5種結(jié)核桿菌耐藥基因突變的研究

5種結(jié)核桿菌耐藥基因突變的研究

本研究通過pcr-scp技術(shù)建立了一種檢測m.t5類藥物遺傳因素的方法，分析了134例臨床抗生素植物的突變，并對m.t類藥物突變與m.t類藥物的內(nèi)在聯(lián)系進行了探討。pcr擴增聚合酶鏈反應(yīng)分子檢測標本來源:M.tb標準株(H37RV)由中國藥品生物制品檢定所提供,134例臨床耐藥株源于我院住院患者痰標本。試劑:M.tb耐藥基因檢測試劑由本院結(jié)核病分子生物學(xué)實驗室提供。7H10培養(yǎng)基由美國BD公司提供。方法:患者痰標本一部分經(jīng)Bacter-960培養(yǎng)后提取DNA,至-20℃保存?zhèn)溆?。另一部分進行7H9培養(yǎng)基梯度藥敏試驗。吡嗪酰胺(PZA)、鏈霉素(SM)、利福平(RFP)、異煙肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)在培養(yǎng)基內(nèi)藥物含量的高濃度分別依次為250、4.0、400、2.0、50mg/L(高耐藥性)。低濃度含量分別依次為50、0.4、40、0.2、5mg/L(低耐藥性)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增:利用我院自行研制的rDNAPCR擴增試劑,在25μl反應(yīng)體系中,4×dNTP的終濃度各為0.2μmol/L,引物Ⅰ、Ⅱ的終濃度各為0.3μmol/L,純化的DNA模板5~25ng,TaqDNA聚合酶1U。在DNA熱循環(huán)儀內(nèi),按94℃變性50s→58℃退火1min→72℃延伸1min。擴增35個循環(huán),最后72℃延伸7min。取3μl擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測擴增產(chǎn)物。5個反應(yīng)體系可分別擴增分枝桿菌耐SM基因(rpsL)產(chǎn)生267bp片段;耐RFP基因(rpoB)產(chǎn)生232bp片段;耐INH基因(katG)產(chǎn)生273bp片段;耐EMB基因(embB)產(chǎn)生365bp片段;耐PZA基因P1和P2可擴增該基因32~313位堿基產(chǎn)生282bp片段(pncA上游),耐PZA基因P1和P2可擴增該基因265~512位堿基產(chǎn)生248bp片段(pncA下游)。SSCP分析:將臨床分離株與M.tb標準株的DNAPCR擴增產(chǎn)物加在同一8%(29∶1)非變性聚丙烯酰胺凝膠中,于4℃100~120V電泳6h,銀染色后觀察結(jié)果并照相。結(jié)果判定:雙鏈PCR產(chǎn)物經(jīng)熱變性后形成2條單鏈,經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后呈現(xiàn)2條單鏈帶。若所呈現(xiàn)的單鏈位置與野生型不同,稱為泳動變位,即可判定存在基因突變。結(jié)果1.樣品的耐藥情況134例臨床標本中,耐SM106株,耐藥率79.1%;其中高濃度耐株78株,低耐株有28株。耐INH86株,耐藥率64.1%;其中高耐INH有70株,低耐INH有16株。耐EMB66株,耐藥率49.3%;其中高耐有41株,低耐有24株。134例中耐RFP109株,耐藥率81.3%;其中高濃度耐RFP有76株,低耐RFP有33株。耐PZA96株,耐藥率71.6%;其中高耐株50株,低耐株有36株(見表1)。2.dna擴增產(chǎn)物在134例M.tb耐SM、RFP、INH、EMB、PZA株中,rpsL基因擴增均產(chǎn)生267bp片段;rpoB基因擴增均產(chǎn)生232bp片段,katG基因擴增均產(chǎn)生273bp片段,embB基因擴增均產(chǎn)生356bp片段,耐PZA(pncA上游)基因產(chǎn)生282bp片段,耐PZA(pncA下游)基因產(chǎn)生248bp片段。以M.tb標準株DNA擴增產(chǎn)物為對照,106例耐SM分離株中,高耐株中有68株SSCP分析出現(xiàn)泳動變位的rpsL基因突變,低耐株中8株SSCP出現(xiàn)泳動變位,SM總突變率為72%(76/106)。109例耐RFP分離株中,高耐株有71株SSCP分析出現(xiàn)泳動變位,低耐株中有15株SSCP出現(xiàn)泳動變位的rpoB基因突變,耐RFP總突變率為78%(86/109)。