高效液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用在食品中的微量元素形態(tài)分析

高效液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用在食品中的微量元素形態(tài)分析

近年來，食品安全和功能食品已成為全球范圍內(nèi)的研究熱點。食品安全不僅僅指通常意義上的農(nóng)藥殘留等食品污染問題,還存在著微量元素的有害濃度閾值和有害元素形態(tài)對人體健康的危害。食品中微量元素安全問題存在的重要現(xiàn)象是:一方面一旦有毒微量元素通過各種途徑進入食物鏈中,食品中的有害元素總量及其不同形態(tài)就有可能導(dǎo)致嚴重的食品安全問題;另一方面人體不能攝取或吸收足夠量的必需或有益的微量元素而導(dǎo)致微營養(yǎng)失調(diào),出現(xiàn)一些新陳代謝和病理、生理紊亂?？梢酝ㄟ^在日常食品中添加一定量微量元素和提高微營養(yǎng)的生物有效性來達到增強體質(zhì)或預(yù)防某些疾病的目的,發(fā)展含有某種微量元素的功能食品近年來得到越來越多的關(guān)注和研究。因此食品中的微量元素形態(tài)分析及其生物有效性研究對食品安全控制與營養(yǎng)評價和維持人體的健康有至關(guān)重要的意義,已是目前國際上分析化學(xué)領(lǐng)域的一個重要研究熱點之一。依據(jù)國際純粹化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)定義:元素的形態(tài)是某種無機元素各種形態(tài)(原子或分子形態(tài))變化過程的證據(jù);形態(tài)分析是樣品中元素的一個或多個化學(xué)形態(tài)的定性和定量分析活動。元素的形態(tài)主要有兩類:非金屬有機化合物和金屬配位絡(luò)合物。Szpunar等在有關(guān)生物無機元素形態(tài)分析的綜述文章中將生物物質(zhì)中的金屬(非金屬)形態(tài)分為6類:(1)具有“真”金屬(非金屬)碳鍵的生物合成分子;(2)與生物合成大環(huán)螯合劑的絡(luò)合物;(3)核堿、寡及多核苷酸和核苷的絡(luò)合物;(4)與氨基酸、寡肽及多肽(蛋白)的絡(luò)合物;(5)與其它生物大分子(多糖、糖蛋白)的絡(luò)合物;(6)金屬藥物。1重金屬離子和微量元素的生物活性和毒性微量元素與人體的健康密切相關(guān)。存在于生物體中的元素可以分為4類:(1)必需元素,按其在體內(nèi)的含量不同,又分為常量元素和微量元素;(2)可能有益或輔助元素;(3)沾染元素;(4)有毒元素。目前,比較明確的人體必需的微量元素有14種,它們是:鐵、鋅、銅、錳、鉻、鉬、鈷、硒、釩、鎳、錫、氟、碘和鍶。食品中含有多種必需微量元素,例如硒可以通過日常食物如蔬菜、谷物和海產(chǎn)品中攝取得到,蘑菇、咖喱和堅果等也是富含硒元素的食品。這些金屬離子和微量元素等生物無機化學(xué)成分通過食物鏈進入人體,不僅是生物體的重要組分,參與酶和蛋白質(zhì)的合成、構(gòu)象、分泌、轉(zhuǎn)運、磷酸化和細胞調(diào)節(jié),而且在基因的轉(zhuǎn)錄、表達、調(diào)控和分子識別中亦具有重要意義,在生命科學(xué)中占有十分重要的地位。它們的過量或不足,都會影響人體的發(fā)育、衰老、疾病甚至死亡。隨著工業(yè)的快速發(fā)展,工業(yè)廢水、固體廢棄物的排放量和化肥等化學(xué)合成品的使用量不斷增加,食品中的砷、汞、鉛、鉻、鎘、鈦、鎳(鎳具有兩重性,既是必需微量元素,也是有害微量元素)等污染元素含量越來越高。這些有害金屬具有致畸和致癌等毒害作用,例如三價砷和五價砷在遺傳上有致基因突變的作用,砷和皮膚癌、肺癌和癌前期的表皮角化癥等疾病相關(guān)。因此食品中的污染元素對人類健康的影響受到了廣泛的關(guān)注。與人體健康相關(guān)的這些必需或有害微量元素的生物活性及毒性不僅與該元素的總量、特定的濃度范圍有關(guān),更主要依賴于該元素的賦存形態(tài):同種元素的不同化學(xué)形態(tài),其生物活性和毒性相差甚遠,從而導(dǎo)致不同的環(huán)境毒害、生物效應(yīng)并對人體健康有不同的影響。例如,Cr(Ⅵ)的毒性比Cr(Ⅲ)高100倍,且前者有明顯的致癌作用;砷甜菜堿的毒性小于甲基胂和無機砷;烷基錫的毒性隨烷基鏈增長而減小。元素的化學(xué)形態(tài)決定其在胃腸道的吸收和體內(nèi)運動的方式,形態(tài)分析可用于預(yù)測和解釋元素的代謝過程。所以食品中微量元素的形態(tài)分析顯得尤其重要,僅僅靠檢測微量元素的總含量已無法滿足不斷發(fā)展的生物化學(xué)、毒理學(xué)和營養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域的科學(xué)研究需要,需進一步提供微量元素形態(tài)鑒定和定量資料。2形態(tài)分析的應(yīng)用進展用于形態(tài)分析的方法有很多種,如電分析法、光譜法、質(zhì)譜法、中子/分子活化分析和色譜法等。這些分析方法簡單經(jīng)濟,但選擇性差,干擾因素多。自Hirschfeld首次提出聯(lián)用技術(shù)以來,各種儀器聯(lián)用方法迅速發(fā)展和應(yīng)用,常常是將高選擇性的分離技術(shù)與高靈敏的檢測技術(shù)結(jié)合在一起,與單一的檢測技術(shù)相比,在靈敏度、準確度和分析速度等方面都有很大的改善,在形態(tài)分析中發(fā)揮了重要的作用。食品或其他生物基體中微量元素的形態(tài)分析采用的聯(lián)用技術(shù)主要利用色譜技術(shù)和特殊的檢測器聯(lián)用,如原子吸收光譜(AAS)、原子發(fā)射光譜(AES)、原子熒光光譜(AFS)、等離子體發(fā)射光譜(ICP-AES)、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)和電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)等。這些聯(lián)用方法將色譜技術(shù)用于形態(tài)分析的樣品前處理,使分析靈敏度、準確度和速度都有了實質(zhì)性的改變。Szpunar總結(jié)了各種聯(lián)用方法在生物無機形態(tài)分析中的應(yīng)用。其中在各種原子光譜檢測法中,常用的有ICP-AES和ICP-MS,具有元素特效性、動態(tài)范圍寬、多元素檢測、溶液連續(xù)進樣和易于實現(xiàn)不同元素不同形態(tài)的檢測等優(yōu)點。而ICP-MS的檢出限要比ICP-AES低3個數(shù)量級左右,是元素形態(tài)分析中最常用和最有效的檢測技術(shù)。