內(nèi)皮祖細胞移植治療糖尿病兔下肢缺血的實驗研究

內(nèi)皮祖細胞移植治療糖尿病兔下肢缺血的實驗研究

內(nèi)陸祖細胞（epc）是血管內(nèi)皮細胞的前細胞。在胚胎發(fā)育之前，通過克隆和分離，血漿島外的epc發(fā)育并形成最原始的血管結(jié)構(gòu)。這個過程被稱為血管疾病。過去認為,血管發(fā)生僅存在于胚胎時期,近年來越來越多的證據(jù)表明,在成年個體中也有少量的EPC,主要存在于骨髓和外周血中。目前開展的骨髓干細胞移植治療缺血性疾病的研究正是利用骨髓中的EPC形成新生血管的潛能,來促進血管的恢復(fù)與形成。眾所周知,糖尿病患者中,缺血性疾病的發(fā)生率遠遠高于普通人群,然而,該治療手段對于糖尿病患者是否有效尚不清楚。為了探討糖尿病動物骨髓來源的EPC治療缺血性疾病是否有效進行了本項研究。1對象和方法1.1實驗動物、體重、體重、血糖2006年1月至9月哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科選取健康日本大耳白兔30只(購于哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部),體重2～2.5kg,血糖≤7mmol/L。隨機分為3組,其中糖尿病磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組8只(A組)、糖尿病EPC移植治療組14只(包括Brdu標記6只,B組)、正常血糖EPC移植治療組8只(C組)。1.2體重劑量設(shè)計及血糖檢測日本大耳白兔禁食24～48h后,臨時配制的3%四氧嘧啶(Sigma公司),按80mg/kg體重劑量由耳緣靜脈緩慢注射,30s內(nèi)注射完畢。72h后,血糖儀(羅康全,德國)檢測血糖,血糖≥16mmol/L建模成功。以后每周測定血糖1次,當血糖<16mmol/L時按原劑量追加3%四氧嘧啶,直至血糖≥16mmol/L。本研究建模成功率為100%。1.3右后期皮膚注射采用股動脈切除術(shù),對3組日本大耳白兔建立后肢缺血模型。日本大耳白兔經(jīng)1%戊巴比妥鈉(30mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉后,固定于手術(shù)臺上。備皮、消毒后肢,無菌條件下,右后肢自腹股溝韌帶至膝關(guān)節(jié)做一垂直縱行切口,沿股動脈走行長軸切開皮膚,鈍性撥離出股動脈全程,用絲線結(jié)扎髂外動脈遠端、股動脈遠端及股動脈分支,然后切除股動脈。術(shù)后以胰島素注射器(美國BD公司)在對照組右后肢局部注射20μLPBS;移植組右后肢局部注射含有2×106個EPC的20μLPBS。缺血局部共注射6個點,最后逐層關(guān)閉切口,縫合皮膚。術(shù)后嚴密觀察,每天注射青霉素(8萬U/只),連續(xù)注射3d,預(yù)防傷口感染。1.4細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染參見文獻、。所取動物麻醉后,暴露左側(cè)脛骨,以含有肝素鹽水的注射器抽取脛骨骨髓5mL,加入到淋巴細胞分離液中,2000r/min,離心20min,分離單個核細胞后,轉(zhuǎn)入含PBS的10mL無菌離心管中,5倍體積的PBS洗滌3次,以每平方厘米接種5×106個EPC接種于培養(yǎng)瓶原代培養(yǎng)。使用M199誘導(dǎo)培養(yǎng)液[M199基本培養(yǎng)液,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)10ng·mL-1,堿性成纖維細胞生長因子b(FGF)2ng·mL-1],于37℃5%二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4d后首次換液,去除懸浮細胞。以后每3d換液1次。1.5荊豆凝集素fic-uea-i,acldl-dii,世界面為10gml的細胞系統(tǒng)細胞與Dii標記的乙?；兔芏戎鞍?acLDL-Dii,10μg·mL-1)37℃孵育24h后,加2%多聚甲醛固定細胞10min,用PBS浸洗,加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的荊豆凝集素(FITC-UEA-I,10μg·mL-1),37℃下孵育2h,多波長激光共聚焦顯微鏡下觀察,FITC-UEA-I和acLDL-Dii雙染色陽性細胞為正在分化的EPC。1.6細胞培養(yǎng)brdu在培養(yǎng)液中加入5-溴2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo2-deoxyuridine,Brdu,Sigma公司),濃度為30mmol/L,于細胞培養(yǎng)第7天換用加入Brdu培養(yǎng)液,培養(yǎng)48h后,細胞移植。取B組6只動物接受標記細胞的移植。1.7石蠟切片的制作B組接受Brdu標記細胞的動物,于術(shù)后第3,7,14天,收集接受Brdu標記細胞移植的肌肉組織,制成石蠟切片。通過抗Brdu單克隆抗體(Sigma公司)免疫組化染色,監(jiān)測置入兔缺血后肢的EPC在體內(nèi)情況。1.8手術(shù)第14天測量以下指標1.8.1免疫組化染色動物肌肉制成橫切面石蠟切片后,抗Ⅷ因子相關(guān)抗原(1∶150,邁新公司)免疫組化染色。