臨床基因擴增(PCR)診斷實驗室工作規(guī)范

2臨床基因擴增〔PCR〕診斷試驗室工作標準〔試行〕效勞，特制定本標準。臨床基因擴增試驗室的設置：和儀器設備臨床PCR試驗室應分為四個隔開的工作區(qū)域，每一區(qū)域都應有專用的儀器設備。即1〕擴增反響混合物配制和擴增區(qū)和的擴增產(chǎn)物分析區(qū)。如使用擴增和產(chǎn)物檢測同時完成的熒光定量PCR方法或全自動如CobasT〔Anplicor〕3〕4〕兩個區(qū)可合并。與上述特定試驗區(qū)有關的各個房間必需有明確的標記如加樣器、試劑等的移出或不同的工作區(qū)間發(fā)生混淆。進入各個工作區(qū)必需遵循一嚴格的〕～標本制備區(qū)～擴增反響混合物配制和擴增區(qū)～擴增產(chǎn)物分析區(qū)。不同的工作區(qū)必需使用不同的工作服，可以不同的顏色來區(qū)分。此外，當工作人員離開各工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。1．l．試劑貯存和預備區(qū)4冰箱和一20〔〕〔3〕微量加樣器假設干支〔掩蓋11000p〔〕專用〕〕消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離。心管和加樣器吸頭〔帶濾心〕可移動紫外燈〔近工作臺面。標本制備區(qū)標本貯存、核酸提取及貯存均在本區(qū)內進展。RNA測定時的單鍵。cDNA合成也在本區(qū)進展。本區(qū)儀器設備自己置〔420-70冰柜三〔2〕高達臺式冷凍離心〕4〕水浴箱或加熱模塊〔5〕微量如排器假設干支〔掩蓋1000μ專用工作服和工作鞋〔〕專用辦公用品8〕消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的部心管和加樣器吸頭〔帶濾心〔9〕可移動紫外燈〔近工作臺面〔10〕超凈工1〕超聲波水浴〔處理大分子DNA適用。擴增反響混合物配制和擴增區(qū)模板材料〔來自標本制備區(qū)〕〔來自試劑貯存和預備區(qū)〕的參與以及擴〔〕核酸擴增僅三〔2〕微量加樣器〔掩蓋～1000μ〕專用工作服和工作鞋〔〕專用辦公用品〕消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、高壓處理的部心管和加樣器吸頭〔帶濾心〔〕可移動紫外燈〔近工作臺面。擴增產(chǎn)物分析區(qū)6～8m。擴增嚴物的分析在本區(qū)進展。本區(qū)儀器設備配置：視檢測方法不同而定，如為PCR�ELISA，則需〔l〕微量加樣器假設干支〔掩蓋l～2s〔2〕酶標權、〔〕專用工作服和工作鞋〔〕專用辦么，用品〔〕消耗品：～次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭〔帶濾心〕可移動紫外燈〔近工作臺面。臨床基因擴增診斷試驗室質量保證臨床基因擴增診斷試驗室質量保證涉及到整個基因擴增檢測的全部階段的標原來集處理、測定中的核酸提取、擴增和產(chǎn)物分析以及測定后的結果報告等。標本的采集常用于基因擴增檢測的臨床標本包括EDTA或拘檬酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿．痰、腦普液、尿及分泌物等。采樣容器最好是密閉的一次性的，如真空系血管。一次性塑〔ANA酶。RNA酶的主要來源是試驗人員的手。最好是熱滅菌，250烘烤4RNA酶永久性失活。全血和骨髓標本必需進展抗凝處理。通常EDTA和拘檬酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗TaqRNA〔HCVRNA〕〔3小時以內避開RNA的降解。如未作抗凝處理，則物血后，必需在1小時內分別血清。標本的穩(wěn)定化處DNA分析，標本采集后一般不需要特別的穩(wěn)定化處理，但標本應準時送到試驗室。由RNARNA測定的標本的穩(wěn)定化處理有時是必不行少的，Chaotropic物質[〔Guanidinethiocyanate，GITC〕]DNAseRNAse馬上失活。在采集標本時，可將標本材料如血清或血漿參與含有GITC的試劑管中進展穩(wěn)定化處理。GITCRNAse5mol/LGITC濃度小于4mol／L；RNA會很快降解。在適當?shù)姆€(wěn)定化處理后，標本一般不需要冷藏即可郵寄。