腎康丸對2型糖尿病大鼠血清nf-、il-6及p-sa3表達(dá)的影響

腎康丸對2型糖尿病大鼠血清nf-、il-6及p-sa3表達(dá)的影響

糖尿病性腎衰竭（dn）是2型糖尿病患者（md）常見的微血管并發(fā)癥，難以治療。近年來,大量研究證實,DM是一種慢性炎癥性疾病,炎癥反應(yīng)是其發(fā)生和發(fā)展的重要因素之一,TuttleKR提出,DM是一種糖脂代謝紊亂引起的炎癥性疾病。該觀點(diǎn)日益受到重視,而針對DM(或DN)炎癥反應(yīng)的治療亦受到較多關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),與2型DM有關(guān)的炎癥因子主要有腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)系列、C反應(yīng)蛋白(CRP)、纖溶酶原激活物抑制物(PAI-1)、脂肪因子和其他如唾液酸、內(nèi)皮黏附分子等,其中TNF-α可通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起炎癥因子升高,進(jìn)而導(dǎo)致腎臟損害、胰島素抵抗(IR)等,從而在DN的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。因此,抗炎治療或成為DN的治療措施之一。前期,筆者通過臨床研究發(fā)現(xiàn),腎康丸可降低早期DN患者血清中TNF-α、CRP、IL-6水平,產(chǎn)生腎臟保護(hù)作用。本實驗通過觀察給藥后大鼠尿α1-微球蛋白(Uα1-MG)、血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)、TNF-α、IL-6及腎臟磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子-3(p-STAT3)表達(dá)的變化,進(jìn)一步探討腎康丸對2型DM大鼠產(chǎn)生腎臟保護(hù)作用的分子生物學(xué)機(jī)制。1材料表面1.130只wistar大鼠，2個月大，體重170.200g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：scxk粵2006-00151.2試驗藥物腎康丸由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥物系統(tǒng)一藥。其活性物質(zhì)為黃原、金盞子、水貂和母字，制劑號為20080424、6g/袋。支持信息。添加申國康氏有限公司，批號0714，12.5mg1.3主要試劑鏈佐菌素stz，sig，美國；u1-mg、血清tnf-i和il-6elisa試劑盒均由美國adl公司購買；兔子抗大鼠p-stat3igg一種抗動物、兔子抗大鼠r-afill和美國賽加爾特公司標(biāo)記的羊抗兔子igg兩種抗動物2方法2.1模型的制備和組成根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)制作了2型大鼠模型。在7天的適應(yīng)性喂食后，隨機(jī)分為2組：標(biāo)準(zhǔn)飼料組正常對照組c組6份，并給標(biāo)準(zhǔn)飼料。24只基準(zhǔn)小鼠d模型模型組，高脂肪高粱飼料標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料、糖、炒豬、面粉、蛋黃醬、63%、20%、15%、4%和2%。所有動物都自由地吃水。在高熱量飼料4周后，d組大鼠腹腔注射鏈片30mg和c組大鼠c緩沖液。注射72小時后，術(shù)后腹部血糖比再次測量，連續(xù)兩次腹部血糖值13.5mmol。注射d組19例，符合d組診斷標(biāo)準(zhǔn)。之后，將19例模型大鼠隨機(jī)分為三組，并添加高脂肪糖：模型模型組m組，n.7；接受英普治療組de組，n.6；腎康丸治療組dns組，n.6。其中，d組口服二甲基貝5mg/kg，每周給胃兩次。sd組每天服用1.8g/kg的腎康丸，每次服用1.88mg/kg，插入胃。c組和m組每天服用相應(yīng)的體積生理鹽水。治療8周2.2收集和處理樣本的小鼠，并在第四周和第八周收集尿液，檢測u1-mg。在去世前一周，禁止12小時，稱重體重，腹腔注射10%氯乙二醇300mg/kg麻醉動物，向腹部動脈采血，分離血清并將其儲存在pp20c下2.3用自動生物化學(xué)分析儀檢測bun和cr，用u1-mg、tnf-i和il-6進(jìn)行觀察和測試2.4以低于通常水平的腎組織為特征的p-stat3，以約50mg腎組織為特征的分子，在玻璃平板上測定腎組織，并添加ripa抗裂緩沖液以分解組織。冰浴1h，4'min，14000r*min。離心5min后，取出懸浮液，在奶味蛋白濃度分析試劑盒中測定蛋白質(zhì)濃度。用ripa解釋劑將每個孔20l的蛋白質(zhì)作為50g，用8%十二烷基硫酸鈉-聚吡咯烷基膠體進(jìn)行電泳分析，然后轉(zhuǎn)移到pvdf膜。對于50cml脫脂牛奶粉，添加p-stat3多克隆抗體1.04稀釋。4后，在再次清洗膜后，添加過量標(biāo)記的羊抗羊抗體1.2000稀釋，并在37下培養(yǎng)1.5h。清潔膜后，加入ecl化學(xué)發(fā)光試劑，然后將pvdf膜放入凝膠分析系統(tǒng)biorad公司。這個是內(nèi)部的2.5統(tǒng)計方法采用spss13統(tǒng)計軟件。0.數(shù)據(jù)用x表示。采用離散度分析，組間比較采用一段時間。采用lsd法，離散度小于1tr33結(jié)果3.1治療后，兩組小鼠的u-1mg比較見表1。治療4周和8周后，m組、da組和de組的u-1mg顯著增加，與c組相比呈顯著差異p0.01。m組和sd組之間的u-1mg差異顯著p0.01。