在光學顯微鏡下,每張切片隨機取10個不同高倍視野(×400),非肌肉橫切面視野排除在外,計數(shù)每個高倍視野內(nèi)毛細血管數(shù)。1.8.2血管計數(shù)和肌束計數(shù)計數(shù)每個高倍視野內(nèi)毛細血管數(shù)與肌束數(shù),并計算比值。1.8.3電子天平勻漿法取肌肉組織,于冰鹽水中漂洗,去除血污,以干紗布浸干水分后,在電子天平上稱濕重。然后將肌肉在勻漿器中剪碎,加入1mLPBS,勻漿離心后收集上清液。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定VEGF質(zhì)量分數(shù),以因子質(zhì)量(ng)/肌肉濕重(g)表示。2結(jié)果2.1大團細胞家系形成單個核細胞經(jīng)96h的體外培養(yǎng)后,有少量細胞貼壁,貼壁細胞呈梭形,棄去懸浮細胞,經(jīng)PBS浸洗后,加入培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),梭形的貼壁細胞擴增逐漸形成細胞團集落,培養(yǎng)7d可見大團細胞集落形成。糖尿病動物的單個核細胞在體外培養(yǎng)96h后,貼壁細胞相對較少,但形態(tài)各組間差異無顯著性意義。2.2梭形貼壁細胞團的表征骨髓來源的單個核細胞,經(jīng)體外培養(yǎng)7d后,形成的梭形貼壁細胞團,經(jīng)FITC-UEA-I和acLDL-Dii雙染色,在多波長激光共聚焦顯微鏡下觀察,均表達陽性,分別呈現(xiàn)綠色和紅色熒光。2.3骨髓epc的監(jiān)測術(shù)后第3,7,14天收集的組織切片上,均可見Brdu陽性的細胞存在,位于血管附近,但未見其形成毛細血管。2.4血管密度b組計數(shù)Ⅷ因子染色陽性的毛細血管數(shù),A、B、C3組平均每個視野毛細血管數(shù)分別為(9.29±1.63),(12.60±2.16),(12.51±1.56)個。B組毛細血管密度顯著增多,與A組比較,差異有顯著性意義,P<0.05;與C組比較差異無顯著性意義。見表1。2.5大鼠毛細管密度b組計算高倍鏡視野下血管數(shù)和肌束數(shù)的比值,A、B、C3組的值分別為0.66±0.05,0.83±0.11,0.90±0.13,其與毛細血管密度結(jié)果相符,B組比值明顯高于A組,P<0.05,與C組比較差異無顯著性意義(見表1)。2.6兩組vegf比較A、B、C3組VEGF的質(zhì)量分數(shù)分別為0.22±0.05,0.30±0.07,0.31±0.08,B組VEGF顯著高于A組,P<0.05,差異有顯著性意義。C組與B組比較差異無顯著性意義(見表1)。3糖尿病大鼠epc治療的作用機制近年來,關(guān)于EPC的研究逐漸成為研究熱點。EPC是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞,它能通過自身的增殖、分化,發(fā)育形成最原始的血管結(jié)構(gòu),這種新生血管不依賴于原先是否存在有血管內(nèi)皮,與傳統(tǒng)的成年后血管形成方式,即通過血管內(nèi)皮細胞出芽、分裂、增殖形成毛細血管網(wǎng)完全不同。成年個體中的EPC主要存在于骨髓和外周血中,并在某些因子的作用下動員到缺血區(qū)域,參與血管新生。由于EPC增殖分化能力明顯高于內(nèi)皮細胞,所以由EPC形成血管的規(guī)模和循環(huán)重建的程度明顯增大。正因如此,EPC移植為缺血性疾病的治療提供了希望。糖尿病患者中,缺血性疾病的發(fā)生率遠遠高于普通人群。然而,糖尿病對EPC及移植后治療效果的影響還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),來源于糖尿病動物骨髓的EPC受到高血糖的影響,增殖能力明顯低于血糖正常的個體。然而,糖尿病動物的EPC經(jīng)體外擴增,達到一定數(shù)量后(2×106)進行自體移植,治療下肢缺血的效果與非糖尿病動物相同。說明高血糖本身可以影響EPC的數(shù)量和增殖功能,但是在高血糖的環(huán)境中,EPC仍然可以分化為血管內(nèi)皮細胞,促進血管形成,從而起到改善供血的作用。病理切片結(jié)果顯示,在EPC移植治療的下肢缺血的糖尿病動物肌肉中,毛細血管密度與血管數(shù)/肌束數(shù)顯著高于對照組(P<0.05),說明移植后的EPC促進了毛細血管的形成,其機制可能是其在移植部位部分分化為血管內(nèi)皮細胞,同時,也可能與其表達血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2),促進了VEGF的趨化,使周圍原有的血管內(nèi)皮增殖有關(guān)。Brdu標記細胞結(jié)果顯示,移植后的EPC存活于血管周圍,甚至可見可疑的EPC形成毛細血管,進一步證實了EPC促進血管形成的作用。VEGF是血管內(nèi)皮細胞特異性的有絲分裂原,具有強大的促進血管生成和通透作用。同時,VEGF也是一種免疫調(diào)節(jié)因子。已有研究表明,VEGF影響多種血細胞系的分化、發(fā)育和增殖。目前,已知EPC表面有VEGFR2存在,說明其功能受到VEGF的調(diào)控。本研究顯示,治療組無論有無糖尿病,肌漿中VEGF的含量均顯著增高(P<0.05),從側(cè)面說明了EPC的治療作用。其機