HPLC-ICP-MS分離硒代半胱氨酸

劉?。篐PLC-ICP-MS分離硒代半胱氨酸HPLC-ICP-MS分離硒代半胱氨酸摘要作為人體必需的微量元素，硒有至關(guān)重要的生理作用，包括抗氧化、抗癌等，硒也參與動(dòng)物和植物的生命活動(dòng)。其中，在人體和動(dòng)物體內(nèi)利用率最高的硒化合物是硒代半胱氨酸，然而由于不穩(wěn)定、缺乏標(biāo)準(zhǔn)品，而難于進(jìn)行研究和生產(chǎn)利用，無(wú)機(jī)硒相對(duì)有機(jī)硒生物利用率低，卻是富硒產(chǎn)品中常見(jiàn)的添加劑。若能準(zhǔn)確分離和定量分析硒代半胱氨酸，將有益于對(duì)其在生命活動(dòng)中的角色深入探討，為高效補(bǔ)硒提供依據(jù)。關(guān)于硒的形態(tài)分析，在無(wú)機(jī)硒方面已趨于成熟，AAS、AFS、MS均有利用，在有機(jī)硒方面則遇到困難，主要在于有機(jī)硒種類多、某些形態(tài)缺乏標(biāo)準(zhǔn)品，且常處于超痕量級(jí)。硒代半胱氨酸是硒代胱氨酸在生物體內(nèi)參與反應(yīng)后轉(zhuǎn)化的一種形態(tài)，只存在于生物體內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)采用硒代胱氨酸還原法制備硒代半胱氨酸，選用二硫蘇糖醇為還原劑，并優(yōu)化了硒代胱氨酸溶液中甲醇含量，加入過(guò)量二硫蘇糖醇以增大轉(zhuǎn)化率。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)，其分離效能高，檢出限低，滿足硒代半胱氨酸的測(cè)定要求。選用78Se進(jìn)行檢測(cè)，陰離子色譜柱，優(yōu)化了流動(dòng)相pH及濃度的影響，最終實(shí)現(xiàn)將硒代半胱氨酸與SeMet、L-SeMC、Se[IV]、Se[VI]分離并定量分析。本實(shí)驗(yàn)建立的方法有利于對(duì)硒代半胱氨酸的功能進(jìn)行深入探討，探究及優(yōu)化的過(guò)程為分析缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的有機(jī)活性物質(zhì)提供了啟發(fā)。關(guān)鍵詞：硒形態(tài)分析；硒代半胱氨酸；HPLC-ICP-MS；定量分析AbstractAsanessentialmicronutrient,seleniumhasvitalbiologicalfunctions,includingfightingagainstoxidationsandcancers,andisalsoinvolvedinanimalandplantlife.Amongthem,theSeleniumcompoundwiththehighestutilizationrateinhumanandanimalbodyisselenocysteine.However,duetoinstabilityandlackofstandardsamples,itisdifficulttostudyandproduce.Inorganicseleniumislowerthanorganicbioavailabilitybutit'sacommonadditiveinselenium-richproducts.Ifwecanaccuratelyseparateandquantitativelyanalysisselenocysteine,itwillbebeneficialtofurtherexploreitsroleinlifeactivities,andprovideabasisforeffectiveseleniumsupplementation.Thespeciationanalysisofseleniumismatureininorganicselenium,AtomicAbsorptionSpectroscopy,AtomicfluorescenceSpectroscopyandMassSpectrumhaveallbeenused.Butit'sdifficulttoanalyseorganicselenium,mainlybecausethattherearemanykindsoforganicselenium,somespeciationofwhicharelackofstandardsamples,andorganicseleniumareofteninsuper-tracelevel.Selenocysteineisaformthatparticipatesintheconversionofselenocysteineinlivingorganismsandisfoundonlyinlivingorganisms.Inthisstudy,selenium-containingcystinewasusedtoproduceselenocysteine,Dithiothreitolwasusedasreductant.Themethanolcontentinselenocystinesolutionwasoptimized,andtoincreasetheconversionratefurther,excessivedithiothreitolwasadded.Inthisexperiment,MassSpectrumwithInductivelycoupledplasmaandHigh-performanceLiquidChromatographywasused.Becausetheseparationefficiencywashigh,thedetectionlimitwaslow,anditcouldmeettherequirementsofselenocysteinedetermination.78Sewasusedfordetection,andanionchromatographiccolumnwasusedtooptimizetheeffectofpHandconcentrationofmobilephase.Finally,theselenocysteinewasseparatedfromSeMet,L-SeMC,Se[IV],Se[VI]anditsquantitativeanalysissucceeded.ThemethodestablishedinthisstudyisbeneficialtothefurtherstudyofthefunctionofSelenocysteine,andtheprocessofexplorationandoptimizationprovidesinspirationfortheanalysisoforganicactivesubstanceslackingofstandardproducts.Keywords:speciationanalysisofselenium;selenocysteine;HPLC-ICP-MS;quantitativeanalysis目錄第一章緒論 11.1硒的研究背景 11.1.1硒的存在形式 11.1.2硒的生理功能 11.1.3硒在人體的需要量 21.2硒的形態(tài)分析方法 31.2.1硒的形態(tài)分析方法 31.2.2HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù) 51.3研究?jī)?nèi)容及意義 61.3.1研究?jī)?nèi)容 61.3.2研究意義 6第二章HPLC-ICP-MS分離硒代半胱氨酸 72.1試劑及儀器 72.1.1試劑 72.1.2儀器 72.2實(shí)驗(yàn)步驟 82.2.1儀器條件 82.2.2試樣配制 9第三章結(jié)果與分析 113.1不同形態(tài)硒保留時(shí)間的確定 113.2實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 133.2.1SeCys制備過(guò)程的優(yōu)化 133.2.2色譜分離過(guò)程的優(yōu)化 153.3分離硒代半胱氨酸 193.3.1分離度 203.3.2SeCys定量 203.3.3L-SeMC、SeMet、Se[IV]和Se[VI]定量 213.4實(shí)驗(yàn)過(guò)程的不足與改進(jìn) 23第四章結(jié)論與展望 24致謝 24參考文獻(xiàn) 25第二章HPLC-ICP-MS分離硒代半胱氨酸2.1試劑及儀器2.1.1試劑表1試劑試劑名稱摩爾質(zhì)量(g/mol)規(guī)格生產(chǎn)廠家L-硒代胱氨酸(SeCys)2334.0998%中國(guó)河北百靈威超精細(xì)材料硒代蛋氨酸SeMet196.11-加拿大TorontoResearchChemicalsL-硒-甲基硒代半胱氨酸L-SeMC182.08≥98.0%日本東京化成工業(yè)四價(jià)硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1000μg/mL)--美國(guó)InorganicVentures六價(jià)硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(878μg/mL)--美國(guó)InorganicVentures二硫蘇糖醇DTT154.2599%中國(guó)河北百靈威超精細(xì)材料甲醇32.04優(yōu)級(jí)純德國(guó)默克檸檬酸銨243.22分析純中國(guó)上海滬試一水合檸檬酸210.44分析純中國(guó)上海滬試2.1.2儀器表2儀器儀器名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家電感耦合等離子體質(zhì)譜儀7900美國(guó)Agilent高效液相色譜儀1260InfinityⅡ美國(guó)Agilent色譜柱HamiltonPRP-X100美國(guó)Agilent電子天平BT125D德國(guó)sartorius水純化系統(tǒng)ThermoFisherBarnstead美國(guó)ThermoScientific移液槍(20uL,200uL,1000uL,10mL)ResearchPlus德國(guó)eppendorfpH計(jì)100A美國(guó)EcoSense微孔過(guò)濾膜0.45um,50mm，有機(jī)系中國(guó)津騰循環(huán)水真空泵SHZ-Ⅲ中國(guó)上海亞榮生化儀器水浴恒溫振蕩器SHZ88A中國(guó)常州諾基儀器2.2實(shí)驗(yàn)步驟2.2.1儀器條件(1)HPLC條件表3HPLC條件流量(mL/min)1.000進(jìn)樣體積(uL)100.00色譜柱HamiltonPRP-X100(2)ICP-MS條件硒有82Se,80Se,78Se,77Se,76Se,74Se共六種天然同位素。