代謝病研究常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)

代謝病研究常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡介樣品中維生素D的含量測定無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)尤斯灌流室系統(tǒng)膜片鉗系統(tǒng)介紹CNV維生素D的含量測定維生素D簡介功能性維生素D主要包括D3和維生素D2。維生素D除了具有傳統(tǒng)意義上的骨骼效應(yīng)，它還有著廣泛的非骨骼效應(yīng)，與心血管疾病，免疫疾病，糖尿病，腫瘤等疾病密切相關(guān)。25-羥基維生素D（25HD）的測定是衡量維生素D營養(yǎng)狀態(tài)的最佳指標(biāo)。根據(jù)測定原理不同，目前25HD的測定方法有:放射免疫法(RIA)——靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密度好、儀器設(shè)備條件要求不高。是基層單位對超微量物質(zhì)測定的主要手段。但存在放射污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)——儀器設(shè)備操作簡單無污染但靈敏度和特異性低。是目前實(shí)驗(yàn)室較常用的檢測方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測定(CLIA)——操作簡單，快速且容易自動化，現(xiàn)已有多家廠商開發(fā)出相關(guān)自動免疫分析儀。25HD的測定方法:4.高效液相色譜法(HPLC)——靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性都較高，但設(shè)備較貴且標(biāo)本前處理過程復(fù)雜。4.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)——靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性都高但操作程序較復(fù)雜且需要更昂貴的特殊儀器。ELISA法檢測原理標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣本被標(biāo)記有25羥基維生素D

的生物素稀釋。稀釋后的樣品在包被了高特異性羊

25羥基維生素D抗體的微孔中室溫孵育2小時(shí)后，加

入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素蛋白并有選擇的

與復(fù)合生物素結(jié)合，再利用底物顯色。利用酶標(biāo)板

讀取吸光度，顏色強(qiáng)度與25羥基維生素D濃度成反比。維生素D的含量測定臨床血液樣品的制備與分組

血液中維生素D的檢測：應(yīng)用25羥基維生素D酶免疫試劑盒定量測定人體血清或血漿中的25羥基維生素D和其他羥基化的代謝產(chǎn)物檢測結(jié)果的分析方法臨床血液樣品的制備

全血樣品采集完畢待自然凝固后放置4～8℃環(huán)境中過夜，8000轉(zhuǎn)離心4分鐘，取上清液置于新離心管內(nèi)。合格血清標(biāo)準(zhǔn)血清質(zhì)量性狀要求外觀清亮流動性較好。血清應(yīng)未腐?。ㄐ迈r）、無溶血、透明（無明顯沉淀物）、無雜質(zhì)、未凝固或未完全凝固、體積足夠檢測與樣品備份。血液中維生素D的檢測檢測結(jié)果的分析方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在半對數(shù)坐標(biāo)紙上做出一條校準(zhǔn)曲線（以B/B0%為縱坐標(biāo)，25-OH-VitD濃度為橫坐標(biāo)）。每個(gè)待測樣本都計(jì)算B/B0%并且讀數(shù)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找對應(yīng)的25-OH-VitD濃度值。介紹CNV無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)的操作方法動物血壓采集原理鼠模型的確立與分組血壓采集器的操作采集數(shù)據(jù)的分析傳統(tǒng)的血壓計(jì)測量小動物血壓：被測量的小鼠無法適應(yīng)造成血壓值不具有代表性；血壓產(chǎn)生的振動波微弱很難檢測到或是夾雜噪音；小鼠在測量過程中騷動破壞了測量過程。無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)簡介無創(chuàng)血壓測量裝置和系統(tǒng)用于慢性實(shí)驗(yàn)中動物動脈血壓的觀測,動物不需麻醉、無創(chuàng)傷、使用方便。采用國際上流行的尾袖法無創(chuàng)測量血壓原理，適用的動物包括大、小白鼠、貓和狗等。無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)測量原理與人體手臂血壓測量方法相似。即通過對動物肢體或尾部加壓，阻斷其血壓，以不能記錄肢體或尾部脈搏為準(zhǔn)；然后逐漸減壓，當(dāng)尾部重新出現(xiàn)脈搏波時(shí)（即內(nèi)外壓相等時(shí)）獲得動物的收縮壓；繼續(xù)減壓，直至脈搏波逐漸增至最大，得到動物的舒張壓。無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)特點(diǎn)全自動的無創(chuàng)血壓測量過程：系統(tǒng)自動充放氣，自動實(shí)時(shí)測量并存貯測量結(jié)果；一次可同時(shí)測量6只大鼠血壓，大大提高了實(shí)驗(yàn)人員的工作效率；測量多項(xiàng)無創(chuàng)血壓生理指標(biāo)，包括：收縮壓、舒張壓、平均壓、心率等；方便的測量方式和測量數(shù)據(jù)的導(dǎo)出。無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)組成該系統(tǒng)由通用8道生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、BP-6A恒溫箱、鼠尾脈搏探測和阻斷器、大鼠固定籠以及

