基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析型糖尿病大鼠尿液代謝組學(xué)變化

基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析型糖尿病大鼠尿液代謝組學(xué)變化

糖尿?。╥i類）是一種常見的全身內(nèi)側(cè)疾病，主要以慢性高血糖、胰島素不足和酮癥為臨床特征。通常表現(xiàn)為整體性的代謝紊亂,也稱“代謝綜合癥”。糖尿病很難用單一的評價指標(biāo)和發(fā)病機(jī)制來反應(yīng)其發(fā)生及變化。“定量測定病理生理刺激或基因改變情況下生物系統(tǒng)的動態(tài)多參數(shù)代謝物變化”是代謝組學(xué)(Metabonomics)的定義,它是一項動態(tài)的、多參數(shù)應(yīng)答的新技術(shù),反映的是基因、環(huán)境、致病因素、營養(yǎng)、藥物、時間等諸多因素綜合作用于機(jī)體后的總反應(yīng),而代謝物組是判定健康、疾病和治療效果合適的分子集合。因此運用代謝組學(xué)技術(shù)研究Ⅱ型糖尿病,通過考察完整生物體致病后其代謝產(chǎn)物的變化,進(jìn)行生物體代謝狀態(tài)研究,對糖尿病的研究有著重要意義。本實驗基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析Ⅱ型糖尿病大鼠模型尿液代謝譜的變化,探索Ⅱ型糖尿病的代謝組學(xué)特征及與其密切相關(guān)的小分子生物代謝產(chǎn)物,為Ⅱ型糖尿病病機(jī)研究提供一種新思路。1材料和方法1.1實驗動物1.2試劑和機(jī)器1.3實驗方法1.3.1動物組和模型1.3.2生化指標(biāo)的檢測1.3.3收集和檢測尿液樣品1.3.4化合物特性的測定代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理:原始GC-MS數(shù)據(jù)文件,通過本實驗室自定義的MATLAB腳本進(jìn)行基線矯正、峰判別和匹配、內(nèi)標(biāo)和系統(tǒng)雜峰的排除和峰的歸一化等計算過程。最終得到包括化合物的特性指標(biāo)(這里用質(zhì)核比來表示),樣本名以及歸一化后的峰面積三者在內(nèi)的數(shù)據(jù)集。將上述數(shù)據(jù)集導(dǎo)入到SIMCA-P12.0軟件包(Umetrics,Ume,Sweden)采用主成分分析(PCA)與正交偏最小方差判別分析的方法(OPLS-DA)進(jìn)行分析。2結(jié)果2.1生化指標(biāo)的檢測結(jié)果2.2關(guān)于排尿代謝譜變化的研究2.2.1大鼠尿樣的代謝模式及分布為了更直觀地展示正常對照組大鼠在喂養(yǎng)過程中及模型對照組大鼠在造模過程中的代謝模式變化,本實驗分別將各個階段的正常對照組大鼠和模型對照組大鼠的尿液代謝譜進(jìn)行比較,結(jié)果表明,正常大鼠代謝輪廓除了第9周的尿液樣本與其他幾周的尿液樣本分離程度相對比較清晰,其余各個時間的樣本沒有明顯的分離現(xiàn)象,但是從總體趨勢上看,正常組大鼠在喂養(yǎng)過程中,隨著時間的推移,大鼠尿樣的代謝模式有一個在一維上向左移動的趨勢,見圖3。與正常大鼠代謝模式隨時間推移的變化趨勢圖相比,模型對照組大鼠代謝譜隨時間推移所呈現(xiàn)的變化程度更加明顯。第0-4周代謝譜之間交叉重疊程度較高,主要落在第Ⅰ和第Ⅳ象限,第5周開始,即注射STZ之后1周,各周樣本集之間分離趨勢愈加明顯,可以清晰的看到,5、6、7周其尿液樣本主要分布在第Ⅱ象限,8、9周大鼠尿液樣本主要分布在第Ⅲ象限,隨著時間推移,偏離正常狀態(tài)的現(xiàn)象十分明顯,見圖4。說明在造模過程中,大鼠的正常代謝逐漸發(fā)生紊亂,并且越后期代謝紊亂現(xiàn)象越明顯。2.2.2尿樣代謝產(chǎn)物的變化本實驗選擇病理變化程度最大的第9周的樣品進(jìn)行PLS-DA的代謝模式比較,分析55個個體差異代謝物,并對其相對濃度進(jìn)行t檢驗,最終鑒定了其中14個代謝物,結(jié)果表明,與正常對照組大鼠比較,模型對照組大鼠尿樣中戊二酸、苯丙酸、3,4-對羥基丁酸、9,12-十八碳烯酸、2,3,4-三羥基丁酸、蘇氨酸、丙氨酸含量明顯上升(P<0.05或P<0.01),檸檬酸、脯氨酸、N-苯乙酰甘氨酸、苯乙酸、壬二酸、己二酸、琥珀酸含量顯著下降(P<0.05或P<0.01),最終鑒定結(jié)果及14個代謝產(chǎn)物在模型對照組與正常對照組之間的含量具體變化情況,見表3。