分子生物學(xué)學(xué)習(xí)資料：answer-ch11

11.2描述一個說明TFⅡD是第二類聚合酶的起始前復(fù)合體的基礎(chǔ)成分的實驗，并給出該實驗的結(jié)果。答：Reinberg、Greenblatt以及他們的研究伙伴所做的通過分析蛋白缺失時的凝膠遷移率來檢測各個蛋白的結(jié)合順序的實驗證明了TFⅡD是第二類聚合酶的起始前復(fù)合體的基礎(chǔ)成分。該實驗分兩組進行，方法與結(jié)果具體如下：第一組：關(guān)于DABPolF復(fù)合體，研究者使用TFⅡD、A、B、F和RNA聚合酶二，以及包含腺病毒主晚期啟動子的帶標(biāo)DNA做凝膠遷移率檢測。第1道顯示出的是由TFⅡD和TFⅡA組成的AD復(fù)合體；第2道加入了TFⅡB，顯示出出現(xiàn)了新的復(fù)合體DAB；第3道又加入了TFⅡF，但是看起來與第二道差不多，這說明TFⅡF好像在聚合酶Ⅱ不存在的時候不會綁定上去；第4-7道中加入了越來越多的聚合酶Ⅱ，結(jié)果顯示大聚合體DABPolF以及DBPolF開始出現(xiàn)并越來越多；第8-11道將TFⅡF量逐漸減少，結(jié)果顯示大聚合體的數(shù)量也越來越少，直到第12號道TFⅡF的量減少至0，也就沒有DABPolF和DBPolF出現(xiàn)了，這暗示TFⅡF行使著將聚合酶Ⅱ帶到復(fù)合體上的功能；第13道只缺少TFⅡD，我們發(fā)現(xiàn)在TFⅡD不存在的情況下根本沒有任何復(fù)合體產(chǎn)生；第14道只缺少TFⅡB，結(jié)果是只形成了DA復(fù)合體；第15道只缺少TFⅡA，結(jié)果是TFⅡA的不存在并不影響DBPolF的形成；第16到為對照，說明在所有的因子都存在的情況下可以形成所有的復(fù)合體。第二組：關(guān)于DBPolFEH復(fù)合體，研究者使用在包含腺病毒主晚期啟動子的帶標(biāo)DNA上裝配的DBPolF復(fù)合體（不含TFⅡA，第1道）為起始進行研究。然后他們依次加入TFⅡE和TFⅡE+H（第2、3道），結(jié)果顯示每加入一個新因子，復(fù)合體就會變得更長，遷移率的減少就會更多。第4-7道再現(xiàn)了缺少各種因子的情況（如圖上首行所標(biāo)），最好的狀況是形成了DB復(fù)合體（第4、5道），最差的狀況是在缺少TFⅡD的情況下沒有任何復(fù)合體形成。通過這兩組實驗我們可以看出，在缺少TFⅡD的情況下不會有任何復(fù)合體產(chǎn)生，也就是說TFⅡD是最先綁定在DNA上的，其他因子的綁定都取決于TFⅡD在TATAbox上的存在與否。也就證明了TFⅡD是第二類聚合酶的起始前復(fù)合體的基礎(chǔ)成分。11.4TFIIF和RNA聚合酶II可以互相結(jié)合，但這兩者都不能單獨結(jié)合在前轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體上。找到一個可以證明以上結(jié)論的實驗，描述實驗條件并給出實驗結(jié)果。答：下圖是一個體現(xiàn)DABPolF復(fù)合體形成的實驗的實驗結(jié)果：Reinberg及其同事用TFIID，A，B，F(xiàn)和RNA聚合酶II，以及標(biāo)記過的含腺病毒晚期啟動子的DNA片段進行了凝膠移動性變化實驗。結(jié)果的解釋如下：第1泳道展示的是由TFIID和A組成的DA復(fù)合體。第2泳道展示的是在DA復(fù)合體基礎(chǔ)上添加TFIIB后可以形成新的DAB復(fù)合體。第3泳道加入了TFIIF，但沒有RNA聚合酶II，其結(jié)果與第2泳道基本一致，說明在無RNA聚合酶II的情況下，TFIIF無法與DAB復(fù)合體結(jié)合進一步形成新的復(fù)合體。第4至7泳道在含D，A，B，F(xiàn)的基礎(chǔ)上又加入了濃度逐漸增加的RNA聚合酶II，可見，在加入RNA聚合酶II后，F(xiàn)可以與其結(jié)合形成PolF，后者可以進一步與DAB或DB結(jié)合形成新的復(fù)合體。第8至11的情況與第4至7道相似，不同的是濃度發(fā)生變化的是TFIIF。第12泳道與第3泳道相似，在無TFIIF的情況下，RNA聚合酶II無法與DAB進一步結(jié)合形成新的復(fù)合體。第13泳道說明在D不存在的情況下，無法形成任何復(fù)合體，也就是說TFIID是形成前轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的關(guān)鍵因素。綜合上面的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)如果TFIIF和RNA聚合酶II結(jié)合到前起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的必要條件是TFIIF和RNA聚合酶II均存在，二者結(jié)合后才能進一步與DAB結(jié)合。