其中豐度最大的80Se由于受到Ar2在m/z=80的干擾而不能用于檢測(cè)；77Se的信噪比較差[22]；而82Se,76Se,74Se的豐度太小，響應(yīng)信號(hào)小，達(dá)到檢測(cè)靈敏度較為困難；豐度23.7%的78Se雖然受到40Ar38Ar+的干擾，但采用碰撞反應(yīng)池技術(shù)即可打散多原子離子[23,24]，消除干擾，故本實(shí)驗(yàn)采用碰撞反應(yīng)池、選用78Se進(jìn)行檢測(cè)。表4ICP條件參數(shù)參數(shù)值RF功率(W)1550RF匹配(V)1.80采樣深度(mm)10.0載氣(L/min)1.08蠕動(dòng)泵(rps)0.40表5ICP-MS條件參數(shù)參數(shù)值m/z78氬氣壓力(kPa)650載氣壓力(kPa)320等離子體氣體(L/min)15.00輔助氣(L/min)1.000載氣(L/min)1.000補(bǔ)償氣(L/min)1.000霧化室溫度(℃)22.002.2.2試樣配制(1)配制流動(dòng)相準(zhǔn)確稱取0.1216g檸檬酸銨于50mL燒杯中，加入超純水溶解，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶，少量超純水潤(rùn)洗3次，加入用量程10mL移液槍準(zhǔn)確移取兩次的共20mL甲醇，超純水定容至刻度，振蕩，即配得含2%甲醇的5mmol/L檸檬酸銨溶液，pH計(jì)測(cè)定pH，加入適量一水合檸檬酸溶液(稱取約2g一水合檸檬酸，溶于約10mL超純水)，調(diào)pH至4.4，在循環(huán)水真空泵抽濾，過(guò)0.45um,50mm，有機(jī)系微孔過(guò)濾膜，即配得流動(dòng)相。EcoSense100A型號(hào)pH計(jì)使用方法：使用前先校準(zhǔn)，開機(jī)，將玻璃電極置于中性標(biāo)準(zhǔn)溶液，按下STAND鍵，待示數(shù)穩(wěn)定變?yōu)镠OLD,測(cè)得pH為7左右，再將玻璃電極置于酸性標(biāo)準(zhǔn)溶液，按下SLOPE鍵，待示數(shù)穩(wěn)定變?yōu)镠OLD,測(cè)得pH為4左右，將玻璃電極從溶液取出，長(zhǎng)按MEASURE鍵5秒，顯示校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)在(100±5%)即可。測(cè)pH時(shí)將玻璃電極置于待測(cè)溶液，按下MEASURE鍵，即顯示pH。(2)配制含Se濃度為2umol/L單標(biāo)溶液準(zhǔn)確稱取0.00334g(SeCys)2于20mL燒杯中，加入超純水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶，少量超純水潤(rùn)洗5次，超純水定容至刻度，振蕩，即配得100umol/L(SeCys)2溶液，備用。用量程1000uL移液槍準(zhǔn)確移取1000uL上述溶液于另一100mL容量瓶中，超純水定容至刻度。即配得1umol/L(SeCys)2溶液，含Se濃度為2umol/L。準(zhǔn)確稱取0.00392gSeMet于20mL燒杯中，加入超純水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶，少量超純水潤(rùn)洗5次，超純水定容至刻度，振蕩，即配得200umol/LSeMet溶液，再用量程1000uL移液槍準(zhǔn)確移取1000uL上述溶液于另一100mL容量瓶中，超純水定容至刻度，即配得2umol/LSeMet溶液，含Se濃度為2umol/L。準(zhǔn)確稱取0.00364gL-SeMC于20mL燒杯中，加入超純水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶，少量超純水潤(rùn)洗5次，超純水定容至刻度，振蕩搖勻，即配得200umol/LL-SeMC溶液，再用量程1000uL移液槍準(zhǔn)確移取1000uL上述溶液于另一100mL容量瓶中，超純水定容至刻度，即配得2umol/LL-SeMC溶液，含Se濃度為2umol/L。用量程200uL移液槍準(zhǔn)確移取100uL四價(jià)硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1000μg/mL)于15mL含蓋離心管，加入用量程10mL移液槍準(zhǔn)確移取的6mL超純水,振蕩搖勻，即配得200umol/L四價(jià)硒溶液，再用量程1000uL移液槍準(zhǔn)確移取1000uL上述溶液于另一100mL容量瓶中，超純水定容至刻度，即配得2umol/L四價(jià)硒溶液，含Se濃度為2umol/L。用量程200uL移液槍準(zhǔn)確移取10uL六價(jià)硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(878μg/mL)于15mL含蓋離心管，加入用量程10mL移液槍準(zhǔn)確移取的5340uL超純水,振蕩搖勻，即配得200umol/L六價(jià)硒溶液，再用量程10mL移液槍準(zhǔn)確移取10mL上述溶液于另一100mL容量瓶中，超純水定容至刻度，即配得2umol/L六價(jià)硒溶液，含Se濃度為2umol/L。