假設溫度低于室溫，GITC即會結晶，所以在參與標本前應使之完全溶解。如標本不能準時送到試驗室，最好選用GITC處理方法以穩(wěn)定標本。2．3標本的運送標原來集后應盡快送至試驗室，經(jīng)過適當穩(wěn)定化處理的標本可在常溫下通過郵寄運送。如用于DNA提取的含EDTA的全血標本及用于RNA提取的經(jīng)GITC穩(wěn)定化處理的標RNA放在干冰中運送。標本的貯存臨床體液標本如血清／血漿等可于-70下長時間貯存。用于DNA測定的核酸樣本應在10mmol／LTris，lmmol／LEDTA緩沖液〔pH7．5－8．0〕中4保存。用于RNA測定80C或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在一20OC即可。用GIT〔：穩(wěn)定化處理的RNA標本在室溫可保存7天，如貯存時間較長，則RNA測定敏感性略有下降。標本的處理〔核酸提取〕〔如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物或核酸提取過程中確．留的有機溶劑〔如酚、氯份等從而影響靶核酸的擴增測定。如在HBVDNAPCR測定中。承受對血清杯水煮沸裂解以釋放DNA的方法時，肉眼觀看不明顯的溶血也會對擴增測定有很強的抑制作用，應使用正規(guī)的核酸提取方法〔如經(jīng)典的酚一氯份提取方法、硅吸附法等。當標本為疾時，則必需先進行液化處理。再提取核酸。需留意的是；液化時不能加熱，液化時間不能過長。此外，當靶核酸為RNART－PCR測定失敗的常見緣由是標本在運送前來經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理．及核酸提取試劑的RNase的污染。對于前者，要核查測定分析前的步驟，假設沒．現(xiàn)RNA降解的證據(jù)。試驗室則應拒絕承受標本，要求重實行標本，并對運送者給以具體的指導。對于后者，建議常規(guī)使用高質量的商品核酸提取試劑。靶核酸的逆轉錄和擴增2．6.lRNA的逆轉錄cDNA合成為RT-PCR中的第一個酶反響步驟，所產(chǎn)生的cDNA為靶RNA的反向互補鏈。為后面擴增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率：l〕RT活性的降低或完全缺乏。必需排解由于酶質量不高、試劑降解或加樣錯誤而引起的cDNA合成不充分。RT或熱穩(wěn)定聚合酶的抑制物〔如酚、血紅素RNA明顯為完整而沒有擴增時，應疑心有此類抑制物。RNA的降解。2．6．2影響擴增的因素有多種因素可引起PCR〔見上、遲大溫環(huán)儀的溫度把握和加熱塊中熱傳導的全都性必需有常規(guī)的檢查以避開假陰性結果。污染在實際工作中，常見有以下幾種污染類型：PCR片段的污染〔產(chǎn)物污染〕三自然基因組DNA的污染；試劑污染〔貯存液或工作液：以及交及污染〔如氣溶膠從一個陽性標本集中到原本陰性的標本。對于全部的擴增技術，由于圍繞試驗室來查找污染源不僅耗時而PCR片段污染。2．7．l．測定分析前的污染源。測定分析前試驗材料的污染主要來自非病人標原來源的核酸。測定分析階段的污染源。的制備和反響建立階段所涉及到的試驗設備的任何部位都是可能的污染源〔例如今血清白蛋白，明腋成礦物油；商品酶制劑；消耗品〔如反響管，吸頭〕和試驗設備〔如加樣器、離心機。污染的來源之一是很多樣本在同時制備時的交及污染，但最主要的污染來源為以前擴增產(chǎn)生的特異產(chǎn)物DNA片段。在前面三個工作區(qū)中，不當?shù)脑囼灢僮鲿鹚褂玫脑噭?、消耗品或試驗設備的污染。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當吸取PCR產(chǎn)物用于檢測時，格外簡潔引起污染，因此必需制定并嚴格執(zhí)行標準操作程序。污染的避開。應中用dUTP取代局部dTTP：從而產(chǎn)生的特異擴增片段含有尿嘧啶，這樣擴增前在反響混合液中參與尿嘧啶糖激酶UNGDNA加合物，由于DNA加合物對擴增沒有反響但又不阻礙PCR后雜交過程，所以這些DNA的污染。去除污染的措施。染措施包括但不僅限下面幾種：用100ml／L次氨酸鈉清潔外表；試驗了后長時間的紫外照耀試驗操作臺和其他外表；試驗設備如加樣器的高壓消毒。