登革病毒2型感染人靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株eahy926對細(xì)胞自噬的影響

登革病毒2型感染人靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株eahy926對細(xì)胞自噬的影響

病毒登格病毒（dv）是一種重要的害蟲病毒，通過堿性蚊子傳播。每年大約有100萬人感染該病毒，并嚴(yán)重威脅到亞熱帶和亞熱帶國家的公共衛(wèi)生安全。其中，登格病毒2型（dv2）最受歡迎。登革病毒可引起人類登革熱(denguefever,DF),嚴(yán)重者可出現(xiàn)登革出血熱(denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克綜合征(dengueshocksyndrome,DSS)。DHF/DSS最主要的特征為出血及血管滲漏,表明登革病毒在一定程度上會對血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷。因此DV誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷機(jī)制的研究一直是我們關(guān)注的焦點。自噬,是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象,是生物在其發(fā)育、老化過程中均存在的一種凈化自身多余或受損細(xì)胞器的共同機(jī)制,但過度的自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞的程序性死亡,因此自噬又被稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。作為Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡的凋亡與自噬之間復(fù)雜的動態(tài)關(guān)系尚未完全清楚,一般認(rèn)為自噬作為細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制,先于凋亡發(fā)生。我們前期研究表明,DV感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinsendotheliumcell,HUVEC)會誘導(dǎo)凋亡,在48h細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰;DV也能誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EAhy926發(fā)生凋亡,出現(xiàn)細(xì)胞凋亡高峰時間在60h。DV誘導(dǎo)的EAhy926細(xì)胞凋亡在達(dá)到高峰之前,細(xì)胞已發(fā)生了顯著的自噬,但發(fā)生自噬的機(jī)制及與凋亡之間的相互關(guān)系不明。為了解登革病毒誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬情況,本實驗利用流式細(xì)胞儀技術(shù)在DV2感染EAhy926細(xì)胞后不同時間點檢測發(fā)生自噬的細(xì)胞百分率與酸性自噬泡平均熒光密度,以此探討登革病毒感染對EAhy926自噬的影響,為進(jìn)一步研究血管內(nèi)皮細(xì)胞引起血管滲漏綜合癥及利用自噬抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的可能性提供一定的理論參考依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1血管內(nèi)皮細(xì)胞EAhy926是由人肺腺癌細(xì)胞株A549與原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC融合構(gòu)建而成的永生化細(xì)胞株,具有血管內(nèi)皮細(xì)胞的特性,為中山醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞教研室惠贈。1.1.2病毒DV2病毒株來自中山醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室,本實驗室已進(jìn)行病毒擴(kuò)增和定量保存。1.1.3主試劑DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗等為Gibco產(chǎn)品。吖啶橙(acridineorange,AO)為Sigma產(chǎn)品。1.2方法1.2.1血清及青鏈霉素雙抗EAhy926用100mL/L胎牛血清及青鏈霉素雙抗為1.0×105U/L的DMEM/F12培養(yǎng)液,37℃,體積分?jǐn)?shù)為5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。1.2.2胎牛血清中eayn986的表達(dá)對數(shù)生長期的EAhy926按1×106個/孔接種于6孔板,待細(xì)胞培養(yǎng)24h后,PBS洗滌2次。感染組的EAhy926取已定量好的2型登革病毒液(106pfu/mL)加入EAhy926細(xì)胞培養(yǎng)板中吸附2h,棄去上清,加入含20mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液,同時設(shè)立對照組(未吸附病毒,用含20mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液維持培養(yǎng)),37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng),于12、24、36、48h各時間點棄去培養(yǎng)液,收集細(xì)胞。1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的制備同一批EAhy926細(xì)胞分成對照組和感染組,感染組在DV2感染EAhy926細(xì)胞后12、24、36、48h分別收集細(xì)胞,500×g5min離心,用PBS洗滌2遍。