(3)配制含Se濃度為8umol/L混標(biāo)溶液將(1)中配得的100umol/L(SeCys)2溶液、200umol/LSeMet溶液、200umol/LL-SeMC溶液、200umol/L四價(jià)硒溶液、200umol/L六價(jià)硒溶液分別用量程1000uL移液槍準(zhǔn)確移取四次共4000uL于100mL容量瓶中，超純水定容至刻度，即配得含Se濃度為8umol/L的混標(biāo)溶液。(4)配制濃度為100mmol/LDTT溶液準(zhǔn)確稱取0.15425gDTT于15mL含蓋離心管，加入用量程10mL移液槍準(zhǔn)確移取的10mL超純水,振蕩，即配得濃度為100mmol/LDTT溶液。(5)配制含30%甲醇的檸檬酸銨溶液準(zhǔn)確稱取0.1216g檸檬酸銨于50mL燒杯中，加入超純水溶解，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶，少量超純水潤(rùn)洗3次，超純水定容至刻度，振蕩，即配得20mmol/L檸檬酸銨緩沖液。用量程10mL移液槍準(zhǔn)確移取七次共70mL20mmol/L檸檬酸銨緩沖液于250mL錐形瓶，加入用量程10mL移液槍準(zhǔn)確移取三次共30mL甲醇，振蕩，即配得含30%甲醇的14mmol/L檸檬酸銨的溶液，備用。(6)制備SeCys準(zhǔn)確稱取0.00334g(SeCys)2于20mL燒杯中，加入(5)中混合液溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶，少量(5)中混合液潤(rùn)洗5次，再加(5)中混合液定容至刻度，振蕩，即配得含甲醇的100umol/L(SeCys)2溶液，備用。用量程1000uL移液槍準(zhǔn)確移取上述制備的100umol/L(SeCys)2溶液1000uL兩次共計(jì)2mL于15mL含蓋離心管，再加入用量程100uL移液槍準(zhǔn)確移取的28uL配制的濃度為100mmol/LDTT溶液，振蕩搖勻，放入水浴恒溫振蕩器恒溫37℃2h，靜置冷卻至室溫，即制得200umol/LSeCys溶液，其中含有過(guò)量未反應(yīng)的DTT約1.2mmol/L。用量程1000uL移液槍準(zhǔn)確移取上述溶液250uL于25mL容量瓶，少量超純水潤(rùn)洗5次，超純水定容至刻度，振蕩，即配得2umol/LSeCys標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制含SeCys的濃度為8umol/L混標(biāo)溶液將(6)中反應(yīng)后冷卻的200umol/LSeCys溶液、200umol/LSeMet溶液、200umol/LL-SeMC溶液、200umol/L四價(jià)硒溶液、200umol/L六價(jià)硒溶液分別用量程1000uL移液槍準(zhǔn)確移取四次共4000uL于100mL容量瓶中，超純水定容至刻度，即配得含Se濃度為8umol/L的混標(biāo)溶液。第三章結(jié)果與討論3.1不同形態(tài)硒保留時(shí)間的確定單標(biāo)測(cè)定結(jié)果如下圖所示。由圖1可知，該條件下(SeCys)2保留時(shí)間為2.285min，含Se濃度為2umol/L時(shí)峰面積為304636。圖1(SeCys)2由圖2可知，該條件下SeMet保留時(shí)間為6.094min，含Se濃度為2umol/L時(shí)峰面積為28320。圖2SeMet由圖3可知，該條件下L-SeMC保留時(shí)間為3.055min，含Se濃度為2umol/L時(shí)峰面積為33277。圖3L-SeMC由圖4可知，該條件下Se[IV]保留時(shí)間為3.526min，含Se濃度為2umol/L時(shí)峰面積為22506。圖4Se[IV]由圖5可知，該條件下Se[VI]保留時(shí)間為10.824min。圖5Se[VI]圖5中有兩個(gè)峰的原因是Se[VI]不穩(wěn)定，在溶液中部分還原為Se[IV]，且本實(shí)驗(yàn)2.2.2（7）步驟基體中含有過(guò)量的DTT有還原性，故分離分析Se[VI]、Se[IV]較困難，本實(shí)驗(yàn)混標(biāo)測(cè)定定量時(shí)將二者共同分析，即Se[VI]、Se[IV]含Se濃度為4umol/L時(shí)峰面積為44148。由上述五圖可知，(SeCys)2、SeMet、L-SeMC、Se[IV]、Se[VI]的保留時(shí)間及先后順序?yàn)椋?SeCys)22.285min，L-SeMC3.055min，Se[IV]3.626min，SeMet6.094min，Se[VI]10.824min。3.2實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化3.2.1SeCys制備過(guò)程的優(yōu)化對(duì)反應(yīng)體系中甲醇含量進(jìn)行優(yōu)化。在前述2.2.2步驟(6)中用不含甲醇的14mmol/L檸檬酸銨溶液溶解配制(SeCys)2，測(cè)定結(jié)果如圖6所示。圖6不含甲醇的14mmol/L檸檬酸銨溶液(SeCys)2轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%，但(SeCys)2與生成的SeCys未達(dá)到基線分離。