二者中單獨的一方均無法與DAB結(jié)合。11.5說出分別由DAB和DABPolF復(fù)合體得到的印跡法結(jié)果的不同之處。根據(jù)這個不同，說說你能得到的結(jié)論。答：圖11.5A即為DAB和DABPolF復(fù)合體做印跡法得到的結(jié)果。兩個結(jié)果的不同之處在于，DABPolF復(fù)合體保護的范圍比DAB復(fù)合體保護的范圍大了很多，有一個很長的空白斷帶。從圖中推斷，TFⅡD，A和B保護了TATAbox區(qū)域（在-17到-42位）。但是RNA聚合酶Ⅱ，TFⅡF兩者擴大了這個保護的范圍，在非模板鏈上大約達到了34堿基，即從-17到+17位。圖11.5B說明了其中一種解釋的方式。在DAB復(fù)合體的基礎(chǔ)上，RNA聚合酶Ⅱ與TFⅡF因子相互作用，可能形成一個二元的復(fù)合體。從而擴大了保護的區(qū)域。圖11.511.6描述一個能夠體現(xiàn)TATAbox中的突變能對TATAbox結(jié)合蛋白(TBP)結(jié)合產(chǎn)生影響的實驗，并給出這個實驗的結(jié)果。答：實驗名稱重組人類TATAbox結(jié)合蛋白與野生型和突變型TATAbox結(jié)合比較實驗步驟(a)與野生型TATAbox結(jié)合1.實驗前分別在牛痘病毒和細菌中克隆人類TATAbox結(jié)合蛋白vhTBP和bhTBP。2.使這兩種蛋白分別與呼吸系統(tǒng)病毒后期啟動子結(jié)合，每種蛋白的加樣量逐步增大。3.用印跡法來測定結(jié)合效率。每種蛋白的加樣量按照譜圖頂部的楔形符號逐步增大。(b)與突變型TATAbox結(jié)合使用含有突變型TATAbox（野生型的序列TATAAAA突變成TTATCAT）的DNA來做與（a）相同的測試。(c)使野生型TATAbox與克隆人類TATAbox結(jié)合蛋白的C末端180個保守的氨基酸組成的片段結(jié)合，做相同的測試。實驗結(jié)果(a)兩種重組人類TATAbox結(jié)合蛋白在TATAbox上留下了相同的印跡，對照組中含有相同數(shù)量的大腸桿菌提取物，但是沒有加入重組人類TATAbox結(jié)合蛋白。(b)幾乎沒有任何印跡出現(xiàn)。(c)克隆人類TATAbox結(jié)合蛋白的C末端180個保守的氨基酸組成的片段能夠留下與完整的TATAbox結(jié)合蛋白下同的印跡。在大致相同的濃度條件下，兩種克隆人類TATAbox結(jié)合蛋白以及TATAbox結(jié)合蛋白的C末端180個保守的氨基酸組成的片段等能保護呼吸系統(tǒng)病毒后期啟動子上TATAbox周圍相同的20bp的區(qū)域，唯獨不能結(jié)合本實驗中被突變的TATAbox(TATAAAA突變成TTATCAT)。實驗結(jié)論1.TATAbox中的某些突變將會影響其與TBP的結(jié)合，減弱它們之間的相互作用。2.TATAbox結(jié)合蛋白的C末端180個保守的氨基酸組成的片段是與TATAbox結(jié)合的結(jié)合區(qū)域。11.8描述一個能夠體現(xiàn)TFIID對轉(zhuǎn)錄因子Sp1有反應(yīng)而對TBP卻沒有反應(yīng)的實驗，并給出這個實驗的結(jié)果。答：實驗名稱TBP相關(guān)因子在TFIID對Sp1的反應(yīng)中的作用實驗步驟實驗中使用的測試啟動子是以一個復(fù)合的啟動子，含有Sp1相應(yīng)元件——來自SV40早期啟動子的6個GCbox（紅色標(biāo)識）以及TATAbox（藍色標(biāo)識）和來自呼吸系統(tǒng)病毒晚期啟動子的轉(zhuǎn)錄起始子（轉(zhuǎn)錄起始位點）。從這個復(fù)合啟動子開始的精確的起始在（b）中所述的run-offassay中將產(chǎn)生一個350nt長度的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。進行體外轉(zhuǎn)錄測試。分別將TFIID、bhTBP、vhTBP與TFIIA,TFIIB,TFIIE,TFIIF，RNA聚合酶II混合，然后進行run-offtranscriptionassay，標(biāo)記物是[α-32P]UTP。實驗結(jié)果泳道1和2說明完整的TFIID在這個啟動子上介導(dǎo)了高水平的轉(zhuǎn)錄，并且Sp1大大增強了轉(zhuǎn)錄水平。泳道3–6說明在缺少TAFIIs的條件下，僅有TBP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄對Sp1沒有響應(yīng)。