擴增產(chǎn)物的分析擴增產(chǎn)物的測定有各種方法。如電泳、限制性酶切、斑點印跡、雜交、測序、分光光度法定量等。但臨床PCR測定工程根本上都使用探針雜交方法。2．8．l．與雜交檢測有關的干擾。交或洗滌方法不適宜。最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的尊核普酸和體外的轉錄本〔反義RNA探針。探針的標記物常用的有生物素、地高辛、熒光景和同位素等。在擴性結果的先決條件，要留意的是，溫度和離子強度不能同時轉變。質量把握如上所述，應當開展各種質控來評價測定分析當中各步驟的質量，如RNA的完整性、對擴增是否適宜和敏感。室內質量把握DNA和RNA分析的各步進展質量把握，以避開假陽性和假陰性，保證測定結果的準確性。由于PCR測定的高敏感性，所以試劑的生產(chǎn)、試驗材料的預備、PCR本身和上稍有不同。與試驗材料的預備有關的質控。對DNA提取試劑的效果最常用球脂糖凝膠電冰來檢測?？芍崛〉腄NA是否發(fā)生DNA的平均長度一般為～100kbPCR的DNADNA30�40kb。然而；明顯消滅降解的DNA〔在1和10kb的低分子量范圍內〕在經(jīng)瓊脂糖凝膠電冰分別和用溴化乙錠染色后也可見有強的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內切酶〔如EcoRI〕消化DNA，然后電泳分別，能夠對酶活性的抑制劑進展質控〔在抑制劑存在的狀況下，高分子量的片段不被酶切。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測定來估量，好的DNA提取物，A260/A280比值應當在1．75--2．0之間；否則，污染〔殘留的蛋白或酚〕可能會很高。僅用光度計比色方法不能對DNA的完整性下結論。最快的對總RNA提取質量把握的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電冰，這一點跟DNA分別一樣，然而，假設對結果產(chǎn)生疑心，就應當在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNARNA(28S、18s和5S〕在凝膠上消滅的帶相對較窄。如發(fā)生RNA的降解。則帶被拖向低分子量或消滅帶的缺失。測定核糖體RNARNA制備的質量評價的試驗室內的標準；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的適宜的指標。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNARNA的完整性下結論。對cDNA合成和擴增的質控。本局部包括陽性質控和陰性質控。2．9．l．2．l．cDNA的合成。對CDNA合成的效率進展監(jiān)控的關鍵性的質控是使用一個內反響質控。cDNA的合成RNAcRNA轉錄本開頭(mRNA，如核糖體蛋白轉錄本這一類的所謂的管家基因，也可從在制備時參與樣本中的作為內標準的RNA開頭。cDNA合成的內質控是能夠產(chǎn)生確定產(chǎn)物的陽性質控；假設擴增不成功，質控就顯示出有RNA的降解、cDNA合成的過程中錯誤啟動或酶活性喪失。參與確定量的擴增質控物可以檢測RT�PCRRT－PCR方法所必需的污染質控為無逆轉錄靶RNA的陰性質控。2．9．1．2．2．PCR反響。豐臺子狀態(tài)存在，由于假設基因組缺失這些基因，將使有機體致死〔所謂的致死因子，一個比較好的例子就是維生素D血漿結合蛋白的基因；在世界范圍內的很多種族已覺察其廣泛的多態(tài)性，并且還沒有覺察基因活性的同源性喪失，因此，通過PCR共同擴增這種基因的一個片段，在全部患者中均可獲得成功，并且也會證明擴增反響是成功的。在測定血清／血漿病原體核酸如HBVDNA、HCVRNA等時，應使用的弱陽性血性。使用這些外加弱陽性質控不但可檢測擴增反響液的質量，還可獲得有關PCR檢測下限和〔即患者的標本所使用的一樣的主反響混合液。假設疑心方法的檢測下限缺乏以檢測出產(chǎn)物時，則每一個反響管都必需加擴增質控。外加陰性質控〔污染質控〕在每一個PCR試驗中都必需設有，應當包括幾種陰性質控。PCR過程中污染消滅的階段。包括在樣品制備的整個過程中所〔所謂的模擬制備〕的反響管等。模擬質援可以評估PCR試驗的綜合質量。它不能覺察樣本處理過程中的污染源