各種色譜技術(shù)中,氣相色譜(GC)只適用于易揮發(fā)或中等揮發(fā)的有機金屬化合物的分離,而且分離之前的衍生化步驟不僅使分離/分析過程復(fù)雜化,而且增加了待測形態(tài)丟失或玷污的可能性。毛細管電泳(CE)分離效率高,操作條件溫和,但是在分離過程中,樣品中分析物的原始形態(tài)可能由于電解質(zhì)或pH的調(diào)節(jié)而發(fā)生變化,樣品的組成也是影響CE分離的一個重要因素,并且CE與ICP-MS的接口問題遠沒有HPLC成熟。相比之下,液相色譜(HPLC)在形態(tài)分析的應(yīng)用更為廣泛。用于元素形態(tài)分析的HPLC分離技術(shù)有:離子色譜(IC)、排阻色譜(SEC)、離子交換色譜(IEC)、手性色譜(CLC)和反相色譜等(RPLC)。手性色譜(CLC)往往用于手性藥物中對映體的拆分,在生命科學(xué)和藥物化學(xué)的研究中具有十分重要的意義。許多食品或其他生物樣品中微量元素存在的各種化學(xué)形態(tài)是具有手性對映體的化合物,如硒化合物硒代蛋氨酸(SeMet)和硒代乙硫氨基酪酸(SeEt)等。對這些具有手性結(jié)構(gòu)的化學(xué)形態(tài),生物有機體具有很強的對映體選擇性。例如SeMet在人體內(nèi)的攝入與代謝,不同的對映體在人體內(nèi)的生物活性和毒性都不一樣,只有L-形式的SeMet可以被人體利用,而D-型或外消旋型的SeMet卻對人體有害。因此采用手性液相色譜拆分這類微量元素形態(tài)的對映體,是微量元素形態(tài)和生物有效性研究中一個不可缺少的組成部分。目前已有諸多采用手性色譜和其他檢測器聯(lián)用測定硒氨基酸和其他食品樣品中D,L-SeMet,D,L-SeEt以及D,L-(SeCys)2的研究報道,特別是Caruso等及其研究組在該領(lǐng)域做出了較大的貢獻。排阻色譜(SEC)是按照分子量的大小不同分離被分析物的一種分離技術(shù),通常與特殊的原子檢測器聯(lián)用(如ICP-MS、ESI-MS等)用于復(fù)雜基體中微量元素形態(tài)分析的方法。SEC與其他的色譜分離技術(shù)相比,雖然分離的效率較低,但是SEC-ICP-MS的主要優(yōu)點在于它操作簡單,流動相可以調(diào)節(jié)到最適應(yīng)元素形態(tài)的酸度和離子強度,分離物與凝膠之間的干擾小。SEC通常作為測定金屬蛋白或與生物分子結(jié)合金屬形態(tài)分離的第一步,在復(fù)雜基體中微量元素的形態(tài)分析中發(fā)揮了重要的作用,例如Kannamkumarath等成功地將其應(yīng)用于堅果中微量元素形態(tài)的研究中。超高壓液相色譜(UPLC)可以在很寬的線速度、流速和高反壓下進行分離工作,與傳統(tǒng)的HPLC技術(shù)相比提供了更高的分離效率,具有更強的分離能力,目前較多地與飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)應(yīng)用于成分鑒定的研究中。Bendahl等首次報道了采用UPLC和ICP-MS聯(lián)用用于硒混合標準溶液中形態(tài)的測定,結(jié)果顯示:在內(nèi)徑為1.7μm的柱子、108Pa的壓力下、流速為200μl/min、在1.2min內(nèi)成功分離了4種硒標準化合物,與常規(guī)的液相分離技術(shù)相比,大大節(jié)約了分析的時間,而精密度和檢測限沒有變差。作者還在1.0mmid×100mm的柱子上,流速為100μl/min、5min內(nèi)分離了尿液樣品中的硒形態(tài)。UPLC用于生物樣品中元素形態(tài)的分離可以提高分離的效率,然而該分離方法還是一項比較新的技術(shù),許多方面還沒有得到較成熟的發(fā)展,如目前可得到的柱子類型比較少,限制了該技術(shù)在形態(tài)分析領(lǐng)域的應(yīng)用,目前還沒有用于食品樣品中微量元素形態(tài)分離的相關(guān)報道。生物基體中微量元素形態(tài)的復(fù)雜性和多樣性使得二維或多維液相色譜分離技術(shù)得到了較大的關(guān)注。多維色譜能提供更大的峰容量,更適合于復(fù)雜樣品的分析,目前得到廣泛的應(yīng)用。此外還有快速蛋白液相色譜等。HPLC-ICP-MS的應(yīng)用促進了金屬/非金屬形態(tài)測定的快速發(fā)展。該聯(lián)用分析技術(shù)是以各種不同的色譜分離柱完成不同種類樣品分析物的分離,以高靈敏度的ICP-MS擔任信號檢出,具有元素專一性,線性范圍寬和檢測限低等特點,是具有高靈敏度和高選擇性的形態(tài)分析系統(tǒng);而且形態(tài)分析時不需要復(fù)雜的樣品前處理和復(fù)雜的接口,只需HPLC的流速和ICP-MS的進樣速度相匹配,近年來在元素形態(tài)分析中已得到廣泛的應(yīng)用。HPLC-ICP-MS的聯(lián)用及其在元素化學(xué)形態(tài)分析中的應(yīng)用已有許多文獻總結(jié)[4,12,31,32,33,34,35]。然而大多數(shù)痕量元素形態(tài)分析缺乏標準物質(zhì),而HPLC-ICP-MS不能提供化合物的分子結(jié)構(gòu)信息,紅外光譜(IR)一般提供的結(jié)構(gòu)信息有限,只是化合物的種類和一些基團的信息。因此用核磁(NMR)或ESI-MS提供分子和結(jié)構(gòu)信息,來鑒定HPLC-ICP-MS分離檢測過的成分是必要的。與NMR相比,ESI-MS對分析物的純度、用量要求低,軟離子化源與質(zhì)量檢測器連接,可以獲得分析物的質(zhì)荷比(m/z),提供化學(xué)形態(tài)精確的摩爾質(zhì)量,得到分析物的結(jié)構(gòu)信息。ESI-MS/MS是對HPLC-ICP-MS的一個補充技術(shù),是鑒定、表征用HPLC-ICP-MS分析的實際樣品中的未知形態(tài)不可缺少的形態(tài)分析工具。近年來,利用色譜(HPLC、CE、GC)與質(zhì)譜檢測器(ICP-MS、ESI-MS)聯(lián)機技術(shù)對食品中微量元素進行形態(tài)分析及其微量元素形態(tài)在生物體內(nèi)的生物有效性研究,國外已有較多的報道,如美國的JosephCaruso[16,19,20,21,22,23,24,25,38,39,40]、波蘭的Ryszard┐obiński和JoannaSzpunar,以及西班牙的AlfredoSanz-Medel[30,42,43,44,45,46,47]等人。但國內(nèi)在使用色譜(HPLC、CE、GC)與質(zhì)譜檢測器(ICPMS、ESIMS)聯(lián)機技術(shù)上顯得相對較為薄弱,在利用該技術(shù)進行微量元素形態(tài)分析方面還有待深入研究。