在前述2.2.2步驟(6)中用含15%甲醇的14mmol/L檸檬酸銨溶液溶解配制(SeCys)2，測(cè)定結(jié)果如圖7所示。圖7含15%甲醇的14mmol/L檸檬酸銨溶液(SeCys)2與生成的SeCys依舊未達(dá)到基線分離，轉(zhuǎn)化率超過(guò)99%，未反應(yīng)的(SeCys)2濃度小于0.02umol/L。在前述2.2.2步驟(6)中用30%含甲醇的14mmol/L檸檬酸銨溶液溶解配制(SeCys)2，測(cè)定結(jié)果如圖8所示。圖8含30%甲醇的14mmol/L檸檬酸銨溶液只有生成的SeCys的峰，認(rèn)為轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，且峰形較為對(duì)稱。SeCys保留時(shí)間為2.551min，濃度為4umol/L時(shí)峰面積為24207?？紤]到甲醇含量升高對(duì)(SeCys)2溶解性的影響，甲醇含量超過(guò)30%時(shí)，在水浴恒溫振蕩器恒溫37℃2h不能使(SeCys)2完全溶解，本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系采用含30%甲醇的14mmol/L檸檬酸銨溶液。3.2.2色譜分離過(guò)程的優(yōu)化(1)流動(dòng)相pH本實(shí)驗(yàn)先以pH分別為7.5,6.5,5.5,4.5的流動(dòng)相進(jìn)行混標(biāo)的分離，混標(biāo)中(SeCys)2濃度為4umol/L，SeMet、L-SeMC濃度均為8umol/L，Se[IV]、Se[VI]濃度之和為16umol/L，DTT與(SeCys)2的物質(zhì)的量之比為14:1。流速1mL/min、流動(dòng)相為含2%甲醇的5mmol/L檸檬酸銨溶液條件下，測(cè)定結(jié)果如下圖所示。由圖9、圖10、圖11、圖12的譜圖可知，pH=7.5時(shí)，(SeCys)2、SeMet出峰且峰形對(duì)稱，L-SeMC與Se[IV]未分離且有拖尾現(xiàn)象，Se[VI]未出峰；pH=6.5時(shí)，Se[VI]可出峰，但L-SeMC與Se[IV]未分離且有拖尾現(xiàn)象；pH=5.5時(shí)，L-SeMC與Se[IV]未分離且有拖尾現(xiàn)象，SeMet、Se[VI]峰明顯后移，保留時(shí)間延長(zhǎng)；pH=4.5時(shí)，L-SeMC與Se[IV]可分離，五種形態(tài)硒可分離，Se[VI]峰后移，保留時(shí)間延長(zhǎng)至11min后。故一定范圍內(nèi)，隨pH降低，L-SeMC與Se[IV]可分離，SeMet、Se[VI]峰有后移。圖9流動(dòng)相pH=7.5圖10流動(dòng)相pH=6.5圖11流動(dòng)相pH=5.5圖12流動(dòng)相pH=4.5pH=4.5時(shí)能基本實(shí)現(xiàn)對(duì)五種形態(tài)硒的分離，且峰形較對(duì)稱，但L-SeMC與Se[IV]未達(dá)到基線分離，故在pH=4.5附近范圍內(nèi)進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。以pH分別為5.0,4.7,4.3的流動(dòng)相進(jìn)行混標(biāo)的分離。由圖13譜圖可知，pH=5.0時(shí)，L-SeMC與Se[IV]分離度較差，L-SeMC與Se[IV]間未達(dá)到基線分離，且(SeCys)2與L-SeMC和Se[IV]之間拖尾明顯。圖13流動(dòng)相pH=5.0由圖14、圖15譜圖可知，pH=4.7和4.3時(shí)，L-SeMC與Se[IV]間達(dá)到基線分離，且(SeCys)2與L-SeMC和Se[IV]之間拖尾減輕。隨著pH降低，L-SeMC與Se[IV]分離度增大，峰形趨于對(duì)稱，但保留時(shí)間最大的峰即Se[VI]對(duì)應(yīng)的峰保留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，pH=4.3時(shí)已延長(zhǎng)至超過(guò)12min。圖14流動(dòng)相pH=4.7圖15流動(dòng)相pH=4.3綜上所述，綜合考慮到pH對(duì)出峰、基線、峰形、保留時(shí)間的影響，pH=4.7為最優(yōu)流動(dòng)相pH，此時(shí)五種形態(tài)硒均出峰，基線平穩(wěn)，峰形對(duì)稱，保留時(shí)間在12min以內(nèi)。流動(dòng)相濃度制備SeCys時(shí)，反應(yīng)體系采用含30%甲醇的14mmol/L檸檬酸銨溶液，色譜分離時(shí)分別采用濃度2mmol/L、4mmol/L含2%甲醇的檸檬酸銨溶液作為流動(dòng)相，譜圖如下圖16、圖17所示。圖16含2%甲醇的2mmol/L檸檬酸銨溶液圖17含2%甲醇的4mmol/L檸檬酸銨溶液由圖16、圖17可知，流動(dòng)相含2%甲醇的檸檬酸銨溶液濃度較低時(shí)，各峰延后，保留時(shí)間延長(zhǎng)，且基線不平穩(wěn)。由于儀器限制，流動(dòng)相含2%甲醇的檸檬酸銨溶液濃度為6mmol/L時(shí)，儀器無(wú)法負(fù)荷，導(dǎo)致ICP-MS熄火。