實驗結(jié)論單一的TBP無法對Sp1產(chǎn)生響應(yīng),而完整的TFIID則表現(xiàn)處高水平的響應(yīng)。TBP相關(guān)因子在TFIID對Sp1的反應(yīng)中具有重要作用。11.9在TATAbox中用dC取代dT,dI取代dA（構(gòu)成一個CICIbox）對于TFIID的結(jié)合沒有影響。提出一個能說明這個事實的假說。答：假說：TFIID中的TATAbox結(jié)合蛋白與TATAbox的小環(huán)結(jié)合。已知在DNA的小環(huán)中，次黃嘌呤核苷中的次黃嘌呤堿基貌似腺嘌呤，但在DNA的大環(huán)中兩者相去甚遠；類似的情況是，在DNA的小環(huán)中，胞嘧啶貌似胸腺嘧啶，但在DNA的大環(huán)中兩者相去甚遠。所以，在TATAbox中用dC全部取代dT,dI全部取代dA（構(gòu)成一個CICIbox）相當(dāng)于DNA的小環(huán)幾乎沒有受到影響，而DNA的大環(huán)則被全部改變。這一改造過的DNA可用于定位TBP與TATAbox的作用位點。Starr和Hawley的實驗結(jié)果支持這一假說。他們構(gòu)建了CICIbox用于測試。實驗結(jié)果是CICIbox的作用與TATAbox相當(dāng)，而一個無關(guān)的DNA沒有與TFIID結(jié)合。11.10TBP具有怎樣的外形？TBP于TATAbox的相互作用中它們的空間相互關(guān)系是怎樣的？答：TBP本身看上去像是一個有兩個馬鐙的馬鞍（如上圖所示）。上圖顯示以橄欖色來標(biāo)示了TBP的骨架?！榜R鞍”長軸在平面內(nèi)。在TBP以下的DNA用了多種顏色來表示。其中和蛋白質(zhì)存在相互作用的部分用橙色標(biāo)識（堿基對用了紅色來標(biāo)識），而與蛋白質(zhì)不存在相互作用的部分用了藍色標(biāo)識（堿基對用了灰色來標(biāo)識）。蛋白質(zhì)打開了DNA的小環(huán)并幾乎拉直了雙螺旋彎曲的部分。TBP的兩個“馬鞍”均插進了DNA的小環(huán)中。圖中DNA的左末端伸出紙平面約25度，而右末端插入紙平面約25度。整個DNA在TBP的作用下彎曲了約80度。圖11.10TBP-TATA復(fù)合物結(jié)構(gòu)11.11描述實驗證明TBP對于三種啟動子的轉(zhuǎn)錄是必需的，并給出實驗結(jié)果。答：TBP不僅僅是在有TATAbox的第二類啟動子中起作用，同時，它也在沒有TATAbox的第二類啟動子中起作用。當(dāng)然，實驗證明，它也在沒有TATAbox的第三類啟動子和第一類啟動子中發(fā)揮作用。用別的話來說，就是TBP是真核生物中，操縱各種啟動子所通用的因子。不論這個啟動子是否有TATAbox，甚至沒有可識別它們的聚合酶，TBP照樣可以操縱。圖11.11中的實驗結(jié)果可以表明。在第1和第2泳道中，我們都可以看到TBP發(fā)揮了作用，使得轉(zhuǎn)錄成功。11.13描述實驗鑒定TAFs能夠結(jié)合到含有TATAbox、轉(zhuǎn)錄起始子核下游調(diào)控元件的II類啟動子上，并給出實驗結(jié)果。答：第1泳道中可以看出兩種TAFIIs(TAFII250和TAFII150)結(jié)合到了Hsp70promoter上，因此被標(biāo)簽上了。但是第2泳道中的TFIID被撤去以后，沒有蛋白質(zhì)可被標(biāo)記。再結(jié)合第3第4泳道，我們可以得出結(jié)論就是，蛋白質(zhì)的翻譯需要有TAFII250andTAFII150結(jié)合到promoter上。而且，這個promoter必須含有aTATAbox,aninitiator,andadownstreamelement。圖11.1311.14描述實驗比較TBP和TBP–TAFII250–TAFII150的DNasefootprinting結(jié)果，并給出實驗結(jié)果。答：圖11.14中說明的是仔細檢驗三重復(fù)合體TBP–TAFII250–TAFII150的DNasefootprinting實驗。圖中說明TBP在TATAbox中引起了標(biāo)記，然而此三重復(fù)合體在theinitiator和downstreamelement處又增加了一個標(biāo)記。這就說明另兩個TAFIIs是結(jié)合到了theinitiator和downstreamelement上去了。圖11.14TBP和TBP–TAFII250–TAFII150的DNasefootprinting結(jié)果11.15圖示在不含TATAbox的II類啟動子中TBP與啟動子的結(jié)合模型。答：對于沒有TATAbox的promoter來說，有兩種情況。一種是有initiator和downstream的，另一種是含有GCbox的。