食品分析-湖北大學第八章蛋白質和氨基酸的測定課件

蛋白質和氨基酸測定學習目標1.了解蛋白質和氨基酸的性質2.明確蛋白質和氨基酸測定方法2.掌握凱氏定氮法測定蛋白質的過程及注意事項3.了解氨基酸的性質和測定方法蛋白質和氨基酸測定內容1.概述2.凱氏定氮法3.蛋白質的快速測定法4.氨基酸總量的測定5.氨基酸的分離與測定1.概述(1)蛋白質的生理功用及在食品中的作用（2）食品中的蛋白質含量（3）蛋白質系數（4）蛋白質水解（5）蛋白質測定方法(6)氨基酸的測定與分離方法2.凱氏定氮法原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以標準HCl溶液滴定。根據標準酸消耗量可以計算出蛋白質的含量。食品中的蛋白質測定

原理、過程及試劑消化——蒸餾與吸收——滴定消化----濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀蒸餾----氫氧化鈉吸收----硼酸滴定----鹽酸、混合指示劑消化2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4

（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用濃硫酸（98%）蒸餾與吸收

消化液+40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。滴定用鹽酸標準溶液滴定至終點.然后進行計算.微量凱氏定氮裝置蛋白質測定儀------消化、蒸餾吸收蛋白質測定儀---滴定KDN型蛋白質測定儀

QSY-Ⅱ型蛋白質測定儀

3.蛋白質的快速測定法

傳統(tǒng)的凱氏定氮法應用范圍廣，靈敏度高、準確，不要大儀器，但費時間，有環(huán)境污染。新開發(fā)的：雙縮脲法、紫外分光光度法、染料結合法、水楊酸比色法等。下面簡單介紹雙縮脲法1. 原理脲（尿素）NH2—CO—NH2加熱至150~160℃時，兩分子縮和成雙縮脲。雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡和物，這種反應叫雙縮脲反應。（縮二脲反應）蛋白質分子中含有肽鍵—CO—NH—與雙縮脲結構相似。在同樣條件下也有呈色反應，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質含量成正比，可用分光光度計來測其吸光度，確定含量。（560nm）NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3NH2—CO—NH2

+

NH2—CO—NH2方法特點及應用范圍本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學領域中測定蛋白質含量時常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。4.氨基酸總量的測定

（一）甲醛滴定法（二）茚三酮的比色法（一）甲醛滴定法1.原理：氨基酸本身有堿性—NH2—基，又有酸性—COOH基，成中性內鹽，加入甲醛溶液后，甲醛與—NH2—結合，堿性消失，再用強堿來滴定—COOH基。2．適用范圍：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氮量，其發(fā)酵過程中氮量減少情況及食品中游離氨基酸的測定等。3．試劑：①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至藍色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液，③0.1%中性紅50%乙醇溶液，④0.1mol/L氫氧化鈉標準溶液。4．操作：同時取兩份樣：一份中加中性紅指示劑，用氫氧化鈉直接滴，中和樣液中其它酸性物質。另一份中加百里酚酞、中性甲醛用NaOH滴，中和了樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質的總和。二者之差可計算氨基酸含量（二）茚三酮的比色法

原理：氨基酸在一定條件下與茚三酮起反應，生成藍紫色化合物，可比色定量。5.氨基酸的分離與測定（一）薄層色譜法（二）氨基酸自動分析儀法（三）氣相色譜法（四）高效液相色譜法（一）薄層色譜法原理：

取一定量經水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種混合物可達到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標準氨基酸進行對比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點顏色的深淺可以大致確定其含量。Rf=a/bab樣點溶劑前沿點樣原點操作方法：①薄層板制備②樣品液制備③點樣④展開⑤顯色（二）氨基酸自動分析儀法（