用buffer重懸并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106cells/mL吸取100μL轉(zhuǎn)移至5mL的流式離心管中,加入終濃度為0.5μg/mL的吖啶橙溶液混勻,室溫避光孵育10min,PBS洗滌2遍后用buffer200μL重懸,流式細(xì)胞儀檢測。對照組相應(yīng)時間點收集細(xì)胞做同樣處理做以對照。實驗重復(fù)5次。1.3統(tǒng)計處理實驗數(shù)據(jù)用ue0af±s表示,運用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析和配對t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1感染組在不同時間點自噬細(xì)胞的細(xì)胞百分率對照組EAhy926細(xì)胞4個時間點(12、24、36、48h)發(fā)生自噬的細(xì)胞百分率分別為:(70±7)%,(72±6)%,(71±8)%和(69±10)%。感染組EAhy926細(xì)胞4個時間點自噬的細(xì)胞百分率分別為(75±3)%,(78±3)%,(77±5)%,(80±7)%(圖1),感染組自噬細(xì)胞百分率增加。實驗重復(fù)5次,對照組和感染組各時間點發(fā)生自噬的細(xì)胞百分率經(jīng)方差分析和配對t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中48h對照組和感染組發(fā)生自噬的細(xì)胞百分率差異最明顯(圖2)。2.2酸性自噬泡熒光密度對照組4個時間點(12h,24h,36h,48h)酸性自噬泡平均熒光密度分別為:36.4±3.4,37.0±3.3,35.8±2.3,34.4±3.2。感染組酸性自噬泡平均熒光密度分別為41.1±2.3,45.0±4.8,41.3±3.3,44.5±7.5。感染組自噬泡平均熒光密度增加。實驗重復(fù)5次,對照組和感染組各時間點EAhy926酸性自噬泡平均熒光密度經(jīng)方差分析和配對t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中在48h對照組和感染組酸性自噬泡平均熒光密度差異最明顯(圖3)。3紅色熒光的熒光檢測自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種細(xì)胞分解細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞器等自身構(gòu)成成分的生理現(xiàn)象,其發(fā)生是內(nèi)因(損傷的細(xì)胞器、變異的蛋白的大量積蓄以及微生物感染等)與外因(細(xì)胞饑餓、低氧、激素刺激等)共同作用的結(jié)果。在細(xì)胞饑餓、生長因子缺乏和缺氧以及一些病理狀態(tài)下,自噬對維持細(xì)胞的存活有積極的作用,由于過度自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞的程序性死亡,因此又被稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。自噬的過程主要包括4個環(huán)節(jié):(1)底物誘導(dǎo)的自噬前體的形成;(2)自噬體形成;(3)自噬體與溶酶體融合;(4)自噬體內(nèi)容物被降解。酸性自噬泡的產(chǎn)生是自噬的特異性過程。吖啶橙是一種熒光染料,其熒光波長會隨著細(xì)胞內(nèi)pH值的變化而變化。在吖啶橙染色的細(xì)胞中,胞仁和胞漿分別發(fā)亮綠和暗紅色的熒光,而酸性細(xì)胞器發(fā)亮紅色的熒光。紅色熒光的強度與酸性細(xì)胞器的酸度和/或容積成正相關(guān)。因此,可以通過流式細(xì)胞儀利用FL1通道檢測綠色熒光,FL3通道檢測紅色熒光以觀察紅色熒光強度而判斷酸性自噬泡的形成情況,吖啶橙可以作為自噬的特征性標(biāo)記物。鑒于自噬與凋亡的復(fù)雜關(guān)系,本文在前期研究的基礎(chǔ)上,繼續(xù)探討登革病毒對血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響,以人靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株EAhy926細(xì)胞為細(xì)胞模型進(jìn)行研究。實驗證明,登革病毒感染EAhy926后,在12h已出現(xiàn)顯著自噬,且長時間高水平維持,這可能是由于EAhy926是由人肺腺癌細(xì)胞株A549與原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC融合構(gòu)建而成的永生化細(xì)胞株,EAhy926與A549有相似的細(xì)胞增殖能力,其細(xì)胞自噬水平與A549細(xì)胞相似。有報道1-3-芳基-1氫-吡唑-5-碳水化合物的衍生物能夠誘導(dǎo)A549發(fā)生自噬性死亡,而細(xì)胞凋亡及壞死均不明顯,內(nèi)皮抑素可誘導(dǎo)EAhy926發(fā)生高水平的自噬,而只有15%~30%的細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡,與我們的研究結(jié)果基本吻合。感染組各時間點EAhy926的發(fā)生自噬的細(xì)胞百分率較對照組有所升高,其中以48h最明顯,對照組發(fā)生自噬的細(xì)胞百分率為(69±10)%,感染組自噬細(xì)胞百分率為(80±7)%,P<0.05。相應(yīng)地,感染組的EAhy926細(xì)胞酸性自噬泡的平均熒光密度較對照組有所升高,其中48h最明顯,對照組34.4±3.2,感染組為44.5±7.5,P<0.05。這可能是由于登革病毒作用于EAhy926細(xì)胞時,細(xì)胞發(fā)生的自噬可以將胞內(nèi)物質(zhì)降解和循環(huán)利用而使細(xì)胞得以繼續(xù)存活,高水平的自噬在惡劣環(huán)境中對其起到了一定的