sso組和de組之間的差異沒有顯著差異p0.053.2表2顯示了治療后各組大鼠的bun和cr值的比較。治療第8個周末，m組的bun和cr值水平升高，與c組相比有顯著性差異p.0.01。de組和沉積物組的bun和cr值水平均下降，與m組相比呈顯著性差異p.0.01，而c組則差異p.0.05。兩組之間的bun水平低于de組，這是顯著的p.0.05，兩組之間的cr值沒有顯著差異p.0.053.3治療后，兩組大鼠的血清tnf-i和il-6級的差異見表3。在治療8周后，m組的血清tnf-i和il-6級顯著高于c組p.0.01。與m組相比，de-d組的tnf-i和il-6級顯著低于a組p-0.01。兩組之間的差異沒有顯著差異p0.05。三組和c組之間的il-6級差異沒有顯著差異p0.053.4治療后，兩組均發(fā)現(xiàn)腎臟p-stat3發(fā)現(xiàn)變化。治療8個周末后，c組大鼠腎臟組織中的p-stat3僅出現(xiàn)少量跡象，而m組大鼠和c組小鼠的p-stat3表現(xiàn)顯著增加。e組和sso組大鼠腎臟p-stat3的發(fā)現(xiàn)顯著低于m組，兩組之間的差異不明顯4腎康丸和依那西普對dn治療后腎功能的作用近年來研究發(fā)現(xiàn),許多疾病均與亞臨床的炎癥反應(yīng)有關(guān),例如動脈硬化(AS)、2型DM及代謝綜合征等。因此,Fernandez-RealJM等提出2型DM是一種慢性炎癥性疾病的觀點(diǎn),炎癥可能參與2型DM患者脂代謝異常、IR及AS等的發(fā)生。亞臨床系統(tǒng)炎癥標(biāo)志物,特別是TNF-α、IL-6、CRP等在2型DM及代謝綜合征中明顯異常。在STZ誘導(dǎo)的DM大鼠血清中上述致炎細(xì)胞因子是升高的,并且腎小球系膜間質(zhì)中TNF-α表達(dá)亦顯著增加,而正常對照組腎組織幾乎無TNF-α。這在筆者既往的臨床研究中也證實了這點(diǎn)。DN作為DM的一種重要血管并發(fā)癥,炎癥反應(yīng)對其發(fā)生發(fā)展同樣起著關(guān)鍵作用,其中TNF-α在DN發(fā)病中的作用尤為重要。TNF-α作為炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵的炎性細(xì)胞因子,可引發(fā)細(xì)胞因子的級聯(lián)效應(yīng),同其他炎癥因子一起與脂肪內(nèi)分泌、氧化應(yīng)激、免疫系統(tǒng)等相互作用,從而導(dǎo)致2型DM及其并發(fā)癥的發(fā)生。TNF-α升高,可誘導(dǎo)IL-6、IL-1等炎癥因子的合成增加。其中,IL-6與腎小球系膜細(xì)胞上的IL-6受體結(jié)合后,可激活下游的Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(JAK/STAT3)信號通路,誘導(dǎo)JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化,從而導(dǎo)致STAT3蛋白的表達(dá)增加,磷酸化STAT3(p-STAT3)表達(dá)增強(qiáng),后者進(jìn)一步促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β的分泌,最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增生和腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,引起腎臟損害。因此,TNF-α/IL-6/p-STAT3信號途徑在DN的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用。DN早期以微量白蛋白尿出現(xiàn)為標(biāo)志。研究認(rèn)為,DN早期,腎小球病變的同時存在腎小管損傷,甚至腎小管損傷早于腎小球病變,腎小管和腎間質(zhì)的病變已經(jīng)得到廣泛的重視。α1-MG作為腎近曲小管受損傷的指標(biāo)之一,明顯早于尿白蛋白出現(xiàn)。本研究選擇Uα1-MG作為DM大鼠腎損傷觀察指標(biāo),經(jīng)過8周治療,腎康丸和依那西普均可降低患者Uα1-MG,前者作用更明顯;對照組Uα1-MG與治療前比未減少。說明已經(jīng)發(fā)生了早期DN的改變。DN屬中醫(yī)學(xué)腎消范疇,早期辨證為氣陰兩虛、腎虛血瘀;隨著病情進(jìn)展,出現(xiàn)脾腎兩虛、氣虛血瘀。病機(jī)特點(diǎn)是本虛標(biāo)實。因此,治療DN應(yīng)治本補(bǔ)虛、治標(biāo)祛邪。腎康丸具有益氣健脾、滋陰養(yǎng)腎、活血通絡(luò)等功效。筆者的前期臨床研究證實,給予腎康丸治療后,可降低早期DN患者血清中TNF-α、IL-6、CRP等水平,產(chǎn)生不依賴于降脂及降糖的腎保護(hù)作用。本實驗進(jìn)一步表明腎康丸可以降低DM大鼠血清中TNF-α、IL-6等水平,同時,應(yīng)用腎康丸治療后,DS組大鼠較M組大鼠的一般狀況得到明顯改善,BUN、Cr顯著降低,腎臟功能得到改善,并且腎康丸降低BUN的作用優(yōu)于依那西普,腎臟組織p-STAT3的表達(dá)明顯降低。說明腎康丸、依那西普均對DM大鼠起到腎臟保護(hù)作用,其機(jī)制可能與降低血清TNF-α水平,從而減少了由TNF-α所引起的IL-6分泌,使TNF-α/IL-6/p-STAT3信號通路下游的p-STAT3的表達(dá)減少,從而避免TGF-β等細(xì)胞因子的過度生成有關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn),使用依那西普治療后,大鼠一般狀況較腎康丸組改善明顯,血清TNF-α、IL-6水平下降更低,但統(tǒng)計學(xué)上與腎康丸組之間并無差異