載體中,所得兩條染色體相應(yīng)序列分別測序,以確定兩個(gè)不同等位基因突變所在及性質(zhì)。1.8突變體測定取純化的PCR產(chǎn)物15μl(約500ng),加MspⅠ5U,10×緩沖液2μl,0.1%BSA2μl,滅菌雙蒸水補(bǔ)足20μl,37℃水浴酶切2h,20g/L瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果,證實(shí)測序所發(fā)現(xiàn)突變。2結(jié)果2.1各c的覆蓋范圍先證者PT延長,APTT正常,FⅡ∶C、FⅤ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C及FⅩ∶C均在正常值范圍內(nèi);FⅦ∶C<1%。家系其他成員的PT、APTT均正常,FⅦ∶C降低或正常(圖1,表2)。2.2pgemt-導(dǎo)質(zhì)粒雜合性突變FⅦ基因突變以美國NCBI基因庫(GenBank)所公布的GI180333和J02933序列為標(biāo)準(zhǔn),通過對FⅦ外顯子及其側(cè)翼以及啟動(dòng)子的測序發(fā)現(xiàn):先證者(Ⅱ3)在第8外顯子中有兩種基因突變:11348位C→T和11349位G→A,為雙重雜合突變(圖2)。pGEMT-easy質(zhì)?？寺y序結(jié)果為兩種突變分別位于不同的染色體上,為不同染色體同一編碼區(qū)Arg(CGG)304Trp(TGG)和Arg(CGG)304Gln(CAG)雙重雜合性突變。其父親(Ⅰ1)、母親(Ⅰ2)分別為11349位G→A(Arg304Gln)和11348位C→T(Arg304Trp)雜合突變;先證者的弟弟(Ⅱ4)FⅦ基因?yàn)檎Ｒ吧?其哥哥(Ⅱ1)和先證者的一個(gè)女兒(Ⅲ2)為11349位G→A(Arg304Gln)雜合突變,另一個(gè)女兒(Ⅲ1)和一個(gè)兒子(Ⅲ3)均為11348位C→T(Arg304Trp)雜合性突變(圖1)。2.3ga基因突變擴(kuò)增第8外顯子第2部分498bp片段,用Webcutter2.0DNA限制性酶切軟件分析,該序列有3個(gè)MspⅠ(識別C/CGG序列)酶切位點(diǎn),被切成67bp、80bp、117bp和234bp4個(gè)片段;當(dāng)11348位C→T和11349位G→A突變時(shí),11347位酶切位點(diǎn)消失,被切成67bp、197bp和234bp3個(gè)片段;若患者為雜合子,則分別包含1條正常和突變的等位基因,498bp被切成67bp、80bp、117bp、197bp和234bp5個(gè)片段,利用這一特征鑒定先證者及其家系成員的突變基因。發(fā)現(xiàn)先證者的PCR產(chǎn)物被切成67bp、197bp和234bp3個(gè)片段,而其父母、哥哥、3個(gè)子女則出現(xiàn)67bp、80bp、117bp、197bp和234bp5個(gè)片段,說明均為雜合性突變,其弟弟呈現(xiàn)了67bp、80bp、117bp和234bp野生基因的4個(gè)片段(圖3)。3crg304gln突變與tf基因雜合性突變的關(guān)系據(jù)最新的FⅦ數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì),FⅦ突變有124種,包括錯(cuò)義、無義、剪切位點(diǎn)、啟動(dòng)子、小的插入和缺失6種突變。其中錯(cuò)義突變約占70%。本文先證者有兩種錯(cuò)義突變:11348位C→T和11349位G→A的雙重雜合突變。其父親、母親分別為11349位G→A和11348位C→T雜合突變,結(jié)合pGEMT-easy質(zhì)?？寺y序結(jié)果,可以證實(shí)先證者的兩種突變分別位于不同的染色體上,一個(gè)來自父親,一個(gè)來自母親,導(dǎo)致不同染色體同一編碼區(qū)Arg304Gln和Arg304Trp的替換。先證者哥哥為11349位G→A(Arg304Gln)雜合突變;先證者3個(gè)子女均為雜合突變,突變均來源于先證者。