南瓜多糖口服液和顆粒劑對(duì)糖尿病大鼠降糖作用的研究

南瓜多糖口服液和顆粒劑對(duì)糖尿病大鼠降糖作用的研究

0糖尿病大鼠血糖的變化糖尿病（m）是一種由胰島素絕對(duì)或相對(duì)分泌不足引起的內(nèi)部疾病，主要表現(xiàn)為糖、脂肪、蛋白質(zhì)等代謝紊亂。臨床表現(xiàn)為“三分之三”。換句話說(shuō)，食物、飲料和尿液的增加會(huì)增加，體重會(huì)減輕。糖尿病會(huì)導(dǎo)致各種并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人類健康，發(fā)病率也在逐漸上升。糖尿病是一種終身疾病，無(wú)法治愈，需要長(zhǎng)期治療。目前，糖尿病的臨床治療藥物主要是胰島素、丙基瓜和雙胺類藥物。這些藥物的副作用包括：例如，低血糖癥、長(zhǎng)期使用和并發(fā)癥。因此，高效低毒藥物的開(kāi)發(fā)具有很強(qiáng)的市場(chǎng)前景。南瓜為葫蘆科植物.南瓜的果實(shí),富含多種氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、維生素、淀粉、纖維素及微量元素等,具有較高的食用價(jià)值.南瓜具有降血糖、降血脂、防治癌癥、解毒和保肝腎等功效.南瓜多糖(pumpkinpolysaccharide,PP)是南瓜中主要的降糖活性成分.實(shí)驗(yàn)表明,南瓜多糖具有較好的降糖作用.將南瓜多糖制備成有效成份穩(wěn)定、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一、口感好、便于服用攜帶、便于儲(chǔ)存的口服液和顆粒劑,為南瓜多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù).鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)是一種DNA烷基化試劑,具有升血糖的副作用,對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用,能誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生糖尿病.本文通過(guò)建立STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型,觀察南瓜多糖口服液和顆粒劑對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響.1材料和方法1.1試劑及試劑廠成熟南瓜(市場(chǎng)上購(gòu)買);鏈脲佐菌素(上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司);鹽酸二甲雙胍腸溶片(貴州天安藥業(yè)股份有限公司).葡萄糖(分析純,天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司);苯酚(分析純,天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司);濃硫酸(分析純,沈陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)試劑廠);無(wú)水乙醇(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);甘露醇(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠);可溶性淀粉(分析純,天津市博迪化工有限公司);羧甲基纖維素鈉(分析純,沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠).1.2紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);UV-2550紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津儀器公司);FD-80真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);邁瑞B(yǎng)S-380全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司).1.3試驗(yàn)對(duì)象動(dòng)物SD大鼠,雄性,體重170～200g,由沈陽(yáng)市沈河區(qū)龍?jiān)?jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供,合格證號(hào):SCXK(遼)2010-0001.1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1南瓜多糖的制備將成熟的南瓜洗凈,去表皮、籽、瓤后切成薄片.