3hplc-sd-ms在食品中的含量分析中的應(yīng)用3.1有機硒營養(yǎng)產(chǎn)品硒的形態(tài)分析已成為一個熱門的研究方向。許多日常食品都含有硒化合物,如富硒酵母、蒜類植物、蔬菜和含硒營養(yǎng)品等。這些食品中硒的可利用價值由硒的化學(xué)形態(tài)決定,硒的不同化學(xué)形態(tài)對人體的吸收、生物效應(yīng)、毒性及防癌作用不同,例如硒酸鹽(selenate)和亞硒酸鹽(selenite)會導(dǎo)致生物體病變,而硒蛋氨酸(SeMet)是人類攝取硒元素的主要來源。目前已經(jīng)證明的食品中含有的硒化合物有20多種(表1)。研究證明在日常膳食中添加適量的硒可以減少乳腺癌、腸癌、肺癌和前列腺癌的發(fā)病率。硒缺乏會導(dǎo)致免疫功能和甲狀腺機能失調(diào)、心血管病、骨骼和心肌功能紊亂等疾病;但是吸收過量,卻反而有毒。含硒的功能食品不僅要滿足加強細胞抗氧化能力,也要滿足能夠預(yù)防某些癌癥的發(fā)生。提供富硒植物、硒營養(yǎng)物、日常富硒食品中的硒形態(tài)的生物有效性和毒性等相關(guān)信息對發(fā)展含硒的功能食品和維持人體健康是非常重要的。目前用于定性和定量酵母或其他食品中硒的分析方法有很多種,如GC-AED(原子發(fā)射檢測器)、HPLC-ICP-MS、GC-ICP-MS和CZE-ICP-MS等,而HPLC-ICP-MS以其高分離度和高靈敏度,是目前最有效的分析方法。3.1.1硒的提取和分離SeMet是人和動物攝取硒的主要營養(yǎng)來源,而富硒酵母是富含SeMet的主要日常食品之一。酵母中的硒形態(tài)分析從營養(yǎng)和防癌角度,引起了許多研究者的關(guān)注。Clark等研究顯示富硒酵母具有較好的癌癥預(yù)防作用。富硒酵母中的硒形態(tài)大多數(shù)采用聯(lián)用技術(shù)分析測定,由于酵母中的硒形態(tài)一般不具有揮發(fā)性,因此HPLC-ICP-MS是測定酵母中硒形態(tài)的最理想的分析方法。Bird等用熱水和酶水解法分別提取了富硒酵母中的SeMet和其他有機硒化合物,提取液在離子對色譜柱上分離,以三氟醋酸(TFA)為離子對試劑,甲醇-水(2∶98)為流動相,C8柱為固定相,并用一根PEEK管與ICP-MS接口相連。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了20多種含硒化合物,并證實了在兩種提取液中均有無機硒、硒半胱氨酸(SeCys)和硒蛋氨酸(SeMet)。酶提取物的分析證明了酵母中的主要硒形態(tài)為SeMet。Casiot等研究了從富硒酵母中提取硒化合物的多種方法。得到的提取物經(jīng)不同的液相色譜柱分離(排阻、陰離子交換、反相色譜),用ICP-MS測定硒的化學(xué)形態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn)用水和甲醇浸取的回收率僅為10%—20%,得到8種化合物,包括Se(Ⅳ)和SeMet。用果糖酶提取可以釋放20%的硒蛋氨酸,用SDS提取,占30%總量硒的硒蛋白溶解。用蛋白水解酶,硒的回收率可以達到85%,主要成分是硒蛋氨酸。如用四甲基氫氧化銨水解,則樣品全部溶解,但是硒化合物全部降解為SeMet和無機硒。Wróbel等采用離子對反相色譜與紫外檢測器(UV)、ICP-MS聯(lián)用測定了富硒酵母中低分子量區(qū)的硒化合物:硒胱氨酸((SeCys)2)、硒腺苷甲硫氨酸(AdoSeMet)和硒腺苷半胱氨酸(AdoSeHcy),采用ESI-MS進一步證實了它們的結(jié)構(gòu),并研究了AdoSeMet和AdoSeHcy之間的甲基化過程,說明了它們在酶的作用下在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化。McSheehy等利用二維液相色譜(排阻色譜和反相色譜)分離富硒酵母水提取液中的6種硒化合物,并以ICP-MS和ESI-MS為檢測器。分析物經(jīng)過多維色譜純化、分離以除去基體組分,實驗得到6種分子量分別為:197、603、562、584、372和432的硒化合物,其中兩種化合物(197、432)經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜(CID-MS)鑒定為SeMet和AdoSeHcy,還發(fā)現(xiàn)了一種未曾報道過的硫谷胱苷肽與硒結(jié)合的化合物。Mounicou等采用基于排阻色譜-毛細管區(qū)域電泳(CZE)的二維分離方法和排阻-反相-毛細管區(qū)域電泳的三維分離方法,以ICP-MS為檢測器分析硒酵母水提取物中的硒形態(tài)。硒酸(selenate)、亞硒酸(selenite)、硒胱氨酸(SeCys)2、硒蛋氨酸(SeMet)和硒代乙硫氨基酪酸(SeEt)可以達到基線分離。該方法的檢測限是7—18μg/ml。CZE-ICP-MS分析酵母提取物證明了許多硒形態(tài)的存在。蛋白酶水解高分子量和低分子量片斷的化合物后可以很明顯地提高硒形態(tài)的回收率。Médez等用手性液相色譜與ICP-MS聯(lián)用測定含硒酵母中的SeMet的對映結(jié)構(gòu)體,以糖肽替考拉寧為鍵合手性固定相(chirobioticT),2%的甲醇-水為流動相,流速為1ml/min,在8min之內(nèi)成功地分離了DL-SeMet、DL-SeEt。該方法不需要柱前衍生化,具有較好的選擇性和靈敏度,檢測限達到2μg/L。Polatajko等提出了一個系統(tǒng)的測定酵母中的硒形態(tài)的方法(圖1)。采用多種提取方法和分離檢測方法分步提取和檢測酵母中的硒形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SeMet是酵母中硒化合物中的主要形態(tài),然而并不像其他文獻所報道的那樣與蛋白結(jié)合,而是與細胞壁大分子結(jié)合。3.1.2富硒洋蔥中的硒形態(tài)蒜類植物如大蒜,洋蔥等也是富含硒的日常食品。Bird等利用離子交換色譜(流動相5mmol/LNH4Ac+2%甲醇)、離子對色譜(流動相甲醇-水(2∶98),0.1%TFA)和衍生化反相色譜(流動相甲醇-水(62∶38))與ICP-MS聯(lián)用研究了大蒜和酵母的兩種提取物(水提取和甲醇-鹽酸提取)中的硒形態(tài),并比較了3種分離方法的優(yōu)缺點。陰離子交換色譜對selenate和selenite具有較好地分離,但不能很好地分離其他硒化合物。柱前衍生反相色譜對末端帶有氨基官能團的化合物具有較好的分離,且相對于陰離子交換色譜來說,分離的效果更好。離子對色譜分離方法得到最佳的分離結(jié)果,而且其色譜條件與ICP-MS的條件兼容。用以上3種分離方法證實了富硒大蒜的提取液中存在硒蛋氨酸、硒-甲基-DL-硒胱氨酸和無機硒,以及幾種未知形態(tài)的硒化合物。