綜上所述，綜合考慮到儀器狀況和流動(dòng)相濃度對(duì)基線、峰形、保留時(shí)間的影響，本實(shí)驗(yàn)選用含2%甲醇的5mmol/L檸檬酸銨溶液作為流動(dòng)相。3.3分離硒代半胱氨酸混標(biāo)分離測(cè)定結(jié)果如圖18所示。圖18分離硒代半胱氨酸3.3.1分離度分離度公式：五種形態(tài)硒的保留時(shí)間及半峰寬如表6所示。表6半峰寬形態(tài)保留時(shí)間/min半峰寬/minSeCys2.4500.351L-SeMC3.0210.216SeMet3.5840.229Se[IV]5.1360.394Se[VI]11.7440.380可得SeCys與L-SeMC之間分離度為R1=2.014，L-SeMC與SeMet之間分離度為R2=2.530，SeMet與Se[IV]之間分離度為R3=4.982，Se[VI]與Se[IV]之間分離度為R4=17.074。分離度均超過(guò)1.5，各組分完全分離，實(shí)現(xiàn)了SeCys的分離。3.3.2SeCys定量由混標(biāo)譜圖，SeCys濃度8umol/L時(shí)峰面積為45582?？梢罁?jù)如下兩種方法定量。（1）單點(diǎn)法在該儀器條件、基體條件下，可據(jù)此使用單點(diǎn)法定量，對(duì)未知樣品中SeCys的濃度進(jìn)行測(cè)定。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法在相同儀器條件、基體條件下，制備SeCys標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，SeCys濃度為4umol/L時(shí)峰面積為24207，結(jié)合混標(biāo)譜圖中SeCys濃度為8umol/L時(shí)峰面積為45582，作得SeCys標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖19所示。圖19SeCys標(biāo)準(zhǔn)曲線Pearson相關(guān)系數(shù)R2=0.9987，線性相關(guān)性較好，在該儀器條件、基體條件下，可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，對(duì)未知樣品中SeCys的濃度進(jìn)行測(cè)定。3.3.3L-SeMC、SeMet、Se[IV]和Se[VI]定量在相同儀器條件、基體條件下，L-SeMC濃度為2umol/L時(shí)峰面積為33277，結(jié)合混標(biāo)譜圖中L-SeMC濃度為8umol/L時(shí)峰面積為106218，作得L-SeMC標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖20所示。圖20L-SeMC標(biāo)準(zhǔn)曲線在相同儀器條件、基體條件下，SeMet濃度為2umol/L時(shí)峰面積為28320，結(jié)合混標(biāo)譜圖中SeMet濃度為8umol/L時(shí)峰面積為85440，作得SeMet標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖21所示。圖21SeMet標(biāo)準(zhǔn)曲線在相同儀器條件、基體條件下，Se[IV]和Se[VI]混合總濃度為4umol/L時(shí)峰面積為28320，結(jié)合混標(biāo)譜圖中Se[IV]和Se[VI]混合總濃度為16umol/L時(shí)峰面積為85440，作得Se[IV]和Se[VI]標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖22所示。圖21Se[IV]和Se[VI]標(biāo)準(zhǔn)曲線Pearson相關(guān)系數(shù)R2均超過(guò)0.99，線性相關(guān)性較好，在該儀器條件、基體條件下，可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，對(duì)未知樣品中L-SeMC、SeMet、Se[IV]和Se[VI]的濃度進(jìn)行測(cè)定。3.4實(shí)驗(yàn)過(guò)程的不足與改進(jìn)本實(shí)驗(yàn)雖然成功實(shí)現(xiàn)對(duì)硒的五種不同形態(tài)SeCys、L-SeMC、SeMet、Se[IV]和Se[VI]進(jìn)行分離測(cè)定，但是實(shí)驗(yàn)過(guò)程依然存在以下不足之處，并提出對(duì)應(yīng)改進(jìn)措施。（1）未實(shí)現(xiàn)同時(shí)定量SeCys和(SeCys)2由于還原硒代胱氨酸(SeCys)2制備硒代半胱氨酸SeCys的過(guò)程中，加入的DTT是過(guò)量的，DTT無(wú)法從混標(biāo)基體中分離，若在混標(biāo)中加入(SeCys)2可能被DTT還原為SeCys，從而導(dǎo)致定量分析有較大誤差。改進(jìn)措施主要有以下兩點(diǎn)：①消耗剩余DTT。