烘干粉碎后,加入3倍量的水,熱水浸提兩次,每次4h,過(guò)濾,合并濾液,將濾液濃縮至約原體積的1/3,加95%乙醇醇沉,低溫過(guò)夜,離心得到沉淀,少量水復(fù)溶,加95%乙醇進(jìn)行第二次醇沉,離心,冷凍干燥得到疏松多孔略帶淡黃色的固體,即為南瓜多糖.1.4.2苯酚-硫酸法多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸(phenol-sulfuricacid)法.此法簡(jiǎn)單、顯色穩(wěn)定、靈敏度高、重現(xiàn)性好.因此應(yīng)用苯酚-硫酸法測(cè)定南瓜多糖含量具有一定的參考價(jià)值.1.4.2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取烘干(105℃)至恒重的無(wú)水葡萄糖100mg于100mL容量瓶中,加水至刻度,分別精密量取0.1mL,0.2mL,0.3mL,0.4mL,0.5mL于10mL容量瓶中,加水至刻度,各取2mL加入6%苯酚1.0mL及濃H2SO45.0mL,振蕩搖勻,沸水浴中加熱15min,冷卻至室溫后于490nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A,以2.0mL的水按同樣顯色操作為空白,以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)X,吸光度測(cè)定值為縱坐標(biāo)Y,做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.012X+0.0684,r=0.9996,在10～50μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.1.4.2.2.方法研究(1)方法的精密度精密配制高、中、低三種濃度的樣品溶液,按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作測(cè)定吸光度,重復(fù)5次,計(jì)算日內(nèi)、日間精密度均小于3%,表明本方法精密度良好.(2)重復(fù)試驗(yàn)精密配制已知濃度的樣品溶液6份,按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作測(cè)定吸光度,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.409%,表明本方法重復(fù)性較好.(3)方法的穩(wěn)定性測(cè)定精密配制已知濃度的樣品溶液,按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作測(cè)定其吸光度,每隔30min測(cè)1次吸光度,一共測(cè)定6次,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.815%.表明樣品溶液在3h內(nèi)穩(wěn)定.1.4.2.南瓜多糖含量測(cè)定精密稱取南瓜多糖200mg置于100mL容量瓶中,加入20mL水超聲溶解,然后加入80mL無(wú)水乙醇醇沉,超聲1h,冷卻至室溫后過(guò)濾,殘?jiān)?0%乙醇洗滌2～3次,用少量沸水將濾渣洗入原容量瓶,加水定容到100mL.從上述溶液中精密量取2mL溶液定容至50mL,作為供試液.精密量取供試液2mL,按1.4.2.1方法操作,并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算南瓜多糖含量.測(cè)得的多糖含量為50%～60%.1.4.3南瓜多糖口服液口服液制備:羧甲基纖維素鈉在熱水和冷水中溶解度均較好,安全可靠,可作為食品的穩(wěn)定劑、增稠劑.加入適量的羧甲基纖維素鈉可明顯提高南瓜多糖口服液的穩(wěn)定性.精確稱取羧甲基纖維素鈉4g,加少量蒸餾水.待其自然膨脹溶解后,與南瓜多糖40g、山梨酸鉀2g混合,加蒸餾水超聲溶解,最后補(bǔ)水至1000mL,攪拌混勻,玻璃瓶灌裝,高溫滅菌,冷卻即得南瓜多糖口服液.顆粒劑制備:南瓜多糖粘度大、吸濕性強(qiáng),制粒困難,所以考慮加入填充劑.甘露醇溶解性好、抗?jié)裥院玫蓧盒圆?、價(jià)格稍貴;可溶性淀粉價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定但溶解度差.