富硒酵母中含有SeMet和一種未知形態(tài)的主要化合物。Shah等用反相離子對色譜,體積排阻色譜在線與ICP-MS聯(lián)用分析了富硒洋蔥中的硒形態(tài)。氫氧化鈉提取物經(jīng)SEC-ICP-MS分析顯示硒在高分子量和低分子量區(qū)都存在相應(yīng)的化合物。蛋白酶將與蛋白結(jié)合的硒氨基酸提取出來,經(jīng)RP-IP-HPLC分離,以pH=2.5,0.1%(v/v)七氟丁酸、5%甲醇為流動相。與標準樣品對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在的硒形態(tài)有:(SeCys)2、SeMet、甲基硒胱氨酸以及無機硒化合物。在無標準樣品的情況下用ESI-ITMS測定未知形態(tài)的硒化合物,證明了洋蔥中γ-谷氨酰-硒-甲基硒胱氨酸的存在。Wróbel等用液相色譜分離與ICP-MS聯(lián)用研究了富硒洋蔥葉子中的硒形態(tài)。所研究的洋蔥在含有無機硒的溶液中培養(yǎng)1個星期,葉子和莖塊經(jīng)干燥、均化,氫氧化鈉提取物經(jīng)SEC-ICP-MS分析顯示處于高分子量區(qū)的硒形態(tài)在葉子中比莖中的要明顯。甲醇-氯仿-水(12∶5∶3)或0.4mol·L-1的高氯酸-乙醇(8∶2)溶液提取低分子量硒化合物,經(jīng)離子對色譜形態(tài)分析,發(fā)現(xiàn)葉子提取物中的主要形態(tài)是硒-甲基硒半胱氨酸(MeSeCys)(約占總量的4%)。研究發(fā)現(xiàn)可以將洋蔥葉子作為攝取MeSeCys的日常食品。Kotrebai等用離子對高效液相色譜與ICP-MS以及ESI-MS在線聯(lián)用分析了富硒大蒜和酵母酶提取物和熱水提取物中的硒形態(tài)。以甲醇-水(1∶99)為流動相,TFA為離子對試劑,實驗結(jié)果顯示這些酵母樣品中的硒的主要形態(tài)為硒蛋氨酸和硒-腺苷-硒半胱氨酸,大蒜中硒的最主要形態(tài)為γ-谷氨酰-硒-甲基硒半胱氨酸和γ-谷氨酰-硒蛋氨酸。HPLC-ICP-MS的檢測限為10—50μg/ml,而HPLC-ESI-MS的最低檢測濃度是HPLC-ICP-MS的100多倍。他們還采用了用離子對反相色譜與ICP-MS聯(lián)用研究了多種富硒樣品的熱水提取物和酶提取物,如火麻仁、洋蔥、大蒜、酵母以及其他植物中的硒形態(tài)。采用以1∶99的甲醇-水為流動相,0.1%的七氟丁酸或0.1%的TFA作為離子對試劑,分離得到20多種硒化合物,一些具有較高濃度的化合物采用HPLC-ESI-MS鑒定。酵母中主要硒形態(tài)為硒蛋氨酸,而火麻仁、大蒜、洋蔥中的主要硒形態(tài)為硒-甲基-硒半胱氨酸和其他相關(guān)化合物。此外還有大約25%未知形態(tài)的化合物,該方法的檢測限富硒樣品是2—50μg/ml,對天然硒含量的樣品是2—10μg/ml,HPLC-ESI-MS的檢測限是HPLC-ICP-MS的100多倍。Uden等還采用反相HPLC-ICP-MS和HPLC-ESI-MS測定以上富硒樣品中的硒形態(tài),并比較了3種不同的離子對試劑對實驗測定的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-水(1∶99)為流動相,以0.1%的HFBA為離子對試劑在70min內(nèi)分離得到20多種硒化合物。該實驗同樣采取酶水解和熱水提取法提取樣品中的硒。此外還用反相HPLC-ICP-MS和HPLC-ESI-MS分析了γ-谷氨酰-硒-甲基硒半胱氨酸和硒-甲基-硒半胱氨酸(MeSeCys)的氧化產(chǎn)物(以30%H2O2為氧化劑),主要產(chǎn)物為甲基硒酸。3.1.3充填體中硒的分離和鑒定Sanz-Medel等比較了3種不同的提取液(0.1mol/LHCl,25mmol/L醋酸銨緩沖液和蛋白酶水溶液),分別從兩種含硒植物中(蔥屬植物、蕓苔)提取硒的效率,并且比較了有無超聲輔助對萃取的影響。實驗結(jié)果顯示用鹽酸或緩沖溶液加上超聲輔助從植物中定量提取非蛋白硒氨基酸是理想的方法,提取效率高、時間短,而造成的形態(tài)降解可以忽略不計。萃取液和植物組織分別通過68%硝酸和30%雙氧水微波消解然后用ICP-MS測定總硒的濃度。通過離子對反相色譜和排阻/離子色譜與ICP-MS聯(lián)用分析硒化合物的形態(tài),這兩種分離機理都適合分離萃取得到的硒的形態(tài)測定,主要硒化合物經(jīng)測定為MeSeCys和SeMet,兩種植物的提取液中同樣得到了一些未知的硒的形態(tài)。Kannamkumarath等采用HPLC-ICP-MS測定多種堅果(巴西堅果、胡桃、腰果、美洲山核桃)中脂肪提取物、低分子量區(qū)、蛋白質(zhì)區(qū)的硒形態(tài)。脂肪用氯仿-甲醇(2∶1)提取;低分子量區(qū)的硒化合物用0.4mol/L的高氯酸提取,其中的硒含量占堅果中硒總量的3%—15%;堅果中蛋白用0.1mol/L的NaOH和丙酮提取。巴西堅果經(jīng)SEC-ICP-MS測定顯示12%的硒與蛋白弱結(jié)合在一起,為了得到與蛋白強結(jié)合的形態(tài),堅果的蛋白部分用蛋白酶K水解提取其中的硒化合物,并用IPLC-ICP-MS測定。結(jié)果顯示硒化合物存在于低分子量和蛋白區(qū),在脂肪中沒有硒存在,所有堅果中的主要硒形態(tài)是SeMet(占總量的19%—25%)。Kannamkumarath等還采用排阻色譜分別與UV、ICP-MS檢測器聯(lián)用研究巴西堅果中硒的形態(tài),比較了5種不同提取液的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在0.05mol/L的氫氧化鈉和含1%SDS的Tris-HCl緩沖溶液(0.05mol/L,pH=8)中的溶解作用比0.05mol/L鹽酸、0.05mol/LTris-HCl緩沖溶液和熱水(60℃)都要好。他們還采用了3種不同的排阻色譜分離條件,對硒化合物進行完全的分離。為了進一步得到硒的形態(tài),堅果中的油脂用氯仿-甲醇(2∶1)提取,最后得到的脫脂粉末經(jīng)蛋白酶水解后用CE-ICP-MS測定,證明了堅果中與蛋白質(zhì)結(jié)合的最主要的形態(tài)為SeMet。Huerta等采用陰離子交換柱分離酵母和小麥面粉中的硒化合物,微波消化法后測定總硒濃度,蛋白酶和脂肪酶水解后測定硒的形態(tài)。陰離子交換柱的洗脫物通過在線同位素稀釋ICP-MS測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種基體中主要的硒形態(tài)為SeMet,在小麥面粉中占總硒濃度的59%,在酵母中占總硒濃度的68%。酵母中檢測到Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ),而在面粉中沒有這兩種無機硒。