(SeCys)2完全轉(zhuǎn)化成SeCys后，加入某種物質(zhì)消耗剩余的過(guò)量DTT，使之被氧化或絡(luò)合，而不破壞SeCys，且生成物不影響SeCys與(SeCys)2分離與定量，考慮某些生物活性酶可與DTT發(fā)生重組反應(yīng)而不與SeCys反應(yīng)，例如肌酸激酶[25]，還有某些可與DTT絡(luò)合的物質(zhì)，例如孔雀石綠染料三苯基甲烷與DTT絡(luò)合生成沉淀[26]，及能氧化DTT而不氧化SeCys的物質(zhì)，例如某種Pt(Ⅳ)配合物trans-[PtCl2(en)(heda)]Cl2[27]；②特異性標(biāo)記SeCys。檢測(cè)未知樣品中SeCys時(shí)，將SeCys標(biāo)記，而(SeCys)2不被標(biāo)記，即可分開測(cè)定二者，考慮可與SeCys中裸露的巰基反應(yīng)的氯化甲基汞[24]，未進(jìn)行氯化甲基汞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的原因除了過(guò)量的DTT未除去之外，還有一個(gè)原因是(SeCys)2標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)測(cè)定含有Hg，而儀器未被污染，可能是出廠產(chǎn)品就含有Hg，也可能是外來(lái)污染。（2）未實(shí)現(xiàn)同時(shí)定量Se[IV]和Se[VI]SeCys反應(yīng)體系中有過(guò)量的DTT，Se[VI]可能被還原，其次標(biāo)準(zhǔn)溶液中也存在Se[VI]還原成Se[IV]，且從而導(dǎo)致定量分析有較大誤差。改進(jìn)措施主要也是消耗剩余DTT。加入某種物質(zhì)消耗剩余的過(guò)量DTT，使之被氧化或絡(luò)合，而不破壞Se[IV]和Se[VI]，且生成物不影響Se[IV]和Se[VI]分離與定量。條件優(yōu)化不夠完善DTT還原硒代胱氨酸(SeCys)2制備硒代半胱氨酸SeCys的實(shí)驗(yàn)步驟中，未進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、振蕩強(qiáng)度等條件。結(jié)論與展望本實(shí)驗(yàn)成功制備硒代半胱氨酸SeCys。用含30%甲醇的14mmol/L檸檬酸銨溶液溶解硒代胱氨酸，以過(guò)量的DTT還原，二者比例為1:14，認(rèn)為此條件下轉(zhuǎn)化率接近100%。本實(shí)驗(yàn)成功分離測(cè)定硒代半胱氨酸SeCys。在含有DTT約1.2mmol/L的基體中，最佳的色譜分離條件下，流動(dòng)相為含2%甲醇的5mmol/L檸檬酸銨溶液及本實(shí)驗(yàn)儀器條件下，SeCys保留時(shí)間為2.551min，定量標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)超過(guò)0.9987，分離度為2.014.同時(shí)也可分離測(cè)定其它四種形態(tài)的硒，L-SeMC、SeMet、Se[IV]和Se[VI]。SeCys缺乏標(biāo)準(zhǔn)品這個(gè)問(wèn)題一直阻礙與其有關(guān)的測(cè)定和研究，本實(shí)驗(yàn)對(duì)SeCys的制備為制備穩(wěn)定、高純度的SeCys提供了參考。待研制得到SeCys標(biāo)準(zhǔn)品，屆時(shí)SeCys在人體及動(dòng)物體內(nèi)參與的生化反應(yīng)將有望被系統(tǒng)的研究，硒元素的代謝過(guò)程及其與健康的關(guān)系將更為明了。本實(shí)驗(yàn)中的不足及方法誤差，尤其是有關(guān)DTT對(duì)于硒形態(tài)分析的負(fù)面影響，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究，SeCys的制備過(guò)程的條件優(yōu)化也有待完善。致謝首先感謝我的指導(dǎo)老師陳艷玲教授和湖北省疾控中心衛(wèi)生檢驗(yàn)檢測(cè)研究所的黃文耀主任，在過(guò)去的三個(gè)月里面與我討論實(shí)驗(yàn)的方向，為我答疑解惑，每當(dāng)我在實(shí)驗(yàn)期間遇到問(wèn)題時(shí)，老師們都會(huì)耐心指導(dǎo)，并且引導(dǎo)我去找出新的實(shí)驗(yàn)思路。在此，我想衷心的對(duì)兩位致以最真誠(chéng)的敬意、感激和祝福！還要感謝湖北省疾控中心的張穎和向倩倩老師，耐心為我講解色譜、質(zhì)譜儀器的使用方法及注意事項(xiàng)，我才能順利按時(shí)完成實(shí)驗(yàn)。最后，感謝和我一起在湖北省疾控中心衛(wèi)生檢驗(yàn)檢測(cè)研究所做實(shí)驗(yàn)的李璐穎同學(xué)，在各自的實(shí)驗(yàn)進(jìn)入瓶頸時(shí)相互鼓勵(lì)，現(xiàn)在都已順利結(jié)束實(shí)驗(yàn)。你們讓我更加深刻的了解，一個(gè)實(shí)驗(yàn)課題的完成，既需要物質(zhì)和技術(shù)上的支持，也需要參與的人員之間的信任與配合。還有一個(gè)月的時(shí)間，我就將從中國(guó)地質(zhì)大學(xué)畢業(yè)，回首大學(xué)時(shí)光，我很慶幸。專業(yè)上，我對(duì)化學(xué)學(xué)科有了更多的理解，更加了解自己感興趣的方向，思維漸漸趨于理性。生活中，我遇到了專業(yè)、盡責(zé)的老師，真誠(chéng)、樸素的同學(xué)，參與了豐富的活動(dòng)。