耐利福平結(jié)核分枝桿菌rpob基因的序列分析

耐利福平結(jié)核分枝桿菌rpob基因的序列分析

隨著抗結(jié)果藥物的引入，核電站的治療取得了很大進(jìn)展。然而,由于不合理的聯(lián)合用藥、藥物供應(yīng)不足以及不規(guī)則用藥等,致使結(jié)核分枝桿菌不能及時(shí)被殺滅從而產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致病程延長(zhǎng),死亡的危險(xiǎn)性增加。利福平自20世紀(jì)70年代起開始用于臨床。由于其對(duì)結(jié)核病有較好療效使其很快成為結(jié)核病短程化療的主要藥物。因而,當(dāng)結(jié)核菌株對(duì)其產(chǎn)生耐藥時(shí)則嚴(yán)重影響其療效,較易出現(xiàn)耐多藥結(jié)核病。有作者報(bào)告約有90%的耐利福平結(jié)核分枝桿菌菌株同時(shí)也對(duì)異煙肼耐藥。因而,單獨(dú)進(jìn)行利福平敏感性分析也可能作為耐多藥的篩選指標(biāo)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐利福平的分子機(jī)制的研究表明,結(jié)核分枝桿菌耐利福平是由于利福平靶分子RNA多聚酶B亞單位的編碼基因(rpoB)突變所致,且突變集中于rpoB基因81個(gè)堿基的核心區(qū)域內(nèi),以531位基因突變率較高。然而有關(guān)耐藥基因突變與耐藥程度有否關(guān)聯(lián),國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道不一。本文通過對(duì)不同耐藥程度的耐利福平菌株的rpoB基因序列進(jìn)行分析以探討對(duì)利福平耐藥基因的突變位置與對(duì)利福平耐藥程度的關(guān)系。1材料和方法1.1細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)和藥敏試驗(yàn)所有菌株均來(lái)自2002-10~2003-02在我院住院治療的肺結(jié)核病人痰液中分離結(jié)核分枝桿菌株。我們對(duì)其中54株耐利福平的結(jié)核分枝桿菌株,10株對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素敏感的結(jié)核分枝桿菌株(R0)和1株H37Rv結(jié)核分枝桿菌株包括核心區(qū)域在內(nèi)的rpoB基因片段進(jìn)行了DNA序列分析。54株耐利福平的結(jié)核分枝桿菌株中,32株對(duì)250μg·mL-1的利福平耐藥(R250),22株對(duì)50μg·mL-1的利福平耐藥(R50)。細(xì)菌培養(yǎng)、分離、鑒定和藥敏試驗(yàn)均采用改良羅氏法,并按結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。細(xì)菌在含高于50μg·mL-1利福平的培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)判定為耐藥,高于250μg·mL-1利福平的培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)判定為高耐藥。H37Rv結(jié)核分枝桿菌株由衛(wèi)生部結(jié)核病控制中心參比實(shí)驗(yàn)室提供。1.2提取的dna挑取菌落,在ddH2O中研磨成混懸液,應(yīng)用AculPURE(DNA/RNA)方法制備DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?.3pcr擴(kuò)增dna引物由大連寶生物公司合成。上游引物(rpoB1):5’AGGCGATCACACCGCAGACGT3’;下游引物(rpoB2):5’ACGTGAGCGTGCCGGGCTGGA3’。擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度為184bp。華美公司IS986PCR檢測(cè)系統(tǒng)。1.4序列分析應(yīng)用VGI公司自動(dòng)測(cè)序儀。采用大連寶生物公司生產(chǎn)的測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序,6%聚丙烯酰胺凝膠電泳,并自動(dòng)識(shí)讀結(jié)果。1.5統(tǒng)計(jì)方法所有計(jì)數(shù)資料均采用χ2檢驗(yàn),由SAS軟件包完成。2使用n50的突變基因位置10株(R0)對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素敏感的結(jié)核分枝桿菌株和1株H37Rv結(jié)核分枝桿菌株未檢測(cè)到rpoB基因易突變區(qū)的改變。54株耐利福平的結(jié)核分枝桿菌株中46株(85.2%)(95%CI75.7%~94.7%)存在rpoB基因易突變區(qū)的改變。其中R50耐利福平的結(jié)核分枝桿菌株基因突變有25株(78.1%),R250耐利福平的結(jié)核分枝桿菌株突變有21株(95.5%)(χ2=1.881,P=0.170)。