此時，TATAbox不再做為bindingsite，因此TBP也就不再做為結(jié)合因子。對于有initiator的來說，結(jié)合因子是TAFⅡ150，和TAFⅡ250，這兩個因子與initiator結(jié)合，從而使TBP也結(jié)合上去。同時其他的因子也結(jié)合上去形成完整的復(fù)合體。而GCbox中，結(jié)合因子是SP1。而TAFⅡ150TAFⅡ250TAFⅡ110幫助TBP結(jié)合上去。同時其他的因子也結(jié)合上去形成完整的復(fù)合體。TATAbox廣泛存在，在三種RNAPolymerase（不管有沒有TATAbox）中都有，雖然它不作為bindingsite（在TATA-lesspromoter中）但是它還是在真?zhèn)€復(fù)合體中起到很大的作用的。它們的具體結(jié)合方式如下圖：11.16描述并給出實驗結(jié)果，以說明由含有GCboxes的第二類增強子影響的轉(zhuǎn)錄激活依賴于Sp1和TAFII110。答：1）發(fā)表于Cell84：1629，1996年的由Tjian及其同事所做的實驗可以說明Sp1對轉(zhuǎn)錄活性的作用。a.測試的增強子的結(jié)構(gòu)見圖11.16A：含有6個GCboxes。b.實驗結(jié)果的示意圖如圖11.16B：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小為375nt分別將TFIID、bhTBP、vhTBP(在圖中頂端標(biāo)出)與TFIIA，TFIIB，TFIIE，TFIIF和第二類RNA聚合酶混合，+、–號表明是否含有Sp1。由此構(gòu)成的6組中明顯第2組表達了大量的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，說明Sp1的參與對轉(zhuǎn)錄激活有決定性作用，另一方面，TFIID除了含有TBP以外還含有TAFIIs，說明TAFIIs的參與也有重要作用。圖11.162）發(fā)表于Cell79p.96,f.3b-c的由Tjian及其同事所做的實驗可以說明Sp1和TAFII110共同起著重要作用。a)用于測試的序列包含一個TATAbox和3個位于上游的GCboxesb）實驗結(jié)果示意圖如圖11.16C：該實驗將果蠅細胞中的TFIID去除，分別用（TAFII250、TAFII150、TBP），（TAFII250、TAFII150、TAFII110、TBP）的混合物代替（在圖中下部標(biāo)出）圖中頂部-、+、++分別表示Sp1含量：無、少量、大量；由實驗結(jié)果可以看出：無Sp1則轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基本檢測不到；無TAFII110則轉(zhuǎn)錄表達量較低；當(dāng)Sp1和TAFII110同時存在時檢測到大量轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，說明轉(zhuǎn)錄被激活；綜上，說明Sp1和TAFII110在轉(zhuǎn)錄激活中共同起著決定性作用。11.17全基因組表達分析指出，酵母的TAFII145只在16%的基因的轉(zhuǎn)錄中起作用，而TAFII17在67%的基因轉(zhuǎn)錄中起作用。試分析一下其中的原因。答：隨著研究的逐漸深入，會發(fā)現(xiàn)越來越多的例外，例如在本例中，首先并不是所有的基因的轉(zhuǎn)錄都需要轉(zhuǎn)錄因子的作用；其次作為轉(zhuǎn)錄因子的一種，雖然TFIID的作用是處于核心的地位，但可能并不是所有的POLII型基因的轉(zhuǎn)錄所必需的，其功能只是在POLII的本底轉(zhuǎn)錄得基礎(chǔ)上繼續(xù)予以加強；其次TAFII145可能雖然是TAFII的重要成份，但是否重要到必需的程度也未可知，而且是否會被其他機制所代替也不一定，綜合以上各種不確定因素來看，一個轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白的某一個成分相對于全基因組的基因的必須度16%左右是可以理解的；關(guān)于TAFII1767%的必須度則只是這一因子在轉(zhuǎn)錄中的重要性的一種體現(xiàn)。舉例描述下列情況下的II類轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合體。11.18舉例描述下列情況下的II類轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合體：a.AnalternativeTBP；b.AmissingTAFII；c.NoTBPorTBP-likeprotein。