綜合考慮采用混合輔料以便取長(zhǎng)補(bǔ)短,共同做為填充劑,制備多糖顆粒劑.將南瓜多糖、甘露醇、可溶性淀粉研磨成細(xì)粉,過(guò)100目篩備用.精確稱取南瓜多糖30g,甘露醇40g,可溶性淀粉30g,充分混勻,75%乙醇制軟材,20目制粒,60℃干燥1h,整粒,篩除細(xì)粉,即得南瓜多糖顆粒.1.4.4山羊口服和緊縮劑的主要物質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定1.4.4.1.測(cè)定腹瀉主要品質(zhì)指標(biāo)的方法(1)南瓜多糖口服液中多糖含量的測(cè)定精密量取口服液10mL,溶于10mL蒸餾水中,超聲溶解30min,過(guò)濾,作為儲(chǔ)備液.精密量取儲(chǔ)備液1mL置于10mL離心管中,加入5mL無(wú)水乙醇,搖勻,靜置5min,4000r/min離心10min,傾去上層液體,沉淀用蒸餾水溶解并定容至50mL容量瓶中,作為供試液.精確吸取2mL供試液,按1.4.2.1方法操作,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算南瓜多糖口服液中多糖的含量.GB47892-2010;大腸菌群的測(cè)定:GB47893-2010;致病菌的測(cè)定:SN/T1869-2007.1.4.4.2.粒劑主要物質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定(1)南瓜多糖份粒劑中多糖含量的測(cè)定精確稱取南瓜多糖顆粒500mg,溶于50mL蒸餾水中,超聲溶解30min,過(guò)濾,作為儲(chǔ)備液.精密量取儲(chǔ)備液1mL置于10mL離心管中,加入5mL無(wú)水乙醇,搖勻,靜置5min,4000r/min離心10min,傾去上層液體,沉淀用蒸餾水溶解并定容至50mL容量瓶中,作為供試液.精確吸取2mL供試液,按1.4.2.1方法操作,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算南瓜多糖顆粒劑中多糖的含量.(2)溶解試驗(yàn)稱取顆粒10g,加熱水200mL,攪拌5min后觀察顆粒溶解情況.(3)充填顆粒篩稱取顆粒10g置于藥篩內(nèi)過(guò)篩,過(guò)篩時(shí),保持水平狀態(tài)過(guò)篩,左右往返邊篩動(dòng)邊輕叩3min,不能通過(guò)1號(hào)篩(10目)和能通過(guò)5號(hào)篩(80目)的顆粒不得超過(guò)總顆粒質(zhì)量的15%.(4)灰化過(guò)程中顆?？偦业臏y(cè)定稱取顆粒3g,置熾灼至恒重的坩堝中,稱定重量,緩緩熾熱,至完全炭化時(shí),逐漸升高溫度至500℃～600℃,使完全灰化并至恒重.根據(jù)殘?jiān)亓?計(jì)算顆粒的總灰分.(5)含水量%的測(cè)定稱取顆粒2g置于干燥至恒重的稱量瓶中,厚度不超過(guò)5mm,精密稱定,打開(kāi)瓶蓋在105℃干燥5h,將瓶蓋蓋好,移置干燥器中,冷卻30min,精密稱定,再在上述溫度干燥1h,冷卻,稱重,至連續(xù)兩次稱重的差異不超過(guò)5mg為止,兩次干燥稱重的差值與初始顆粒的重量比即為含水量.根據(jù)減失的重量,計(jì)算供試品中含水量(%),不得超過(guò)6%.1.4.5杏仁糖的降糖實(shí)驗(yàn)1.4.5.大鼠血糖等情況的模型建立大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后,禁食24h(禁食不禁水),連續(xù)兩天腹腔注射鏈脲佐菌素55mg/kg.注射后2h喂以6%的糖水,72h后測(cè)空腹血糖值.把血糖值大于11.0mmol/L大鼠定為糖尿病大鼠.將50只糖尿病大鼠按血糖值隨機(jī)分為5組,每組10只,分別為:模型對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照組,南瓜多糖組,南瓜多糖口服液組,南瓜多糖顆粒劑組.模型對(duì)照組給予等體積的生理鹽水,陽(yáng)性對(duì)照組給予二甲雙胍(劑量為280mg/kg),給藥組分別給予南瓜多糖、南瓜多糖口服液,南瓜多糖顆粒劑(劑量為280mg/kg).造模成功后1w灌胃給藥.每組灌胃給藥21d,一日兩次,每次2mL.每2d稱體重一次,及時(shí)調(diào)整灌胃劑量.1.4.5.2、試驗(yàn)指標(biāo)分別于第11、21d,給藥后7h測(cè)定血糖值.