先證者兩種錯(cuò)義突變均發(fā)生在CpG二核苷酸的突變熱點(diǎn)上,發(fā)生的部位在FⅦ最易發(fā)生突變的第8外顯子上。Matsushita等首次報(bào)道1例Arg304Trp純合突變。先證者為1名37歲的日本男性,無自發(fā)性出血史,在常規(guī)凝血檢查中因PT延長而被發(fā)現(xiàn)。用兔組織凝血活酶測定,其FⅦ∶C小于5%,用重組人組織因子(tissuefactor,TF)測定其FⅦ∶C水平為16%,FⅦ∶Ag含量正常。Arg304Gln純合性突變也有報(bào)道,首例患者無臨床出血癥狀,用兔組織凝血活酶測定其FⅦ∶C小于1%,而用TF測定FⅦ∶C水平為30%,用兔組織凝血活酶和人TF測定結(jié)果的差異是由于不同種屬間TF基因結(jié)構(gòu)特異性造成的。本研究中先證者的FⅦ∶C<1%(用兔組織凝血活酶測定),有皮下出血史,即臨床表型為輕度出血,與其活性測定水平無明顯相關(guān)性,表明用非人組織凝血活酶測定的FⅦ∶C不能預(yù)測患者的臨床表型。經(jīng)驗(yàn)和數(shù)學(xué)模型研究表明,FⅦ含量占FⅦ生理水平的0.05%時(shí),即足以誘導(dǎo)凝血,更說明了非人TF測定FⅦ∶C的臨床應(yīng)用的局限性。先證者為Arg304Trp和Arg304Gln雙重雜合突變,其FⅦ∶C水平與純合性的Arg304Trp或Arg304Gln突變相似。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)了兩例純合性的Arg304Trp突變,均無臨床出血表現(xiàn),而在所發(fā)現(xiàn)的16例純合性Arg304Gln突變中,有兩例臨床癥狀不清,10例無臨床癥狀,3例輕度出血,1例中度出血。雖有一定的異質(zhì)性,但臨床表現(xiàn)多不嚴(yán)重。本例雙重雜合突變與其純合突變臨床表現(xiàn)相似。由此可見,血友病A、B的出血程度,與血漿FⅧ∶C、FⅨ∶C的水平明顯相關(guān),但FⅦ缺陷患者的臨床表型與實(shí)驗(yàn)檢查結(jié)果無明顯相關(guān)性,其原因尚待進(jìn)一步研究。研究表明,Arg304位于FⅦ結(jié)構(gòu)的保守區(qū),相當(dāng)于其它維生素K依賴的凝血因子FⅡArg490、FⅨArg333、FⅩArg298的保守區(qū)。Giannelli等研究發(fā)現(xiàn)FⅨArg333Gln突變可能在空間結(jié)構(gòu)上影響其與FⅧ結(jié)合而引起重型血友病B,患者表現(xiàn)為交叉反應(yīng)物質(zhì)陽性(cross-reactingmaterialpositive,CRM+),根據(jù)分子模型圖發(fā)現(xiàn)FⅦArg304和FⅨArg333為同源結(jié)構(gòu)。表明Arg304位點(diǎn)突變會(huì)影響FⅦ的功能。O′Brien等進(jìn)一步研究表明其功能異常是由于Arg304突變影響FⅦ與TF結(jié)合。FⅦ是外源性凝血途徑的始動(dòng)因子,與TF結(jié)合是加速FⅦ向FⅦa轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Arg304Trp突變的FⅦ在TF出現(xiàn)時(shí)也不易被FⅩa活化,但Arg304Trp突變的FⅦa能象正常FⅦa一樣活化FⅩa,這一試驗(yàn)表明,Arg304Trp突變與人TF結(jié)合力降低,而其酶催化活性正常,即很可能是由于因子Ⅶ·組織因子,組織因子·活化的因子Ⅶ·因子Ⅹ及活化的因子Ⅹ·組織因子·因子Ⅶ復(fù)合物形成異常所致。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分析表明,Arg304Trp或Arg333Gln氨基酸的替代導(dǎo)致了精氨酸疏水側(cè)鏈被色氨酸或谷氨酰胺的親水側(cè)鏈替代,使Arg304附近催化區(qū)的Ⅲ級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,這種結(jié)構(gòu)變化可能