感謝大學(xué)期間遇到的所有人，你們陪伴我度過(guò)我的青春里最難忘的時(shí)光，感謝大學(xué)期間遇到的所有事，使我愈發(fā)堅(jiān)強(qiáng)而平和。最應(yīng)該感謝我的家人朋友，在這樣一個(gè)緊張、彷徨的階段，給予我關(guān)心、支持、包容和鼓勵(lì)。如今，大家要各自奔赴不同的領(lǐng)域和城市，追求自己的理想，我祝福大家能有所收獲，無(wú)怨無(wú)悔。參考文獻(xiàn)【1】鄭文杰，歐陽(yáng)政.植物有機(jī)硒的化學(xué)及其醫(yī)學(xué)作用[M]．東南大學(xué)出版社，2001，7～8．【2】ClarkLC,TumbullBW，TumbullBW．Effectsofsdeniumsupplementationforcancerpreventioninpatientswithcarcinomaoftheskin：arandomizedcontrolledtrial．JAMA，1996，276：1957～1963.【3】張穎,楊清清,宋毅,etal.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定富硒食品中無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒的含量[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2017(2).【4】仲娜.電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)及高效液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ICP/MS)用于富硒生物樣品中硒的化學(xué)形態(tài)組成及分布規(guī)律研究[D].中國(guó)海洋大學(xué),2008.【5】李林富,張國(guó)賓.硒作為食品強(qiáng)化劑的意義和可能性[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,1991,7,(1).【6】顧公望,季畢澄.硒與癌癥流行病學(xué)研究現(xiàn)狀[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：醫(yī)學(xué)地理分冊(cè),1994(3):108-111.【7】衛(wèi)好國(guó).硒抗癌作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,1990(1):24-26.【8】任煊靜,趙淑敏,葉煒宗.硒與重金屬相互作用的研究進(jìn)展[J].廣州化工,2014(17).【9】李小樑.微量元素與長(zhǎng)壽[J].廣東微量元素科學(xué),2005(12):37-37.【10】趙秋香,盛獻(xiàn)臻,李媛媛.離子對(duì)反相高效液相色譜分離幾種常見(jiàn)的有機(jī)硒[J].廣州化工,2011,39(14),112-114.【11】胡斌,江祖成.色譜-原子光譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及形態(tài)分析[M].2005：279.【12】李娜,王旭,孫芳芳.硒形態(tài)分析研究進(jìn)展[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(3):437-441.【13】王金榮,付佐龍,邢志.液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用(HPLC-HG-AFS)技術(shù)對(duì)飼料及富硒酵母中硒形態(tài)的分析[J].飼料工業(yè),2013,34(1).【14】IpolyiI,CornsW,StockwellP,etal.SpeciationofinorganicseleniumandselenoaminoacidsbyanHPLC-UV-HG-AFSsystem[J].JournalofAutomatedMethodsandManagementinChemistry,2001,23(6):167-172.【15】Sanchez-RodasD,MellanoF,MoralesE.AsimplifiedmethodforinorganicseleniumandselenoaminoacidsspeciationbasedonHPLC–TR–HG–AFS[J].Talanta,2013,106C:298-304.【16】ZhangY,FrankenbergerWT.Speciationofseleniuminplantwaterextractsbyionexchangechromatography-hydridegenerationatomicabsorptionspectrometry[J].ScienceoftheTotalEnvironment,2001,269(1-3):0-47.【17】NiedzielskiP.Thenewconceptofhyphenatedanalyticalsystem:Simultaneousdeterminationofinorganicarsenic(III),arsenic(V),selenium(IV)an