每日觀察動(dòng)物體重、進(jìn)食、飲水、尿量、皮毛等情況.1.4.5.3-血糖法采用眼眶取血,37℃恒溫放置30min,4000r/min離心20min,取上層血清,采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血糖值.1.4.5.4-統(tǒng)計(jì)方法采用PASWStatistics18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行T檢驗(yàn).各組數(shù)據(jù)以(x±s)表示.P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果與分析2.1口服的主要物質(zhì)指標(biāo)2.1.1感覺(jué)指標(biāo)色澤:淡黃色,均勻一致;氣味:具有南瓜特有的芳香;滋味:入口微甜,無(wú)異味;組織狀態(tài):半透明,無(wú)雜質(zhì).2.1.2物理和化學(xué)指標(biāo)南瓜多糖含量≥32.20mg/mL;pH值5.0～6.0;重金屬含量及農(nóng)藥殘留均符合國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn).2.1.3微生物指數(shù)細(xì)菌總數(shù)≤100CFU/mL;大腸菌群≤40CFU/mL;致病菌:不得檢出.2.2顆粒、灰、顆粒、白砂糖的含量測(cè)定,提出南瓜多糖顆粒劑中南瓜多糖的含量:18.79%.溶化性試驗(yàn):隨著攪拌,顆粒逐漸崩解.溶解時(shí)間1min左右,最終得到澄清透明的淡黃色溶液.粒度試驗(yàn):不能通過(guò)1號(hào)篩(10目)和能通過(guò)5號(hào)篩(80目)的顆粒質(zhì)量為0.873g,占總顆粒重的8.73%,符合要求.灰分測(cè)定試驗(yàn):最終得到殘?jiān)|(zhì)量為0.096g,顆粒的總灰分為3.2%,符合要求.水分測(cè)定試驗(yàn):兩次干燥稱重的差值為0.048g,含水量為2.4%,符合要求.2.33.實(shí)行《決定》第5款第5款第5.55.實(shí)行《決定》第5款第5.5.5.5.5.5.5.5%逐步形成給藥21d后,模型對(duì)照組的血糖仍處于較高的水平.給藥后與給藥前相比血糖下降明顯(P<0.05);給藥組中,南瓜多糖組、口服液組和顆粒劑組降糖率分別為43.53%、44.97%和46.20%.南瓜多糖組與制劑組相比無(wú)顯著差異.實(shí)驗(yàn)表明,輔料對(duì)南瓜多糖的降糖作用影響較小.南瓜多糖、南瓜多糖口服液和南瓜多糖顆粒劑對(duì)糖尿病大鼠具有降糖作用.結(jié)果見(jiàn)表1.2.4糖尿病體征糖尿病大鼠一般表現(xiàn)為多飲、多食、多尿、體重下降、體毛松散無(wú)光澤.給藥21d后,給藥組精神逐漸好轉(zhuǎn),進(jìn)食、飲水、尿量均減少、體重較造模初期有所上升.而模型對(duì)照組的糖尿病體征沒(méi)有明顯好轉(zhuǎn).3南瓜多糖降糖作用概述南瓜資源豐富且價(jià)廉,具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值.南瓜多糖具有明顯的降糖作用.因此,具有良好的發(fā)展前景.然而,目前進(jìn)行的研究大多是南瓜多糖的活性研究,已上市的南瓜產(chǎn)品多是南瓜粉、南瓜籽、南瓜汁等粗加工類保健食品,南瓜多糖劑型的研究相對(duì)較少,更沒(méi)有上市的劑型.本文將南瓜中的降糖活性成分南瓜多糖提取出來(lái)并將其制成單一成分的口服液與顆粒劑,具有口感好、無(wú)不良?xì)馕丁⒁子诜?、攜帶方便、質(zhì)量穩(wěn)定、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn),提高了患者的依從性.藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明南瓜多糖口服液和顆粒劑對(duì)STZ糖尿病大鼠具有明顯的降糖作用,為南瓜多糖的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供指導(dǎo),并為預(yù)防及治療糖尿病提供了可靠的途徑.STZ是一種常用的誘導(dǎo)糖尿病模型的藥物.其易見(jiàn)光分解,因此需避光操作.pH為4.2～4.5時(shí),STZ活性最好.本文所用檸檬酸緩沖液pH值為4.31.為了提高造模成功率,本文采取多次小劑量腹腔注射STZ的方法,最終可形成穩(wěn)定持久的糖尿病.多次小劑量注射STZ與一次性大劑量注射STZ相比,不僅可以提高造模成功率,還可以明顯地降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率.在分離血清的過(guò)程中,比較容易出現(xiàn)溶血現(xiàn)象.溶血對(duì)血液標(biāo)本的