3產(chǎn)物的代謝產(chǎn)物及動力學(xué)信息代謝組學(xué)研究一般檢測的是大量生物樣品中分子量在1000以下的小分子化合物的組成,較常用的生物樣品包括:血樣、尿樣、組織液等生物體液。生物體液中的代謝物與細(xì)胞和組織中的代謝物處于動態(tài)平衡,生物體中細(xì)胞功能異常將導(dǎo)致生物體液成分的變化。所有由生理病理紊亂引起的直接化學(xué)反應(yīng),通過控制代謝的酶或核酸相結(jié)合而引起的內(nèi)源生化物質(zhì)在比例、濃度及代謝通量等方面的失調(diào)都會在代謝成分中得到反映。因此,從生物體液中代謝物的角度研究Ⅱ型糖尿病這種代謝紊亂性疾病是一個很好的渠道。尿液作為生物樣品的一種,獲取方法簡單,對生物體損傷小,小分子代謝產(chǎn)物種類繁多,信息量大,在代謝組學(xué)研究中較常使用。實驗結(jié)果表明,模型組大鼠尿液代謝譜隨著時間的推移逐漸發(fā)生偏離,而正常對照組大鼠尿液代謝譜隨時間推移雖然有偏離,但只在一維上向左偏移,偏離程度不顯著,表明在Ⅱ型糖尿病形成過程中及病變程度加深過程中,大鼠的代謝逐步偏離正常。另外組內(nèi)各個樣本點較分散,說明各樣本大鼠之間存在個體差異,可能是并發(fā)癥及其他因素干擾造成的。同時利用OPLS-DA中變量權(quán)重參數(shù)篩選出差異代謝產(chǎn)物共55個,經(jīng)NIST05譜庫鑒定了其中14種代謝物,其中三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)物檸檬酸、琥珀酸含量降低,氨基酸類物質(zhì)如脯氨酸、蘇氨酸、丙氨酸含量顯著上升。這與糖尿病病理狀況相符,胰島素不足時,一些酶活性減弱,使三羧酸循環(huán)減弱;并且蛋白質(zhì)代謝紊亂,肌肉及肝中蛋白質(zhì)合成減少而分解增多,血漿及尿液中氨基酸增多。同時本實驗中發(fā)現(xiàn)了β-羥丁酸的前體物質(zhì)3,4-二羥基丁酸、2,3,4-三羥基丁酸,β-羥丁酸是體內(nèi)酮體的最主要的組分且酸性最強,常被臨床選為發(fā)現(xiàn)潛在性致命性糖尿病酮癥酸中毒的可靠指標(biāo),這對糖尿病酮癥的早期治療極其重要,這與之前研究相一致。本實驗還檢測到一些含有苯環(huán)的化合物,例如,苯乙酸、苯丙酸、N-苯乙酰甘氨等,含有苯基的化合物是由腸道內(nèi)菌群代謝產(chǎn)生的,代謝的母體主要是食物中的多酚和食物蛋白質(zhì)分別出來的一些芳香族的氨基酸,如苯丙氨酸、酪氨酸等。II型糖尿病大鼠中隨尿液排出的苯乙酸、苯丙酸、N-苯乙酰甘氨等代謝產(chǎn)物含量較正常大鼠發(fā)生顯著性變化,在一定程度上表明II型糖尿病大鼠體內(nèi)的腸道菌群代謝發(fā)生紊亂。另外,在本實驗研究中,還發(fā)現(xiàn)了一些有機(jī)酸,如壬二酸、己二酸等,目前雖無相關(guān)文獻(xiàn)表明其與糖尿病有關(guān),但其含量變化表明其對糖尿病的相關(guān)代謝產(chǎn)生了影響,其所含有的生物學(xué)信息有待進(jìn)步一研究。清潔級雄性(SD)大鼠27只,體重180-200g(上海斯萊克實驗動物有限公司),生產(chǎn)許可證:SCXK(滬)2007-0005。鏈脲佐菌素(STZ),Sigma公司,生產(chǎn)批號:S0130;鹽酸甲氧胺(CH5NO·HCL)美國Sigma公司,生產(chǎn)批號:GA10827;MSTFA含1%TMCS,美國Sigma公司,生產(chǎn)批號:BCBB0780;吡啶(Pyridine),分析純,成都市科龍化工試劑廠,生產(chǎn)批號:20091103;正庚烷(C7H16),色譜純,Fluka公司,生產(chǎn)批號:904025;人胰島素放射免疫試劑盒(HumanI125-INSRIAKit),北京福瑞生物工程有限公司,生產(chǎn)批號:20111020028;大鼠血糖(GLU)測試盒,上海中能德賽技術(shù)診斷有限公司,生產(chǎn)批號:25043/952005/2;大鼠甘油三酯(TG)測試盒,上海中能德賽技術(shù)診斷有限公司,生產(chǎn)批號:57152/975006/2;大鼠總膽固醇(CHO)測試盒,上海中能德賽技術(shù)診斷有限公司,生產(chǎn)批號:13045/931006/2;羅氏活力型血糖儀,型號:CR2032,羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,型號:GCMS-QP2010,日本島津公司;Agilent色譜工作站,日本島津公司;毛細(xì)管柱(0.25mm×30m×0.25μm),型號:ZB-5MS,Agilent;自動放免儀,型號:SN682,中國科大中佳公司;全自動生化分析儀型號:7020,日本日立株式會所。