BP-6A服務(wù)器構(gòu)成。8通道信號采集系統(tǒng)通用8道生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)不僅可以完成無創(chuàng)血壓測量功能，還可記錄其它生物信號，如張力、心電等，大大拓寬了該系統(tǒng)的適用范圍。BP-6A恒溫箱為最多6只大鼠同時(shí)提供恒溫環(huán)境，同時(shí)減少實(shí)驗(yàn)動物的外界干擾。該箱體內(nèi)嵌微電腦控制系統(tǒng)，可以自動控制血壓測量過程中的充放氣，鼠尾脈搏信號的轉(zhuǎn)接和傳送等。BP-6A恒溫箱控制面板。鼠尾脈搏探測和阻斷器一體化鼠尾脈搏探測器和鼠尾脈搏阻斷器，其中探測器用于獲取鼠尾正常脈搏信號，而阻斷器用于阻斷尾部正常脈搏信號。BP-6A系統(tǒng)的其它附件包括：大鼠固定器，

USB連線，信號連接線等。無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)操作步驟（1）使用專門的連接線連接加熱箱控制面板上的脈搏傳感器輸出口與動物無創(chuàng)血壓采集系統(tǒng)8道系統(tǒng)；將傳感器上的接頭插到對應(yīng)機(jī)箱內(nèi)的連接器接頭上，將進(jìn)氣口的氣管連接在機(jī)箱內(nèi)對應(yīng)的充氣口接口上。將動物血壓測量系統(tǒng)通過USB連接線連接到電腦上，打開軟件，進(jìn)入到軟件界面。打開BP-6A的電源，系統(tǒng)開始進(jìn)行加熱，設(shè)定實(shí)驗(yàn)所需的加熱溫度，一般情況設(shè)置為36℃。無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)操作步驟（2）將大鼠放入鼠籠內(nèi)固定（注意一定要保持大鼠腹壁向下）固定好后將其整體放入加熱箱內(nèi)。將大鼠鼠尾穿過傳感器，并盡可能將傳感器置于鼠尾根部在無創(chuàng)機(jī)箱后覆蓋一層厚的深色窗簾，減小光線對大鼠的影響。從實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目菜單中選擇“無創(chuàng)血壓測量”命令，選擇工具條上“啟動實(shí)驗(yàn)”按鈕，軟件界面中即有信號出現(xiàn)。無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)操作步驟實(shí)驗(yàn)開始后，老鼠需要20min才能出現(xiàn)穩(wěn)定波形。待出現(xiàn)穩(wěn)定的脈搏波后，按下機(jī)箱控制面板上的“啟/停鍵，系統(tǒng)開始按照設(shè)定的參數(shù)對大鼠尾部血流進(jìn)行加壓阻斷，調(diào)節(jié)增益得到最佳的阻斷波形。系統(tǒng)默認(rèn)的加氣阻斷時(shí)間為10min，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求更改但最少不能短于1min。達(dá)到設(shè)定時(shí)間后，系統(tǒng)會自動停止運(yùn)行或者按“啟/?！辨I停止實(shí)驗(yàn)，將波形保存以供分析。無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)盡量將傳感器放置在鼠尾根部；必須對大鼠進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)前的訓(xùn)練；實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)盡量減少打開機(jī)箱門的次數(shù)；如果實(shí)驗(yàn)的大鼠少于