他們還采用HPLC-IDA-ICP-MS(IDA:同位素稀釋分析法)測定了3種可食用蘑菇中的硒形態(tài),從而研究野生蘑菇中硒的自然形態(tài)。蘑菇熱水提取物通過排阻色譜、反相色譜和陰離子交換色譜分離,分別與ICP-MS在線聯(lián)用分析硒的形態(tài)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3種蘑菇的水提取物中,硒的主要形態(tài)為SeMet。同時還發(fā)現(xiàn)多種未知形態(tài)的低分子量的硒化合物。Sanz-Medel等比較了4種不同的提取方式(微波消化、甲醇/水、SDS、酶水解)提取鱈肉中的硒,用反相色譜和排阻色譜分離固-液提取物中的硒化合物,并用柱后同位素稀釋ICP-MS鑒定硒的形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶提取具有最高的回收率,而甲醇/水的回收率僅只有5%。酶提取物的形態(tài)分析顯示硒的最主要形態(tài)為SeMet,而在甲醇/水提取物的形態(tài)分析中沒有該化合物的峰,說明硒主要與蛋白結(jié)合。同時還發(fā)現(xiàn)許多未知形態(tài)的硒化合物。Larsen等用離子交換色譜(陽離子、陰離子交換)與ICP-MS聯(lián)用分離12種標準硒樣品,在陽離子交換分離中,以吡啶甲酸鹽(pH=3)為流動相,陽離子被分離出來。陰離子交換以水楊酸-tris(pH=8.5)為流動相。他們將該方法應(yīng)用于實際樣品酵母和海藻中。酵母的β-葡萄糖苷酶提取物經(jīng)混合蛋白酶提取后發(fā)現(xiàn)酵母中的主要硒形態(tài)是SeMet,此外還有SeOMet和MeSeCys。海藻中的硒形態(tài)采用三氯乙酸提取,HPLC-ESI-MS鑒定了丙酸二甲基硒的存在,色譜圖與標準物質(zhì)比較還發(fā)現(xiàn)SeEt和硒-烯丙基硒代半胱氨酸以較低的濃度存在。Bergmann等采用RP-HPLC-ICP-MS測定了南極磷蝦中硒代蛋氨酸的絕對構(gòu)型,硒代蛋氨酸對映體通過與鄰苯二甲醛(OPA)和N-異丁酰-L-半胱氨酸反應(yīng)生成異吲哚非對映體。研究得到檢測限為4μg/L,磷蝦中的硒代蛋氨酸主要為L-構(gòu)型。3.1.4非官能型化合物B’Hymer和Caruso用HPLC-ICP-MS分析了6批市售富硒營養(yǎng)酵母中的硒形態(tài)與總量。采用甲醇-水-三氟乙酸(10∶89∶1)為流動相,樣品通過微波硝酸消化分析硒總量并與標簽顯示相比較。該實驗中還比較了多種提取和水解方法,其中用2mol/L的鹽酸溶液在95℃下微波加熱2h和蛋白酶在37℃下水解20h兩種提取方法,可以最有效地提取富硒酵母食品中的硒化合物,如硒蛋氨酸、硒縮氨酸和硒蛋白。其他水溶性無機硒化合物可以在任何條件下比較輕易地提取出來。江鳳等編譯報道了10種市售硒營養(yǎng)物中硒的存在形式,總硒濃度通過GFAAS和ICP-MS測定。硒營養(yǎng)物中硒化合物通過陽離子和陰離子交換HPLC-ICP-MS來測定。在調(diào)查的硒營養(yǎng)物中,發(fā)現(xiàn)總硒濃度大體與供應(yīng)商的說明一致。然而這些硒營養(yǎng)物中硒的化學(xué)形式卻差異較大。硒酸鹽是其中4種硒營養(yǎng)物中唯一存在的形式,一種營養(yǎng)物中硒以硒蛋氨酸的形式存在,在其他5種硒營養(yǎng)物中則檢測到selenate、selenite、(SeCys)2、SeMet及幾種未知化合物。用水提取法提取營養(yǎng)物中的硒化合物,提取率大于93%。Gomez-Ariza等研究了HPLC(糖肽替考拉寧手性固定相:chirobioticT)和微波輔助消化氫化物發(fā)生原子熒光光譜和電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用在母乳和配方奶中硒代蛋氨酸的手性形態(tài)。HPLC與微波輔助消化氫化物發(fā)生原子熒光光譜聯(lián)用分析物需要柱前在線處理,樣品需要經(jīng)過嚴格離心和超濾,脫脂和除去蛋白質(zhì)。未經(jīng)衍生化的DL-硒代蛋氨酸可以在10min內(nèi)達到完全的分離,并得到較好的選擇性和靈敏度(L-,D-硒代蛋氨酸的檢測限分別為3.1和3.5ng/ml)。該方法操作簡單、成本低,適用于嬰兒奶粉的日常檢測。HPLC-ICP-MS顯示了很低的檢測限(0.9ng/ml),但是該方法受其體效應(yīng)的影響,穩(wěn)定性不好。這兩種方法分別用于母乳和配方奶中硒代蛋氨酸的測定,發(fā)現(xiàn)L-硒代蛋氨酸是母乳中僅存在的形式,而配方奶中還含有30%的D-硒代蛋氨酸。Sutton等用手性液相色譜分別與UV、ICP-MS聯(lián)用在60min內(nèi)分離了3種未經(jīng)衍生化的硒氨基酸:D,L-SeMet、D,L-SeEt和D,L-(SeCys)2的對映體。采用冠醚為固定相,流動相為0.10mol/L的HClO4溶液,溫度為22℃,研究發(fā)現(xiàn)溫度的變化對實驗的分離效果有較大的影響(波動1℃就會降低分離率)。UV的絕對檢測限是1.725—2.356ng/μl,然而ICP-MS的絕對檢測限比它好40—400倍。將該方法應(yīng)用于10種日常含硒食品中,發(fā)現(xiàn)ICP-MS可以很容易檢測出樣品中的硒形態(tài),而UV由于樣品基體影響以及靈敏度不高而不能理想地用于實際樣品的檢測。作者還采用了陰離子交換色譜分離手性色譜柱未能分離的化合物,硒總量的測定同樣采用傳統(tǒng)的消化和酶消化,并用ICP-MS檢測。他們還采用冠醚HPLC手性色譜柱與ICP-MS聯(lián)用分析了9中硒氨基酸,研究了3種不同的溫度對單個氨基酸對映體拆分以及8種氨基酸混合物分離的影響。研究結(jié)果顯示,在22℃下,除了硒代羊毛硫氨酸其他8種對映體均能得到分離,但是混合物的峰沒有達到分離。該研究方法應(yīng)用于富硒洋蔥、大蒜和酵母中硒化合物的測定,比較了水提取和胃蛋白酶提取兩種提取方法,在兩種提取物中得到了硒氨基酸對映體。Montes-bayon等采用RPLC-ICP-MS分離了硒氨基酸的對映體,以(1-氟-2,4-二硝基苯基)-5-L-纈氨酰胺(Marfey’s試劑)為衍生化試劑。HPLC條件在UV檢測器340nm下優(yōu)化,得到最終檢測條件(50%甲醇、pH=5.3),在26min內(nèi)使SeMet非對映體達到完全分離,ICP-MS的檢測限是11ppb。該方法應(yīng)用于實際樣品如富硒酵母、營養(yǎng)片和藥物制劑中D-,L-對映體的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在酵母和營養(yǎng)片中僅存在L-構(gòu)型的SeMet,而在藥物制劑中含有兩種構(gòu)型。