66例耐EMB分離株中,高耐株有18株SSCP分析出現(xiàn)泳動變位,突變率為44%,24例低耐EMB分離株未發(fā)生突變,耐EMB總突變率為43.9%。86例耐INH分離株中,高耐株有56例SSCP分析出現(xiàn)泳動變位,低耐株有3株出現(xiàn)泳動變位的katG基因突變,耐INH總突變率為69%(59/86)。96例耐PZA分離株中,高耐株有35例SSCP分析出現(xiàn)泳動變位,低耐株有6株出現(xiàn)泳動變位,耐PZA總突變率為42.7%(見表2)。菌株突變可能引起本試驗的耐藥機制M.tb菌耐SM(rpsL)、RFP(rpoB)、INH(katG)、PZA(pncA)、EMB(embB)基因突變的機理因抗生素不同而異:SM主要作用于M.tb的核糖體,誘導(dǎo)遺傳密碼的錯讀,抑制mRNA轉(zhuǎn)譯的開始,干擾轉(zhuǎn)譯過程中的校對,從而抑制蛋白質(zhì)合成。最近研究認為某些菌株耐SM是由于其核糖體蛋白S12編碼基因rpsL或16SrRNA,編碼基因rrs突變所致,雖然rrs突變也會導(dǎo)致部分M.tb耐SM,但rpsL突變是SM耐藥的主要分子機制。傳統(tǒng)藥物梯度敏感試驗證實,耐SM基因突變株絕大多數(shù)發(fā)生在高耐藥菌株,占87.2%,有8例在低耐區(qū)發(fā)生突變,占28.5%,可能因PCR-SSCP實驗敏感,低耐區(qū)開始出現(xiàn)少量高耐藥菌株的基因突變而被檢測出來,或M.tb菌易引起SM較大范圍的基因突變。M.tb耐RFP的機制理論上有兩種可能:一是藥物作用靶分子RNA聚合酶β亞單位的突變。二是細胞壁滲透性改變導(dǎo)致藥物攝入減少。在試驗109例耐藥臨床標本中有5例高耐株和18例低耐株未突變,可能是屬于第二種情況,或存在其它耐藥機制。高耐藥株突變占總突變數(shù)的93.4%,低耐藥株占45.4%,是5種基因突變率最高的一種,其原因待今后研究。INH是酰肼類化學(xué)合成藥物,M.tb對其高度敏感,但是也易產(chǎn)生耐藥。最近研究表明,M.tb耐INH可能與過氧化物酶編碼基因katG和烯?；€原酶編碼基因inhA或烷基過氧化氫酶編碼基因ahpc改變有關(guān),50%~70%的M.tb耐INH分離株有katG突變,與本研究69%相同(見表2)。其中,高耐藥株占總突變的80%,僅有3株在低耐藥株突變。1992年,Zhang等首次從基因水平上對M.tb的INH耐藥性進行研究,發(fā)現(xiàn)在3株MIC>50μg/ml的高濃度耐藥株中,有2株完全缺失katG基因,認為M.tb中katG基因的完全缺失導(dǎo)致了過氧化物酶不被表達,從而引起M.tb耐藥性。而8株高耐藥株的katG基因突變,更證實與INH耐藥性有關(guān)。PZA是一種煙酰胺類似藥物,在酸性條件(pH5.0~5.5)下,具有抗結(jié)核作用。近年來研究表明,M.tb耐PZA是由于吡嗪酰胺酶編碼基因(pncA)突變,使吡嗪酰胺酶活性喪失或降低所致。在試驗中,96例耐藥臨床標本有35例高耐株和6例低耐株發(fā)生基因突變,其pncA上游和pncA下游基因總突變率為42.7%,說明PZA基因突變率雖然不高,但基因突變范圍廣。據(jù)報道,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)pncA上游和pncA下游基因上廣泛分布有20多個突變位點,實驗與報道相吻合。EMB是1961年發(fā)現(xiàn)的一種抗M.tb活性的阿拉伯糖類合成藥物,作用于靶分子阿拉伯糖轉(zhuǎn)移酶,影響細胞壁分支菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖復(fù)合物的形成。最近研究表明,M.tb耐EMB與阿拉伯糖轉(zhuǎn)移酶的編碼基因embABC操縱子突變或emb蛋白過度表達有關(guān),該操縱子由embA、embB、embC3個基因組成,其中,embB基因(尤其是306位密碼子)突變是EMB耐藥的主要原因。本研究耐EMB總突變率為43.9%,低耐EMB分離株未發(fā)生突變,比Sreevatsan報道的突變率低,可能是由于embB還存在其它部位突變或有其它耐藥基因突變所致,或存在其它耐藥機制。綜上所述,RFP總突變率最高,而且是在高耐株突變率高,SM總突變率其次,EMB、IN