答：1）AnalternativeTBP上圖11.11展示的是TBP發(fā)生突變后，對三種RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄作用的影響。研究者準(zhǔn)備了野生型和兩種不同的溫度敏感性（在TBP有損傷）細胞提取物，在24℃下生長，然后在37℃生長1小時，然后保持在一個較低的溫度下。接著，加入含有可以被三種RNA聚合酶識別的啟動子的DNA，并用S1法進行轉(zhuǎn)錄分析。上圖就是所得結(jié)果。熱沖擊對于野生型沒有影響（lanes1和2）。但是無論是否進行熱沖擊，I143→N的突變體幾乎都不能支持任何一種RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄（lanes3和4）。顯然，TBP的突變影響了三種RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄。另一種突變體P65→S，雖然無論熱沖擊與否，都幾乎不能支持聚合酶II和III的轉(zhuǎn)錄，但是如果沒有熱沖擊，它可以允許聚合酶I在野生型水平的轉(zhuǎn)錄，而熱沖擊減小了聚合酶I的轉(zhuǎn)錄水平大約一半。最后，野生型的TBP可以修復(fù)三種聚合酶在突變體中的轉(zhuǎn)錄。2）AmissingTAFII上圖11.18展示的是在只有TBP，沒有TAFII時對于Sp1的應(yīng)答。TAFII有許多功能，其中兩個主要的功能是與核心啟動子元件的相互作用，以及與特異基因轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。不同的轉(zhuǎn)錄激活子（transcriptionactivators）需要不同的TAFII組合來提高轉(zhuǎn)錄水平。TFIID可以參與被Sp1因子激活的反應(yīng)，但是TBP不行。上圖11.18說明了Sp1可以在TFIID存在時刺激轉(zhuǎn)錄，但是在只有TBP存在時不能刺激轉(zhuǎn)錄。Lanes1和2說明自然的TFIID可以支持高水平的轉(zhuǎn)錄，而這種轉(zhuǎn)錄又可以被Sp1轉(zhuǎn)錄因子顯著提高。Lanes3到6證明了在缺乏TAFIIs時，任何重組的人類TBP的轉(zhuǎn)錄都不能被Sp1因子刺激。3）NoTBPorTBP-likeproteinTBP并不是完全普遍的被需要的。高等真核生物中的一些啟動子可以對另一種蛋白質(zhì)TRF1發(fā)生應(yīng)答。一些啟動子可以被TFTC刺激，而不是被TFIID。上圖11.21是Drosophilatudor控制區(qū)。這個基因有2個啟動子，兩個啟動子間距大約77bp。下游啟動子有一個TATA框，可以與含TBP的前起始復(fù)合體結(jié)合。而上游的啟動子有一個TC框，可以與含TRF1的前起始復(fù)合體結(jié)合。在上游啟動子激活的情況下，下游啟動子則處于抑制狀態(tài)，此時TBP不參與上游啟動子的調(diào)控作用。11.19在轉(zhuǎn)錄過程中，TFⅡA和TFⅡB因子扮演什么樣的角色？答：TFⅡA：TFⅡA含有二個亞基（酵母中），或三個亞基（果蠅和人）。TFⅡA與TFⅡD結(jié)合，并增強TFⅡD與TATA框的結(jié)合，穩(wěn)定TFⅡD-DNA復(fù)合體。在體外轉(zhuǎn)錄研究中，在TFⅡD得到純化后，就不再需求TFⅡA了。在完整的細胞中，TFⅡA似乎能抵消抑制因子諸如與TFⅡD相關(guān)的DR1和DR2的作用，很可能是TFⅡA與TFⅡD結(jié)合結(jié)果阻礙了這些抑制因子的結(jié)合，讓組裝過程得以繼續(xù)。TFⅡB：TFⅡB是作為連接TFⅡD和TFⅡF/聚合酶Ⅱ的橋梁。它含有二個作用域，一個與TFⅡD結(jié)合，另一個與TFⅡD和TFⅡF/聚合酶Ⅱ結(jié)合，來繼續(xù)完成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的組裝。下圖是一個TFⅡA-TFⅡB-TBP-TATA框復(fù)合體的假想結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)顯示TFⅡA和TFⅡB分別與TBP上游的下游馬鐙結(jié)構(gòu)相結(jié)合。這就將這兩個因子放在有利的位置上來執(zhí)行它們的功能。HEHE圖11.19TFⅡA-TFⅡB-TBP-TATA框復(fù)合體結(jié)構(gòu)示意圖。11.20圖示TBP-TFIIA-TFIIB三聚體與DNA結(jié)合后的大概結(jié)構(gòu)輪廓，并指出這些蛋白的相對位置，這一結(jié)構(gòu)與三者的作用有什么聯(lián)系。答：圖11.20TBP-TFIIA-TFIIB三聚體結(jié)構(gòu)示意圖。