3.2無機砷與亞砷酸鹽砷是普遍存在的元素,在地殼中含量排20位,通常以無機化合物的組成成分存在于環(huán)境中。環(huán)境和生物體中含有多種砷的化學(xué)形態(tài),砷的毒性、環(huán)境活性以及在生物體中的積累與其化學(xué)形態(tài)有關(guān)。研究證明,無機砷:砷酸鹽(AsⅤ)和亞砷酸鹽(AsⅢ)的毒性大于單甲基胂酸(MMA)和雙甲基胂酸(DMMA),而砷甜菜堿(AsB)和砷膽堿(AsC)通常被認為是無毒的。僅僅測定砷的總濃度已經(jīng)不能滿足臨床化學(xué)和環(huán)境的需要。不斷發(fā)展的分析技術(shù)使我們更進一步了解砷的形態(tài)、毒性、代謝和生物活性。3.2.1樣品的分離和凈化雖然海水中的砷含量很低,但是海洋性生物(包括植物和動物)能富集吸收砷,海洋性生物通常是含有較高水平砷的基體。特別是貝殼類、海藻類、鯨類等生物。研究證明,海中魚類、甲殼類和軟體動物中的砷形態(tài)主要是四烷基胂(Me4As+),而海中海藻和雙殼類中的主要砷形態(tài)是氧化三甲基胂(TMAO)?？墒秤煤Ｔ搴推渌．a(chǎn)品是人類日常食品之一,海藻從海水中吸收砷,并轉(zhuǎn)化為有機胂化合物。AsB是海生動物中砷形態(tài)的主要形式。研究顯示,AsB對人體是無害的,然而人體可以將砷糖轉(zhuǎn)化為DMAA,而DMAA對人體具有致癌作用。McSheehy和Szpunar用二維色譜(排阻-陰離子交換)與ICP-MS和ES-MS聯(lián)用檢測10種可食用海藻中的砷形態(tài)。首先將海藻中甲醇-水提取液在SESuperdaxPeptideHR10/30柱上用1%v/v醋酸作淋洗液分離基體,將砷糖分成不同的組分,然后將提純的含砷組分用AESupilcosilSA×1(2500mm×4.6mm×5μm)柱再一次分離,并用4種砷糖標準品驗證結(jié)果。二維色譜分離法的優(yōu)點在于兩種方法的機理不同,可減少出現(xiàn)重疊峰的可能,他們還為此做了補充。利用反相、陰離子交換、陽離子交換色譜和排阻色譜與ICP-MS聯(lián)用分析了海藻甲醇-水(1∶1)提取物中的14種砷形態(tài)。還用三維色譜(排阻-陰離子交換-反相色譜)分離生物樣品中的砷化合物,并用ESMS-MS鑒定它們的形態(tài)。Ackley等用離子交換色譜/離子對色譜-ICP-MS檢測了3種魚肉組織中的砷形態(tài)。分別用水、兩種不同比例的甲醇-水溶液、5%四甲基氫氧化銨溶液提取,發(fā)現(xiàn)甲醇-水(80:20)時,65℃下微波輔助萃取4min,萃取率可達100%,砷的主要形態(tài)是AsB,一種無毒的形態(tài)。Wahlen采用了HPLC-ICP-MC聯(lián)用測定魚肉(巨頭鯨肉、金槍魚肉、牡蠣肉)樣品中的AsB,樣品前處理采用快速溶劑萃取。采用陰離子交換柱等度洗脫,以2.2mmol/LNH4HCO3和2.5mmol/L酒石酸混合溶液為流動相,流速為1ml/min,10min內(nèi)可分離6種不同形態(tài)的砷。儀器檢測限為0.04μg/g,工作曲線范圍為0—700μg/g,相關(guān)系數(shù)可達0.999—1.000。劉桂華等通過HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)探討了紫菜中砷的形態(tài)。樣品經(jīng)純水萃取,再經(jīng)甲醇稀釋,得到的待測物經(jīng)HPLC-ICP-MS分析。該研究比較了兩種不同的HPLC條件(陰離子交換柱和陽離子交換柱),結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰離子交換色譜柱分離出砷的形態(tài)最多,而陽離子交換柱并沒有檢測出AsB、AsC;研究還發(fā)現(xiàn)兩個未知形態(tài)的色譜峰。Chatterjee采用硝酸(2.0ml)和30%的過氧化氫(0.20ml)微波輔助消解,并用陰離子交換柱和陽離子交換柱HPLC-ICP-MS分別測定牡蠣組織中陽離子和陰離子的砷總量和形態(tài)。在450W功率下消化15min,可以得到最佳的效率,砷糖全部轉(zhuǎn)化為DMA,而AsB和AsC全部轉(zhuǎn)化為TMAO。甲醇-水(9∶1)提取物經(jīng)分離先后得到核糖磷酸砷、AsB、DMAA、無機砷、MAA、AsC、TMAO、TMA+,以及一些未知形態(tài)的化合物。Kirby和Maher用微波輔助提取和HPLC-ICP-MS檢測了冰凍干燥的海中動物組織的水溶性砷化合物的形態(tài)。結(jié)果顯示角鯊魚肉中的砷形態(tài)為AsB、TMAO、AsC、TMA+和DMA,而龍蝦肝胰腺組織中砷形態(tài)為AsB、TMAO、AsC、TMA+、DMA、MA、As+5和核糖磷酸砷,還發(fā)現(xiàn)未知的兩種陰離子和一種陽離子砷形態(tài)。Sloth等用50%甲醇-水提取海產(chǎn)品中的砷化合物,用陽離子交換色譜和ICP-MS聯(lián)用,以甲酸嘧啶為流動相,梯度洗脫,分析得到了23種砷形態(tài)。他們還研究了樣品基體對砷化合物液相保留時間的影響,發(fā)現(xiàn)對AsB和二甲基砷醋酸有較大的影響,而對AsC+和TMA+等陽離子沒有影響。該方法的檢測限是0.002—0.005μg/g。這種同時測定多種砷形態(tài)實驗方法可以促進對海產(chǎn)樣品中砷的分布以及砷代謝過程的研究。Hirata等用HPLC(固定相為C18,流動相為5mmol/L丁磺酸、0.3mmol/L己磺酸鈉、2mmol/L丙二酸與0.5%甲醇的混合溶液)與ICP-MS分離測定了8種混合標準砷形態(tài):AsⅢ、MMA、DMA、AsⅤ、AsB、TMAO、AsC和TeMAs,整個分離過程僅需15min。該方法對8種砷形態(tài)的檢測限是0.02—0.10μg/L,相對標準偏差(RSD)為3.1%—7.3%。該方法應(yīng)用于牡蠣、魚和蝦等海產(chǎn)樣品中砷形態(tài)的檢測,采用低壓微波消解提取樣品中的砷形態(tài),微波酸消解用于砷總量的提取,發(fā)現(xiàn)海產(chǎn)品中砷含量范圍在6.6—35.1μg/g。3.2.2凈化條件對砷形態(tài)分離的影響Caruso等用HPLC-ICP-MS分析了凍干蘋果中的砷形態(tài),通過微波消化之后用ICP-MS測定砷總量,并比較了不同溶劑超聲波降解提取,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用α-淀粉酶過夜處理然后用乙腈-水(40∶60)溶液超聲波輔助6h兩個步驟處理可以得到較高的提取率。砷的形態(tài)通過HPLC-ICP-MS測定,結(jié)果顯示3種主要的形態(tài)是:AsⅢ、AsⅤ和DMAA。冰凍蘋果樣品種的砷總量為8.2—80.9μg/kg,無機砷含量為總砷的73%—90%。