健康雄性SD大鼠,隨機(jī)分成正常對照組(NC組)10只,Ⅱ型糖尿病模型組(T2DM組)17只。實驗前測定體重、血糖。NC組以普通飼料喂養(yǎng),T2DM組以高脂飼料(基礎(chǔ)飼料69.5%,蔗糖10%,蛋黃10%,膽固醇0.5%)喂養(yǎng),4周后,禁食16h,模型組參照文獻(xiàn),并結(jié)合本課題前期實驗結(jié)果,以30mg·kg-1單次小劑量腹腔注射1%STZ(用前以pH4.2的0.1mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制),之后繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)直至實驗結(jié)束。NC組注射等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作為對照。1周后尾靜脈采血測定空腹血糖,以空腹血糖大于11.1mmol·L-1確定為糖尿病成模型大鼠,成模14只。分別于造模成功后每周末即6~9周末禁食12h,尾靜脈采血測定空腹血糖。第9周周末眼眶取血,分離血清,按照TG、CHO檢測指標(biāo)作業(yè)指導(dǎo)書及衛(wèi)生部《全國臨床檢驗規(guī)程》對大鼠血清TG、CHO進(jìn)行檢測;按照胰島素放免試劑盒操作說明書放射免疫法測定大鼠血清FINS。于0~9周末用大鼠代謝籠收集大鼠尿液樣本,離心去沉渣,取上清液,加1%疊氮化鈉(NaN3),置-80℃超低溫冰箱凍存。尿樣代謝譜測定方法:取尿樣200μL,加20μL十七烷酸(1mg·mL-1)、400μL丙酮,渦旋混勻,冰浴超聲30min,10000r/min超速冷凍離心10min,取上清液400μL氮氣吹干,加入50μL甲氧胺吡啶溶液(15g·L-1),于70℃烘箱反應(yīng)1h,加75μL衍生化試劑[V(BSTFA):V(TMCS)=100:1],于室溫下反應(yīng)1h,加150μL正庚烷終止衍生化反應(yīng)。離心取上清液,進(jìn)入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,用色譜柱DB-5MS進(jìn)行分離。色譜條件:氦氣作為載氣,流速1.0mL·min-1,不分流,進(jìn)樣量1μL,毛細(xì)管柱(30m×25mm×0.25um,Agilent),進(jìn)樣口溫度270℃,離子源溫度230℃。程序升溫:起始溫度85℃,保持2min,以10℃·min-1升至180℃,保持10min,以10℃·min-1升至280℃,保持8min。共計41min。質(zhì)譜條件:電離方式EI,電子能量70eV,掃描范圍60~600m·z-1,全掃描方式,電壓0.75~0.8kv,溶劑切割為5.0min。生化數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。組間均數(shù)比較用t檢驗,P<0.05或P<0.01表示差異具有顯著性。造模成功后1周內(nèi),Ⅱ型糖尿病模型大鼠FBG明顯升高,在之后的4周動態(tài)觀察中模型對照組大鼠FBG基本穩(wěn)定,略有上升,與對照組比較差異均具有顯著性((P<0.01),見表1。實驗第9周末,模型組大鼠TG、CHO明顯升高,FINS含量顯著降低,與對照組比較差異均具有顯著性(P<0.01),如表2。由GC-MS檢測分析所得數(shù)據(jù),經(jīng)處理得到矩陣在SIMCA-P軟件中進(jìn)行多維統(tǒng)計分析。采用非監(jiān)督的PCA方法對正常對照組和模型對照組組樣本進(jìn)行分析,結(jié)果表明,第0~5周,樣本分離趨勢逐漸明顯,如圖1。第6周后,模型組與對照組之間的代謝輪廓有了清晰的區(qū)分,說明糖尿病大鼠成模