R50的突變基因位置以533密碼子較多,其突變頻率為25.0%(95%CI13.7%~50.3%),依次為531及526密碼子均為16.0%(95%CI1.6%~30.4%);但其之間差異無(wú)顯著性(χ2=1.754,P=0.185)。R250的突變基因位置以531密碼子為主,其突變頻率為57.1%(95%CI35.9%~78.3%),依次為511密碼子,為14.3%(95%CI0%~19.2%)(χ2=1.881,P=0.170);與R50相比差異有顯著性(χ2=8.517,P=0.005)。R50耐利福平的結(jié)核分枝桿菌株的基因突變均以單一位置突變。而在R250耐利福平的結(jié)核分枝桿菌株的基因突變中有5株(23.8%)(95%CI5.6~42.0%)發(fā)生多個(gè)密碼子聯(lián)合突變(χ2=4.447,P=0.035);其中涉及511位的亮氨酸有4株(4/5)。3限制利福平高耐藥燒結(jié)分枝桿菌的rpab基因突變自1993年美國(guó)學(xué)者Telenti等首次對(duì)rpoB基因核心區(qū)域進(jìn)行DNA序列分析,繼之多個(gè)國(guó)家報(bào)道了本國(guó)的耐利福平結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因突變特點(diǎn)。在2001年黃海榮等報(bào)道了中國(guó)的耐利福平結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因中90%發(fā)生突變。本研究對(duì)65株結(jié)核分枝桿菌菌株rpoB基因易突變區(qū)(包括184bp基因片段)進(jìn)行了DNA序列分析。10株(R0)對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素敏感的結(jié)核分枝桿菌株和1株H37Rv結(jié)核分枝桿菌株未檢測(cè)到rpoB基因易突變區(qū)的改變。54株對(duì)耐利福平低耐藥(R50)及對(duì)耐利福平高耐藥(R250)結(jié)核分枝桿菌菌株中,46株(85.2%)存在rpoB基因核心區(qū)域的點(diǎn)突變,與國(guó)內(nèi)報(bào)道相似。其基因突變頻率與耐藥程度無(wú)關(guān)。其中R50為78.1%,R250為95.5%;兩者差異無(wú)顯著性(P=0.170)。531位氨基酸突變是我國(guó)結(jié)核分枝桿菌與耐利福平有關(guān)的突變中最常見類型,也是對(duì)利福平高耐藥結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因主要突變點(diǎn)。在本研究21株rpoB基因有突變的對(duì)利福平高耐藥結(jié)核分枝桿菌中,以含有531位密碼子突變?yōu)橹?57.1%),而其它位置突變的發(fā)生頻率呈散在分布。在25株rpoB基因有突變的對(duì)利福平低耐藥結(jié)核分枝桿菌中,只有4株(12.5%)含有531位密碼子突變(P=0.005)?？梢?531位氨基酸突變是對(duì)利福平高耐藥結(jié)核分枝桿菌的突變特征,與文獻(xiàn)報(bào)道63.2%相似。染色體突變介導(dǎo)的耐藥性是結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥的主要方式,由于靶基因核苷酸的突變,形成錯(cuò)誤的氨基酸順序,影響了藥物和靶位酶的親合性,形成結(jié)核分枝桿菌對(duì)藥物的敏感性下降或耐受。點(diǎn)突變是細(xì)菌產(chǎn)生耐利福平的主要形式,而對(duì)利福平高耐藥結(jié)核分枝桿菌株較易發(fā)生多個(gè)密碼子聯(lián)合突變,即兩個(gè)或三個(gè)位點(diǎn)同時(shí)存在突變。在聯(lián)合突變中大多數(shù)伴有511位的亮氨酸。在本研究中,耐利福平的低耐藥(R50)結(jié)核分枝桿菌無(wú)發(fā)生聯(lián)合突變,而耐利福平的高耐藥(R250)結(jié)核分枝桿菌有5例發(fā)生聯(lián)合突變(P=0.035)。在發(fā)生聯(lián)合突變中,大部分并有511位密碼子突變。因此,耐利福平的高耐藥(R250)結(jié)核分枝桿菌菌株較易發(fā)生多個(gè)密碼子聯(lián)合突變。這可能也是對(duì)利福平高耐藥結(jié)核分枝桿菌的突變特征,與文獻(xiàn)報(bào)道12.4%相似。Ramaswamy等總結(jié)了1993~1998年之間的文獻(xiàn)報(bào)道,發(fā)現(xiàn)96%的無(wú)流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的耐利福平臨床株在rpoB基因81個(gè)堿基的核心區(qū)域——利福平耐藥決定區(qū)有突變,包括點(diǎn)突變或短的插入、缺失突變共35種。其中43%的菌株發(fā)生了531-Ser的錯(cuò)義突變?？梢?對(duì)利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因突變點(diǎn)除531位氨基酸突變外,其它的突變點(diǎn)呈散在分布。本研究的25株基因突變的耐利福平低耐藥(R50)結(jié)核分枝桿菌中,其突變