Heitkemper等利用IC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)調(diào)查了稻谷中砷的常見化學(xué)形態(tài)和總量砷,比較了3種不同的色譜分離條件對砷形態(tài)分離的影響。(1)Waters的色譜柱(WatersIC-PakAnionHR4.6×75mm),以10mmol/L的(NH4)2CO3為流動相,pH=10,AsB、AsC、TMAO和TMA沒有分離出來;(2)Dionex的色譜柱(DionexAS7&AG74.6×150&4.6×50mm),以12.5mmol/L的HNO3為流動相,pH=1.8,AsC和TMAO沒有分離出來,但得到了較好的檢測限,LODs約0.2μg/L;(3)Hamilton的色譜柱(HamiltonPRP-X1004.6×150mm),10mmol/L的NH4H2PO4/NH4NO3為流動相,pH=6.3,在10min之內(nèi)分離得到了AsⅢ,DMA,MMA和AsⅤ,而其他形態(tài)沒有分離出來。他們還研究比較了4種不同從谷物中提取砷的方法即超聲降解溶劑萃取、快速溶劑萃取、α-淀粉酶萃取和TFA萃取,證明在100℃下用2mol/L的三氟乙酸提取6h可以得到較好的結(jié)果,對AsⅢ、AsⅤ、MAA、DMAA的回收率分別為83%、88%、100%和93%。作者將優(yōu)化后的分離條件應(yīng)用于稻谷中砷形態(tài)的測定,在6種樣品中的砷均主要以兩種無機砷和DMA的形態(tài)存在。他們還采用快速溶劑萃取法提取凍干胡蘿卜中的砷形態(tài),并采用陰離子交換色譜與ICP-MS聯(lián)用測定提取物中的砷形態(tài),發(fā)現(xiàn)主要存在AsⅢ、AsⅤ、MMA和一種未知形態(tài)的化合物。3.3排阻色譜和icp-ms分析Szpunar等用排阻色譜和ICP-MS聯(lián)用分析了蘋果和胡蘿卜樣品中金屬與多糖絡(luò)合物的動力學(xué)和熱力學(xué)性質(zhì),采用糖基水解酶提取金屬化合物,得到了較好的檢測效果,檢測出鉛、鈀、鍶、鈰和硼與多糖的結(jié)合物以及鋅、銅、鎂與低分子量非糖化合物的同時洗脫。Sanchez和Szpunar采用SEC-ICPMS聯(lián)用測定牛奶、羊奶、母乳以及不同廠家嬰兒奶粉中碘的形態(tài)。以30mmol/L的Tris緩沖溶液為流動相,發(fā)現(xiàn)除了嬰兒奶粉外,其他樣品中的碘主要以碘化物的形態(tài)存在,而奶粉中的碘主要與大分子化合物結(jié)合在一起。該方法的檢測限為1μg/L。研究還用氨水消化樣品,采用ICP-MS測定各種樣品中的碘總量。Koplík等用排阻色譜與ICP-MS聯(lián)用分析了大豆粉和普通白豆芽中的可溶性磷、硫、硒以及其他8種金屬(錳、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、鉬、鎘)的形態(tài)。樣品通過50ml0.02mol/L的Tris-HCl緩沖溶液提取。制備排阻色譜采用0.02mol/L的Tris-HCl為流動相,分離得到的洗脫物采用AAS、ICP-AES和ICP-MS測定,發(fā)現(xiàn)鈷、鎳、銅、鋅和鉬的主要形態(tài)在低分子區(qū),而鐵的形態(tài)主要與大分子結(jié)合,磷主要以環(huán)己六醇六磷酸的形式存在,處于中等分子量區(qū)域。不同元素總量的測定采用不同的方法,在微波消解后,鈉、鎂、鉀、鈣和鐵由火焰原子吸收光譜測定,磷用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜測定,其他元素采用電感耦合等離子體質(zhì)譜測定。他們還利用排阻色譜和ICP-MS在線聯(lián)用分析了豆類植物(白豆、豌豆、鷹嘴豆、小扁豆和脫脂大豆粉)中銅和鋅的形態(tài)。樣品由0.02mol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.5)提取。銅,鋅的提取率大約分別在60%—90%和60%—80%之間。Nischwitz等用SEC/RPLC-ICP-MS在線分析了豬肝中微量元素的形態(tài):鐵、銅、鋅和錳各種形態(tài)的總量,并用離線HPLC-ESI-MS鑒定了各種形態(tài)的結(jié)構(gòu);還采用ICP-AES測定了提取物和殘留物中的元素總濃度;比較了不同的儲存和前處理方法以及3種不同的提取方法的提取效率和對形態(tài)穩(wěn)定性的影響。實驗證明豬肝冰凍幾個星期對形態(tài)的量沒有明顯影響,Tris緩沖溶液提取可以得到最好的提取效果,酶消化可用于提取不被其他方法提取出來的化合物。銅和鋅的形態(tài)主要存在于細胞液中,鐵主要存在于微粒體部分,而錳存在于細胞液和微粒體部分。Rodríguez-Cea等用離子交換-快速蛋白液相色譜與同位素稀釋電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用分析了鰻(安圭拉島)金屬硫因蛋白中的金屬形態(tài)(Cd、Cu和Zn)。鰻肝臟細胞液中的金屬硫因蛋白先后通過排阻色譜和陰離子交換快速蛋白液相色譜分離,然后馬上進入ICP-MS檢測111Cd/114Cd、63Cu/65Cu和65Zn/67Zn的比率。研究證明這些金屬與一種主要的金屬硫因蛋白結(jié)合,可以使鎘在鰻體內(nèi)積累。Kannamkumarath等采用SEC和UV,ICP-MS在線聯(lián)用研究了巴西堅果中不同分子量片段的營養(yǎng)微量元素和有害微量元素的形態(tài),如Mg、Fe、Co、Mo、Ag、Hg和Pb等,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分的金屬元素存在于高分子量片段。研究還比較了3種不同的提取方式:0.05mol/L的NaOH,0.05mol/LHCl以及60℃的水,發(fā)現(xiàn)NaOH溶液提取一般可以得到理想的提取率,而HCl溶液是提取Mg最理想的方法。他們還用SEC-UV-ICP-MS測定了多種可食用堅果中的Ni、Cu、Zn和Mn的形態(tài)。Ogra等采用HPLC-ICP-MS和ESI-MS/MS同時測定了富硒無臭大蒜和蔥中硒和硫元素的生物形態(tài),水提取物經(jīng)ESI-MS/MS分析硒的形態(tài)是γ-谷氨酰甲基硒代半胱氨酸。在無臭大蒜的提取物中沒有發(fā)現(xiàn)蒜氨酸(一種含硫并導(dǎo)致蒜臭味的化合物),在無臭大蒜和蔥的提取物中至少發(fā)現(xiàn)4種未知形態(tài)的含硫化合物。4開發(fā)功能食品的研究食品中微量元素的形態(tài)分析不能停留在靜態(tài)檢測,而應(yīng)該將該技術(shù)應(yīng)用到如何提高微量元素的生物有效性和開發(fā)功能食品的研究上。