如圖11.20為TBP-TFIIA-TFIIB三聚體的草圖。圖中，灰色的為DNA；深藍和淺藍區(qū)域分別為TBP的下游部分和上游部分；粉色和紅色區(qū)域分別為TFIIB的羧基末端域和氨基末端域；綠色和黃色區(qū)域分別為TFIIA的核心大亞基和小亞基（此處的TFIIA是酵母中的，含有兩個亞基）。TFIIB與TBP的下游部分（羧基馬鐙型末端）結(jié)合，TFIIA與TBP的上游部分（氨基馬鐙型末端）結(jié)合TFIIA的主要功能可能是穩(wěn)定TFIID與啟動子的結(jié)合，而圖中TFIIA在上游的定位恰好使它可以穩(wěn)定TBP與TATAbox的結(jié)合，同時，也可能跟與上游元素結(jié)合的轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)生作用。TFIIB的功能是連接TFIID與TFIIF/RNA聚合酶II。而TFIIB在下游的定位使它可以與TFIIF/RNA聚合酶II發(fā)生作用，把聚合酶定位在轉(zhuǎn)錄起始位點（圖11.20中的+1位置）。11.21描述實驗證明TFIIH，而不是其它的通用轉(zhuǎn)錄因子，使RNA聚合酶II由IIA形式轉(zhuǎn)變?yōu)镮IO形式，并說明在這一過程中其它轉(zhuǎn)錄因子是如何幫助進行的。答：如下圖所示：(a)在RNA聚合酶PolII中加入各種不同轉(zhuǎn)錄因子的混合物(如圖頂部所示)。然后在所有反應(yīng)中加入[γ-P32]標(biāo)記的ATP對聚合酶進行磷酸化。再對蛋白進行電泳與放射自顯影，觀察結(jié)果：lane4說明TFIID,B,F和E并不能使聚合酶磷酸化。Lane5-10則說明了僅僅是TFIIH便能使部分聚合酶磷酸化，而其它轉(zhuǎn)錄因子更促使了這一反應(yīng)。尤其是TFIIE，對聚合酶的磷酸化有很強的促進作用，從(b)可見。(b)在TFIID,B,和H存在的情況下，加入或不加E，進行同(a)一樣的磷酸化處理過程，在不同的時間段對產(chǎn)物進行分析?？梢娫贓存在的情況下，RNA聚合酶磷酸化的速度比起無E時要快得多。11.22描述實驗說明TFIIH使聚合酶II的CTD去磷酸化，并給出實驗結(jié)果。答：Figure10.17中，IIa,IIb和IIo是RNA聚合酶II最大亞基的三種不同形式（表現(xiàn)在CTD一端的不同），分別對應(yīng)于三種RNA聚合酶IIA,IIB和IIO.如圖11.30所示：(a)在TFIID,B,F，E和H存在時，分別加入聚合酶IIA,IIB和IIO，用[γ-P32]標(biāo)記的ATP對其進行磷酸化。電泳，放射自顯影后，得到以上結(jié)果。IIB缺少CTD一段，沒有被磷酸化。IIA和IIO相比，IIA更好地被磷酸化，這正如從Figure10.17中預(yù)料的一樣。(b)用蛋白酶chymotrypsin將CTD從已磷酸化的聚合酶亞基IIa上分解出來，進行電泳，通過放射自顯影觀察結(jié)果。Lane1是酶解前的反應(yīng)產(chǎn)物，lane2，3是酶解后的產(chǎn)物，帶在CTD的位置上，表明CTD確實被磷酸化了。11.23描述DNA解旋酶活性檢測實驗，并說明如何用于描述TFIIH的解旋酶活性。答：如Figure11.31所示：(a)底物是由一段已標(biāo)記的41個核苷酸組成的DNA片斷，和與之有一段互補序列的一條長得多且無標(biāo)記的DNA片斷。加入或不加DNA解旋酶，將產(chǎn)物進行電泳?？芍咏庑傅膸?1nt處，而不加酶的帶在>7000nt處。(b)用同樣的底物，加入RAD25處理。lane1是熱變性的底物；lane2是未加蛋白的對照；lane3是20ngRAD25，無ATP；lane4是10ngRAD25，加ATP；lane5是20ngRAD25，加ATP（RAD25是TFIIH的一部分）。從電泳結(jié)果可看出，RAD25可將DNA雙鏈解開，則證明了TFIIH具有解旋酶的作用。11.24描述G-lesscassette轉(zhuǎn)錄實驗，并證明TFIIH的DNA解旋酶活性在體外轉(zhuǎn)錄過程中是必需的。答：用野生型（RAD25）和溫敏突變型（rad25-ts24）細胞的提取物，在突變型rad25-ts24能和不能保持活性的溫度下，分別對一段G-lesscassette模板進行轉(zhuǎn)錄（只有ATP、CTP和UTP，無GTP，且有一個32P標(biāo)記的核苷酸存在的情況下）。對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行電泳和放射自顯影，得到的結(jié)果如下：(a)為rad25-ts24有活性的溫度，(b)為rad25-ts24無活性的溫度。