6

只，應(yīng)該用橡膠塞將未使用通道的充氣口阻塞。實(shí)驗(yàn)過程當(dāng)中應(yīng)保持安靜。介紹CNV實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（

Realtime

Quantitative

PCR

）PCR（Polymerase

Chain

Reaction）技術(shù)的產(chǎn)生In

1983,

Kary

Mullis

invented

a

process

he

called

PCR,which

solved

a

core

problem

in

genetics:

How

to

makecopies

of

a

strand

of

DNA

you

are

interested

in.PCR技術(shù)的應(yīng)用“…真正驚人的是PCR完全不是為解決某一個(gè)問題而設(shè)計(jì)的，該技術(shù)成熟之后，它所能解決的問題才開始涌現(xiàn)…”——史蒂文·沙夫定性（基因突變、基因分型等、甲基化檢測等）定量（基團(tuán)拷貝數(shù)差異、基因表達(dá)，不同組織，不同時(shí)間，不同處理）Realtime-PCR的產(chǎn)生、原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)利用擴(kuò)增過程中熒光信號隨產(chǎn)物累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過特定數(shù)學(xué)原理對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。與普通PCR相比優(yōu)點(diǎn)特異性好（Taqman法），使用特異性探針對定量分子進(jìn)行識別，靶序列由引物和探針雙重控制。線性范圍寬，即使模板量很小也能獲得較為準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。操作簡單，省去純化、電泳等產(chǎn)物后處理過程，高通量。確保取值點(diǎn)處于指數(shù)增長期Realtime-PCR的類型染料法探針法根據(jù)方法SYBR

Green（染料實(shí)法）驗(yàn)情況和條件Tagman

（探針法選）擇合適的性質(zhì)可逆熒光積累熒光融解曲線分析能不能特異性引物（非特異性擴(kuò)增或引物二聚體有影響）引物+探針探針不需要需要通用性通用專用成本較低較高方法（2-

△△Ct）樣本1的待測基因樣本2的待測基因樣本1、2的參照基因待測基因(Ct)參照基因(Ct)正常樣相本對A定量計(jì)B算病人樣本CD樣本1-正常樣本樣本2-病人樣本調(diào)查待測基因在病人樣本中的表達(dá)與在正常人相比有何差別。表達(dá)量=2-[(C-D)-(A-B)]表達(dá)量>1，表達(dá)上調(diào)表達(dá)量<1，表達(dá)下調(diào)RT-PCR實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意的問題RNA質(zhì)量：完整性、純度反轉(zhuǎn)錄引物選擇PCR引物的設(shè)計(jì)加樣前準(zhǔn)備工作RNA質(zhì)量OD260/280在1.9-2.1之間純度最好小于1.8，表明蛋白雜質(zhì)較多大于2.2，表明RNA已經(jīng)降解反轉(zhuǎn)錄引物選擇Oligo

dT要求RNA必須有Poly

A，適用于真核生物。適合長鏈、全長RNA的RT，對RNA樣品質(zhì)量要求較高，不能有斷裂。Random

Primer適合各種RNA的RT，尤其是豐度低的模板和具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的模板。PCR引物的設(shè)計(jì)引物本身盡量不要有二級結(jié)構(gòu)（上下游之間，發(fā)夾結(jié)構(gòu)）GC數(shù)量之和與AT數(shù)量之和相差不大，并且均勻分布產(chǎn)物片段不要太大，一般100-200bp左右為宜加樣前的準(zhǔn)備工作將DNA樣品或cDNA樣品做適當(dāng)稀釋標(biāo)明加樣板上每個(gè)孔中要加的模板及引物，相同的樣品盡量排列在一起，以免污染或錯(cuò)加寫明反應(yīng)體系寫出清晰明了的分裝示意介紹CNV尤斯灌流室系統(tǒng)（Ussing

