備課素材：反向PCR技術(shù) 第二學(xué)期高中生物學(xué)選擇性必修三

反向PCR技術(shù)反向PCR是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間DNA片段。實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序列內(nèi)部沒(méi)有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)該段DNA進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有黏性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對(duì)反向的引物進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對(duì)未知序進(jìn)行分析研究。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR技術(shù)由變性－退火－延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性－退火－延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，科研人員在基本PCR的基礎(chǔ)上進(jìn)行了大量改進(jìn)，開(kāi)發(fā)了許多適用于不同研究目的的PCR，如兼并引物PCR、套式引物PCR、反向PCR、不對(duì)稱PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、實(shí)時(shí)PCR等。什么是反向PCR呢？和常規(guī)PCR有什么區(qū)別？反向PCR（IPCR）技術(shù)是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的末知序列進(jìn)行擴(kuò)增。如圖所示：基本PCR與反向PCR技術(shù)的區(qū)別：反向PCR(reversePCR)是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間DNA片段。反向PCR是常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的修改和發(fā)展。反向PCR技術(shù)的原理、方法和意義：實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序列內(nèi)部沒(méi)有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)該段DNA進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有黏性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對(duì)反向的引物進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對(duì)未知序進(jìn)行分析研究。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。反向PCR是克隆T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼DNA序列非常有效的方法。如圖所示：現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對(duì)于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫(kù)染色體上DNA片段序列的識(shí)別十分重要。反向PCR技術(shù)的應(yīng)用：反向PCR設(shè)計(jì)之初是為了用于確定鄰近未知區(qū)域的序列，多用于研究基因的啟動(dòng)子序列；致癌性染色體重排，如基因融合、易位和轉(zhuǎn)座；以及病毒基因整合，現(xiàn)在也常用于定點(diǎn)突變，復(fù)制一個(gè)具有預(yù)期突變的質(zhì)粒。反向PCR技術(shù)的不足：需要從許多酶中選擇限制酶，或者說(shuō)必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過(guò)反向PCR得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。反向PCR技術(shù)有著自己獨(dú)特的特點(diǎn)，雖然有不足之處，但它在各學(xué)科和各領(lǐng)域都有著重要的作用。隨著PCR技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，它在各學(xué)科和各領(lǐng)域的作用將會(huì)越來(lái)越重要，應(yīng)用也將會(huì)更加普遍。例、反向PCR是一種通過(guò)已知序列設(shè)計(jì)引物對(duì)未知序列進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，其過(guò)程如下圖所示。下列敘述正確的是（

）A．應(yīng)選擇引物1和引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增B．設(shè)計(jì)的引物中GC堿基含量越高，退火的溫度越低C．PCR產(chǎn)物是包含所有已知序列和未知序列的環(huán)狀DNA分子D．整個(gè)過(guò)程需用到限制酶、DNA連接酶、耐高溫DNA聚合酶及逆轉(zhuǎn)錄酶解析：由題目中的反向PCR技術(shù)可知，通過(guò)已知序列設(shè)計(jì)引物，來(lái)擴(kuò)增未知序列，因此，引物延伸的方向應(yīng)該是向未知序列，由左圖