DB4415-T 24-2023 甘薯病毒分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

65.020.20CCS

B

054415 DB4415/T

24—2023甘薯病毒分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程Technical

for

detection

of

potato

2023-09-14

發(fā)布 2023-10-08

實(shí)施汕尾市市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)布DB4415/T

－2023 本文件按照

GB/T

—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第

1

部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定編寫。本文件由汕尾市市場(chǎng)監(jiān)督管理局提出并歸口。本文件起草單位:

汕尾市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本文件主要起草人:

林少欽。DB4415/T

－2023甘薯病毒分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程1 范圍及記錄和歸檔。本文件適用于汕尾市區(qū)域內(nèi)甘薯脫毒組培苗、原原種、原種以及生產(chǎn)用種的病毒分子檢測(cè)。2 規(guī)范性引用文件文件。GB/T

6682

分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T

脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程SN/T

2122

進(jìn)出境植物及植物產(chǎn)品檢疫抽樣方法SN/T

2964

植物病毒檢測(cè)規(guī)范3 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1分子檢測(cè)

molecular

detection以功能基因、核糖體、等區(qū)域?yàn)闃?biāo)靶，采用分子生物學(xué)的方法在基因水平上對(duì)物種進(jìn)行鑒定。3.2引物

板DNA互補(bǔ)的序列。3.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

chain

reaction在DNA體外復(fù)制出與母鏈互補(bǔ)的子鏈DNA的過程，是一項(xiàng)能快速特異性的在體外擴(kuò)增目的DNA片段的技術(shù)。3.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

reverse

transcription

chain

reaction以RNADNADNA為模板進(jìn)行PCR性的檢測(cè)目的的技術(shù)。DB4415/T

－20234檢測(cè)對(duì)象4.1

a）甘薯類花椰菜花葉病毒（SPCV）b)

甘薯曲葉病（SPLCV）4.2

a)

甘薯褪綠矮化病毒（）b)

甘薯羽狀斑駁病毒（）c)

G

病毒（SPVG）d)

甘薯潛隱病毒（SPLV）e)

甘薯褪綠斑病毒（）f)

甘薯脈花葉病毒（）g)

黃瓜花葉病毒（）5 抽樣方法抽樣方法應(yīng)符合

SN/T

2122

和

SN/T

2964

中的規(guī)定，遵循隨機(jī)的原則，根據(jù)樣品的特性和樣品中可能存在的病毒表現(xiàn)出的癥狀特點(diǎn)，確定取樣方法、取樣數(shù)量、取樣工具、保存方法等。合適的取樣計(jì)劃，進(jìn)行再次取樣。6

6.1

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（）檢測(cè)用于檢測(cè)甘薯

病毒。6.1.1

試劑及緩沖液的配置試劑及緩沖液用水應(yīng)符合

GB/T

6682

的規(guī)定，配置按

NY/T

執(zhí)行。6.1.2

DNA

的提取樣品

的提取按

NY/T

執(zhí)行。6.1.3

對(duì)照組以

ddH2O

作為檢測(cè)的陰性對(duì)照。6.1.4

引物a）甘薯類花椰菜花葉病毒（SPCV）:F-AGGAAATCCCAGTATTATTCAAC，，擴(kuò)增產(chǎn)物

922

；b）甘薯曲葉?。⊿PLCVF-CCYTAGGGTTCGAGCTVTGTTCGG，R-TTTATTAATTDTTRTGCGAATC，擴(kuò)增產(chǎn)物

。6.1.5

PCR

擴(kuò)增采用

病毒特異引物進(jìn)行

PCR

擴(kuò)增；反應(yīng)體系（

μL）：樣品總

DNA（約

ng/

μL）2

μL，2×Taq

Master

Mix

12.5

μL，上、下游引物（10

μmol/L

1

μL，ddH2O

補(bǔ)齊至

μL；擴(kuò)增條件：DB4415/T

－202394℃

2

min；94℃

s，退火

s，68℃

1

，30

次循環(huán)；68℃

10

min；4℃

保存；擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)凝膠電泳檢測(cè)。6.1.6

PCR

產(chǎn)物的電泳檢測(cè)取

10

μL

PCR

擴(kuò)增產(chǎn)物與

1

μL

10×loading

混合后，1%瓊脂糖凝膠恒壓（120

V～150

V）下電泳

20

min～30

min，EB

染色后，凝膠成像儀拍照觀察。6.2

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)用于檢測(cè)甘薯

病毒。6.2.1

試劑及緩沖液的配置試劑及緩沖液用水應(yīng)符合

GB/T

6682

的規(guī)定，配置按

NY/T

執(zhí)行。6.2.2

RNA

的提取樣品

的提取按

NY/T

執(zhí)行。6.2.3

對(duì)照組以

ddH2O

作為檢測(cè)的陰性對(duì)照。6.2.4

引物a）甘薯褪綠矮化病毒（F-CGGTCARATTGGAAGGT，，擴(kuò)增產(chǎn)物

；b）甘薯羽狀斑駁病毒（F-GCATGGTATGARGGAGTYAA，R-TCTTCTTCTTGCGTGGAG，擴(kuò)增產(chǎn)物

589

bp；c）甘薯

G

病毒（SPVGF-GTATGAAGACTCTCTGACAAATTTTG，，擴(kuò)增產(chǎn)物

1191

bp；d）甘薯潛隱病毒（SPLVF-GCCGAYGAAACCATCMTCGAT，R-GTCTCYGGTATAAGACAAAAAG，擴(kuò)增產(chǎn)物

1076

bp；e）甘薯褪綠斑病毒（）：F-CTATGCTGCTCACTCAAGC，R-TTGATTGGCCACAAGCGAAG，擴(kuò)增產(chǎn)物

600

bp；f）甘薯脈花葉病毒（）：F-GCGAATTCTCAAGCACTGAAGAAAC，R-CTCTCGAGTTACTGCACACCTCTCATT

1015

；g）黃瓜花葉病毒（）:F-ATGGACAAATCTRAATCAACCAG，，擴(kuò)增產(chǎn)物

657

；6.2.5

反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄過程按

NY/T

D.3.2

執(zhí)行。6.2.6

PCR

擴(kuò)增采用

病毒特異引物進(jìn)行

PCR

擴(kuò)增；反應(yīng)體系（

μL）：合成的

cDNA

2

μL，2×Taq

Master

12.5

μL，上、下游引物（10

μmol/L）各

1

μL，2O

補(bǔ)齊至

25

μL；擴(kuò)增條件：94℃

2

min；94℃

s，退火

45

s，68℃

1

，30

次循環(huán)；68℃

10

；4℃

保存；擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)凝膠電泳檢測(cè)。6.2.7

PCR

產(chǎn)物的電泳檢測(cè)取

10

μL

PCR

擴(kuò)增產(chǎn)物與

1

μL

10×loading

混合后，1%瓊脂糖凝膠恒壓（120

V～150

V）下電泳

20