Chamber）尤斯灌流室系統(tǒng)1951年,丹麥學(xué)者Hans

Ussing首次將Ussingchamber(尤斯灌流室)介紹于世,其主要功能是通過微電極檢測整個(gè)細(xì)胞膜離子通道變化的電流信號,來反映腸道藥物吸收、通透性和分泌情況的變化。上皮細(xì)胞電生理基礎(chǔ)。上皮組織構(gòu)成：密集排列的上皮細(xì)胞;細(xì)胞間質(zhì)上皮組織特征:極性:細(xì)胞頂面和基底面結(jié)構(gòu)和功能分布不均形成緊密連接:阻止細(xì)胞外的大分子物質(zhì)經(jīng)細(xì)胞間隙進(jìn)入組織內(nèi)。緊密連接的形狀和滲透性決定上皮組織的完整性以及對物質(zhì)的阻抗力(Rt)。一般都能進(jìn)行鉗電壓和鉗電流操作。尤斯灌流室系統(tǒng)原理尤斯灌流室系統(tǒng)組成單個(gè)獨(dú)立的尤斯灌流室（Ussing

chamber）；用于控制溫度的加熱塊；用于調(diào)節(jié)氧化與氣升攪拌氣流的針形閥；用于測量跨上皮電壓和通過電流的Ag/AgCl參考電極；與電壓/電流鉗的連接導(dǎo)線。打開水浴預(yù)熱、尤斯灌流裝置及計(jì)算機(jī)；插入電極、連接電極線、調(diào)零；開氣閥，系統(tǒng)條件穩(wěn)定以后裝入組織；

打開‘Acquire

and

Analyze

2.3’軟件，開始記錄電流及電阻。尤斯灌流室系統(tǒng)操作步驟目前,

其應(yīng)用主要集中在藥學(xué)領(lǐng)域,通過微電極檢測細(xì)胞膜離子通道的電流及電阻變化：測定轉(zhuǎn)運(yùn)電流：是否有載體或外流泵參與轉(zhuǎn)運(yùn)；腸道的通透性研究；研究藥物的腸代謝、腸腔的分泌情況；研究藥物對腸電生理參數(shù)的影響等。尤斯灌流室系統(tǒng)應(yīng)用介紹CNV膜片鉗制技術(shù)（Patch-clamping）德國科學(xué)家Erwin

Neher和Bert

Sakmann(1991年諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng))發(fā)明的可以記錄單一離子通道電流的電生理學(xué)技術(shù)。在單細(xì)胞膜片鉗記錄系統(tǒng)中，完整的記錄系統(tǒng)主要包括以下配置：

電子原件（膜片鉗放大器、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器）、微操作器、實(shí)驗(yàn)平臺（防震臺、屏避罩、空氣泵）、顯微系統(tǒng)、給藥系統(tǒng)、微電極拉制器、微電極拋光儀等。膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的基本配置Axopatch

200B膜片鉗放大器

專門用于細(xì)胞膜電位信號放大的單探頭超低噪聲膜片鉗放大器。

主要應(yīng)用于單通道記錄、全細(xì)胞記錄、人工雙分子層膜片鉗記錄、松散封接記錄、電化學(xué)檢測（伏安法/安培測量法）。最適合進(jìn)行單通道記錄，尤其是小電導(dǎo)的單通道記錄。其主要特點(diǎn)為具有超低噪聲，是目前世界上噪聲最低的膜片鉗放大器之一。膜片鉗系統(tǒng)的操作步驟１．膜片鉗微電極制作(1)

玻璃毛細(xì)管的選擇：直徑應(yīng)符合電極支架的規(guī)格，一般外部直徑在

1.1-1.2mm，內(nèi)徑1mm。軟質(zhì)的蘇打玻璃硬質(zhì)的硼硅酸鹽玻璃(2)電極的拉制