可見，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的有無與rad25-ts24活性的有無有關(guān)。說明了RAD25的DNA解旋酶性質(zhì)對轉(zhuǎn)錄是必須的。11.25描述實驗證明IIS可以引起RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄延伸功能，并給出實驗結(jié)果。答：如圖11.34所示：根據(jù)時間軸，在特定的時刻加入相對應(yīng)的物質(zhì)：-3min加入DNA和RNA聚合酶；0min時加入4種NTP（其中GTP用P32標(biāo)記），開始反應(yīng)；+1min時加入肝素去結(jié)合游離的RNA聚合酶，這樣所有的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體都是處于延伸階段。最后，在+2.5min時加入IIS(紅色)或緩沖液(藍色)作為對照。在不同的時間里抽出樣本，對其放射性進行檢測。比較兩直線，可看出IIS對RNA鏈的延伸有促進作用。11.26描述一個能夠說明ⅡS引起RNA聚合酶Ⅱ校正的實驗，并給出實驗結(jié)果。答：如右圖11.26A所示：首先，分離未被標(biāo)記的延長染色體組，這些染色體組被停滯在了啟動子附近的多種位點上；然后，在放射性UTP存在的條件下標(biāo)記染色體組中的RNA；接著，加入ATP或者GTP使RNA延長一個堿基至+43處。此處要求的堿基為A，但若只可提供G，即使低效，聚合酶也會錯誤的與G結(jié)合。事實上，超純的GTP含有少量的ATP，因此，盡管只加入了GTP，AMP和GMP也被等量的結(jié)合在了+43處。下一步，可用RNaseT1在G后面截斷產(chǎn)物，或者繼續(xù)連接四種核苷酸，以使標(biāo)記的RNA延至全長，再用RNaseT1剪切；最后，將所有RNaseT1產(chǎn)物進行電泳處理，用放射自顯影法呈現(xiàn)出標(biāo)記的產(chǎn)物。簡單的用RNaseT1截斷轉(zhuǎn)錄，就可以測量AMP和GMP在+43處的相對結(jié)合量，因為電泳明顯的分離了7聚體末端的A和G。右側(cè)圖11.26B的第一道顯示了一組沒有核苷酸后綴的實驗結(jié)果。末端為G的7聚體，錯誤結(jié)合G的結(jié)果，和末端為A的7聚體、以及末端為AC的8聚體幾乎相當(dāng)。第二道和第三道，分別顯示了在ⅡS缺失或存在的情況下，核苷酸后綴的影響。有核苷酸后綴的、全長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被RNaseT1截斷，產(chǎn)生了一個以Gp結(jié)尾仍含有錯誤結(jié)合的G的7聚體，或者一個以Gp結(jié)尾的10聚體，并且在10聚體中，錯誤結(jié)合的G已經(jīng)被校正為A。如果在ⅡS缺失的情況下后綴核苷酸，大量的錯誤結(jié)合的G會留在RNA中（見第二道中7聚體UCCUUCGp箭頭指向的帶）。但是，大多數(shù)產(chǎn)物出現(xiàn)在10聚體處（箭頭標(biāo)記UVVUUVAVAGp），暗示了多聚體可以在沒有ⅡS的情況下作一部分校正。另一方面，在ⅡS存在的條件下后綴核苷酸，7聚體就會消失，所有的標(biāo)記產(chǎn)物都會形成10聚體。因此說，ⅡS可以刺激轉(zhuǎn)錄的校正。圖11.26ⅡS可以引起RNA聚合酶Ⅱ的校正功能11.27RNA聚合酶全酶有什么作用？全酶與核心酶之間有什么不同？答：RNA聚合酶=2\*ROMANII全酶包含有RNA聚合酶=2\*ROMANII和一個由轉(zhuǎn)錄因子及其他蛋白質(zhì)構(gòu)成的亞基。RNA聚合酶=2\*ROMANII全酶比核心聚合酶=2\*ROMANII多了轉(zhuǎn)錄因子及一些蛋白質(zhì)或多肽。11.28描述一個通過印跡法實驗證明SL1是一個種特異性的轉(zhuǎn)錄因子,并給出實驗結(jié)果.答:如果我們提供小鼠的無細胞抽提物和兩端模板DNA鏈，其中一條帶有人類的rRNA啟動子，另外一條帶有小鼠的rRNA啟動子。在正常轉(zhuǎn)錄的情況下，小鼠和人類的模板鏈可以分別轉(zhuǎn)錄出2400、1500核苷酸長度，如圖11.28所示。圖中第一道沒有加人類的SL1轉(zhuǎn)錄因子，因此基本上只有小鼠的模板鏈進行了轉(zhuǎn)錄，隨著人類SL1因子的加入（圖中2~5道），人類的模板鏈轉(zhuǎn)錄的越來越多，而小鼠的模板鏈轉(zhuǎn)錄就相對的越來越少。（第5道可能由于加入量過多，導(dǎo)致兩種DNA鏈的轉(zhuǎn)錄都被抑制）由此即可得，人類的SL1對人類的模板鏈可以進行特異性的轉(zhuǎn)錄，對小鼠的模板鏈的轉(zhuǎn)錄則影響不是很大，所以可以知道，SL1轉(zhuǎn)錄因子是一個種特異性的轉(zhuǎn)錄因子。