微量元素在人體和其他生物體內(nèi)的代謝過程和生物活性的研究與功能食品的開發(fā)具有密切的關(guān)系,前者可以為功能食品的研究開發(fā)提供重要的指導(dǎo)作用和質(zhì)量控制的生物標準,而后者的發(fā)展可以提高食品中微量元素的生物有效性,從而提高食品的營養(yǎng)價值。4.1克氏原螯蝦對砷的代謝特征和代謝過程金屬/非金屬元素在生物體內(nèi)的消化吸收、代謝、排泄等生物系統(tǒng)過程中通常存在多種化學(xué)形式,通過測定元素的化學(xué)形態(tài),對于研究元素在生物體內(nèi)的生物活性或毒性以及代謝過程,對開發(fā)含有某種微量元素的功能食品及提高微量元素在人體內(nèi)的生物有效性具有重要的意義。Cullen等用HPLC-ICP-MS測定人食用3—6天藍蚌后的尿液甲醇-水(1∶1)提取物中的砷形態(tài),探索砷在人體內(nèi)的代謝情況,發(fā)現(xiàn)AsB和DMAA是尿液中最主要的代謝產(chǎn)物,也檢測到多種未知的代謝物。他們研究了藍蚌在煮熟后對砷形態(tài)的影響,發(fā)現(xiàn)煮熟后蚌中砷的形態(tài)沒有明顯的變化,但是砷的總量下降。該研究有助于我們進一步了解砷形態(tài)在人體內(nèi)的代謝過程和指導(dǎo)健康的食用方法。Tanabe等分析了鯨類、鰭足類、海牛類以及海龜肝臟中的砷總量和形態(tài),從而概括具有高營養(yǎng)海中動物體內(nèi)的砷積累情況。結(jié)果顯示海龜?shù)母闻K中砷濃度最高,AsB是所有形態(tài)中主要形態(tài),而海牛類的儒艮中AsB含量較少。DMAA、TMA+、MAA、AsC、arsenite以及一些未知形態(tài)的砷化合物同樣也是少量的組成。但是它們的含量并不一樣。該實驗反映了砷的代謝不同和被捕食者體內(nèi)砷組成的不同。Suzuki等利用HPLC-ICP-MS,以82Se為追蹤同位素,測定老鼠身體組織液中的硒形態(tài),研究硒在體內(nèi)的主要反應(yīng)和代謝情況。亞硒酸鹽在生物體內(nèi)很容易和血紅蛋白結(jié)合,與谷胱甘肽反應(yīng)被還原為硒化物,然后部分流入到血漿與白蛋白結(jié)合,轉(zhuǎn)移到肝臟(GSSeSG);一部分在血流中與蛋白結(jié)合,形成硒蛋白。Suzuki等還以82Se為追蹤同位素用HPLC-ICP-MS研究老鼠體內(nèi)硒蛋白P(SelP)和細胞外谷胱甘肽過氧化物酶(eGPx)的代謝情況,顯示在老鼠體內(nèi)注射示蹤82Se后,硒蛋白P(SelP)中的82Se明顯增加,而6—9h后含量下降;而eGPx中的82Se含量在6h后還持續(xù)增加。該研究證明了硒可以在肝臟中快速并有效地轉(zhuǎn)化為SelP,并轉(zhuǎn)移到血漿中,而在腎臟中轉(zhuǎn)化為eGPx并轉(zhuǎn)移到血漿的過程比較緩慢。他們還用HPLC-ICP-MS測定了動物體內(nèi)全部的砷形態(tài),展示了砷的代謝過程。通過一系列還原和甲基化氧化反應(yīng),無機砷被轉(zhuǎn)化為DMAA(Ⅲ),成為尿液中的主要代謝物。該研究在形態(tài)分析的基礎(chǔ)上解釋了砷代謝過程的機理。食品中微量元素的生物活性與其形態(tài)密切相關(guān),例如SeMet是主要的硒氨基酸,是人和其他動物攝取硒的主要來源,具有較高的生物有效性。通過食品中微量元素的形態(tài)分析,了解微量元素的生物活性可以作為評價日常食品營養(yǎng)價值的生物標準。Reyes等用二維色譜(排阻-反相)研究了富硒酵母中的含硒化合物的生物有效性,并采用ESI-MS在線與HPLC聯(lián)用模擬測定腸胃消化過程中產(chǎn)生的低分子量硒化合物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SeMet是胃腸酶提取物中的主要成分,而SeOMet是長時間保存后的主要降解產(chǎn)物。溶劑提取物和殘留物中的硒總量測定顯示89±3%的硒化合物可以通過胃腸消化提取,但是其中只有34±1%是自由態(tài)的SeMet,其余的硒化合物主要分別以低、中、高分子量的形式存在。實驗說明胃腸液可以有效地融解酵母中與蛋白結(jié)合的硒形態(tài),然而將他們轉(zhuǎn)化為自由態(tài)的SeMet的效率較低。殘留物中經(jīng)SDS提取發(fā)現(xiàn)其中只有13±2%的硒化合物被提取出來,說明了殘留物中的硒主要以非蛋白的形式存在,并且與不溶的基體化合物結(jié)合。4.2有機碳的合成Clark等的研究及美國國家研究委員會建議攝取硒量控制在200μg/d可以達到預(yù)防疾病的效果,僅靠日常普通食品攝取硒元素根本無法達到這個標準;而在食品中直接添加的微量元素,人體并不能很好地吸收利用(一些元素的利用率不到1%),只有存在于自然食品中的以各種生物化學(xué)態(tài)結(jié)合的微量元素才能更有效地被人體吸收利用或保留。因此,通過自然添加微量元素而開發(fā)的功能食品是人類攝取充分微量元素的健康食品,例如谷物可以從土壤中吸收硒元素,然后通過食物鏈進入人體被人體吸收利用。植物生長的環(huán)境對植物中微量元素的含量及形態(tài)起著決定性作用。通過這種微量元素在植物中的積累和轉(zhuǎn)化作用,可以通過在土壤中添加某種微量元素達到發(fā)展功能農(nóng)作物的目的。Stadlober等研究了奧地利在土壤中加入含硒化物的復(fù)合肥使不同的谷物硒濃度增加情況。在實驗中,作者利用陰離子交換色譜與ICP-MS聯(lián)用鑒定并定量分析谷物中的硒化合物,以10mmol/L含2%甲醇的檸檬酸緩沖溶液為流動相,4種硒化合物selenate、selenite、SeCys和SeMet6min可以達到基線分離。他們還研究了其他5種硒化合物Sehcys\,Secysta\,Seet、TmSe和DmpSe的保留行為,比較了水提取和酶水解生物基體提取硒總量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)水提取率僅3%—9%,然而用酶水解提取率可以達到80%—95%,谷物中主要的硒形態(tài)是SeMet。不同的生長環(huán)境對作物的產(chǎn)量和作物體內(nèi)微量元素的總量和形態(tài)都有一定的影響。Helgesen和Larsen研究了7種不同含砷、銅的土壤生長環(huán)境對胡蘿卜中砷形態(tài)的影響。顯示在6.5—338μg/g的土壤中,隨著砷含量的增加,胡蘿卜的生長減慢,而在大于400μg/g的土壤中,胡蘿卜根本不能生長。胡蘿卜和土壤中的提取物通過陰離子交換色譜和ICP-MS聯(lián)用測定,顯示胡蘿卜從土壤中吸收砷的效率為0.47±0.06%,而銅濃度的變化影響胡蘿卜在體內(nèi)的含量。該研究可以為人體食用胡蘿卜提供質(zhì)量標準