圖11.28SL1特異性實驗11.31描述并給出用以說明“SL1中包含TBP”的共純化及免疫沉淀反應(yīng)實驗的結(jié)果。答：1)共純化實驗Tjian和他的同事們以海拉細胞為材料做了人類SL1蛋白質(zhì)分離純化實驗（部分如下圖）：=1\*GB3①通過一系列步驟，逐步對海拉細胞內(nèi)人類SL1蛋白質(zhì)進行提純；=2\*GB3②每一步提純后，對所得的提取物進行SL1蛋白質(zhì)的活度檢測，即測定SL1蛋白質(zhì)的含量；=3\*GB3③并且相應(yīng)地對各個提取物做TBP的活度檢測，即測定TBP的含量；=4\*GB3④最后分別比較每個階段的提取物的SL1蛋白質(zhì)和TBP蛋白的活度，結(jié)果顯示，對于實驗過程中先后得到的一系列提取物，SL1蛋白質(zhì)和TBP蛋白的活度基本都在同一個提取階段達到最大，即SL1蛋白質(zhì)和TBP蛋白可以共純化。并且蛋白凝膠電泳可以發(fā)現(xiàn)SL1蛋白質(zhì)的分子量較TBP蛋白的大。這樣的實驗結(jié)果，讓我們得出這樣的推斷：TBP蛋白是SL1蛋白質(zhì)的一部分。2)免疫沉淀反應(yīng)實驗Tjian和他的同事們還以細胞核提取物(NXT)作為材料進行了免疫沉淀反應(yīng)實驗：=1\*GB3①對未經(jīng)處理的細胞核提取物(NXT)進行S1分析，以測定其對人類rRNA基因的轉(zhuǎn)錄促進能力大?。↙ane1andLane2）；=2\*GB3②往細胞核提取物中加入抗TBP蛋白的抗體(aTBP)，然后離心沉淀后取其上層清液，再對所得上層清液進行S1分析，以測定其對人類rRNA基因的轉(zhuǎn)錄促進能力大?。↙ane3andLane4），發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄能力基本沒有了，說明TBP是rRNA基因轉(zhuǎn)錄所不可缺少的成分；=3\*GB3③往=2\*GB3②中所得的上層清液中加入4ng和12ng的SL1蛋白后，再次進行上述的S1分析（Lane5andLane6），發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平恢復(fù)，并且轉(zhuǎn)錄能力隨所加入的SL1蛋白增多而提高，說明SL1蛋白中是包含有TBP成分的。11.32描述用以鑒定SL1中的TAFs的實驗，并給出實驗的結(jié)果。答：操作如31題中免疫沉淀反應(yīng)，在第二步中我們加入抗TBP蛋白的抗體(aTBP)，分別得到上層清液和沉淀?？梢园l(fā)現(xiàn)所得到的上層清液將失去原細胞核提取物所具有的rRNA基因轉(zhuǎn)錄能力，但是僅僅加入純的TBP蛋白，并不能使其恢復(fù)轉(zhuǎn)錄能力。說明加入抗TBP蛋白的抗體(aTBP)后，還有其他一些與TBP蛋白的成分也一起沉淀掉了。即SL1蛋白中除了TBP，還是有其他成分的。圖11.32沉淀的SDS結(jié)果圖對沉淀進行SDS（如上圖），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了TBP蛋白和抗TBP蛋白的抗體，還有其他三種肽鏈，分子量分別是110，63，48KD。由于這幾條肽鏈都與TBP蛋白緊密結(jié)合在一起，所以稱其為TBPassociatedfactors（TAFs）。再根據(jù)其相對分子量的大小，分別命名為TAFI110,TAFI63,和TAFI48。進一步的實驗表明，當(dāng)我們在合適條件下，重新將TBP蛋白與三種肽鏈TAFI110,TAFI63,和TAFI48混合在一起后，發(fā)現(xiàn)確實可以得到具有所有SL1蛋白功能的產(chǎn)物。這更進一步地表明SL1蛋白確實由TBP蛋白以及TAFI110,TAFI63,和TAFI48組成。11.33我們?nèi)绾沃繲F=3\*ROMANIIIA對于5SrRNA基因的轉(zhuǎn)錄是必要的，但對于tRNA基因的轉(zhuǎn)錄卻沒有必要？答：Brown和他的同事們準(zhǔn)備了三份卵母細胞的提取物和三份體細胞的提取物，兩種提取物的第一份中不加其他蛋白，第二份中均加入一種不相關(guān)的抗體，一、二均作為對照，而在第三份中加入抗TFIIIA的抗體。然后在每一份提取物（共6份）中均加入克隆得到的5SrRNA基因和tRNA基因，并且都提供給帶有標(biāo)記的四種核糖核苷酸作為轉(zhuǎn)錄的原料。當(dāng)轉(zhuǎn)錄已充分進行后，提取出6份產(chǎn)物中的RNA，并對其進行電泳，結(jié)果如右圖所示：結(jié)果表明：當(dāng)TFIIIA被抗體結(jié)合沉淀掉后（lane3a和lane3b），5S