dna甲基化在表觀遺傳學(xué)中的應(yīng)用

dna甲基化在表觀遺傳學(xué)中的應(yīng)用

所謂sad-a，或氨基葡萄糖（c）堿性化合物可在二甲基氧化物轉(zhuǎn)化酶（a）的加速下與甲基化合物一起合成，在細(xì)胞分裂過程中傳遞給子細(xì)胞的表觀遺傳現(xiàn)象。由DNA腺嘌呤甲基化酶(DNAadeninemethylase,DAM)催化形成的O6-甲基腺嘌呤(6mA)是一種CTAG序列復(fù)制后維持甲基化,在細(xì)菌表觀遺傳過程中發(fā)揮作用,具體功能包括染色體復(fù)制、錯配修復(fù)、毒力基因表達(dá)控制、外源性基因防御等。近年發(fā)現(xiàn)DNA腺嘌呤甲基化還參與細(xì)菌細(xì)胞周期控制。細(xì)菌DNA腺嘌呤甲基化的具體過程及功能已經(jīng)研究的比較清楚,本文不做進(jìn)一步敘述。存在于高等生物細(xì)胞內(nèi)的C5-甲基胞嘧啶(5mC)由一組DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)催化形成,包括從頭甲基化和DNA復(fù)制后維持甲基化兩種形成途徑。在成年脊椎動物體細(xì)胞中主要發(fā)生在胞嘧啶-鳥嘌呤(G)二核苷酸(CpG)位點(diǎn)上;在植物細(xì)胞和動物胚胎干細(xì)胞還可發(fā)生在非CpG位點(diǎn)上。胞嘧啶甲基化在多細(xì)胞生物的細(xì)胞分化和環(huán)境適應(yīng)方面發(fā)揮重要作用,具體功能包括X染色體滅活、基因印記、基因長效沉默、細(xì)胞分化、外源基因防御、異物代謝等,是比較活躍的研究領(lǐng)域之一,近年取得了諸多研究進(jìn)展。本文簡要綜述了DNA去甲基化的機(jī)制和DNA甲基化建立及維持研究的主要進(jìn)展,并對存在的幾個關(guān)鍵問題進(jìn)行了討論。1胞監(jiān)髓炎在術(shù)后模擬過程中的耐藥基因DNA胞嘧啶甲基化是一種共價修飾,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。5mC有兩種形成途徑:DNA半保留復(fù)制后由UHRF1(Ubiquitin-like,containingPHDandRINGfingerdomains,1)招募DNMT1,催化半甲基化DNA雙鏈中未甲基化鏈的維持甲基化(Maintenancemethylation);由DNMT3a和DNMT3b催化未甲基化DNA雙鏈的從頭甲基化(denovomethylation)。DNA去甲基化也存在被動去甲基化和主動去甲基化兩種途徑。細(xì)胞可通過抑制DNMT1表達(dá)或催化活性來阻斷DNA的維持甲基化,在細(xì)胞分裂過程中稀釋/降低基因組中甲基化胞嘧啶的密度,實(shí)現(xiàn)被動去甲基化(圖1A)。最近日本學(xué)者報(bào)道,這種被動去甲基化機(jī)制是小鼠胚胎發(fā)育過程中原生殖細(xì)胞(Primordialgermcell)去除基因組親本DNA甲基化的關(guān)鍵機(jī)制。在高等脊椎動物卵子受精后,經(jīng)過4次卵裂,除印記基因外,基因組DNA將完全去甲基化,形成全能的胚胎干細(xì)胞(Embryonicstemcell,ESC)。在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Inducedpluripotentstemcell,iPSC)形成過程中也存在類似的完全去甲基化現(xiàn)象。卵裂過程中如果只存在被動去甲基化,經(jīng)過4次分裂的ESC基因組中至少還應(yīng)該保留1/16的甲基化胞嘧啶,無法實(shí)現(xiàn)完全去甲基化。顯然,在胚胎干細(xì)胞中還存在其他去甲基化的機(jī)制。胞嘧啶脫氨基酶能夠催化未甲基化和甲基化胞嘧啶脫氨基,分別形成尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T)。甲基化胞嘧啶的脫氨基效率明顯高于未甲基化者。胞嘧啶脫氨基是脊椎動物進(jìn)化過程中基因組發(fā)生CpG抑制(CpGsuppression)的主要原因。在腫瘤細(xì)胞基因組中,大部分點(diǎn)突變都是CpG位點(diǎn)的胞嘧啶轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶(C:G→T:A)。由于脫氨基形成的尿嘧啶或胸腺嘧啶與互補(bǔ)鏈上的鳥嘌呤不配對,在正常情況下大部分將在尿嘧啶或者胸腺嘧啶DNA糖苷酶等的催化下,按堿基切除修復(fù)(BER)方式修復(fù)。通過這種胞嘧啶脫氨基-堿基切除修復(fù)途徑,細(xì)胞的確有實(shí)現(xiàn)DNA主動去甲基化的可能。在受到感染、輻射等致癌物打擊后,宿主靶器官/組織的胞嘧啶脫氨基酶(包括APOBEC和AID等)含量會迅速上升,全基因組同步低甲基化。尚不清楚這種脫氨基酶活性的升高是否為全基因組低甲基化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Popp等研究表明,AID缺乏小鼠的原生殖細(xì)胞全基因組甲基化水平升高,但是胚胎和胎盤組織的總甲基化水平無差別,提示AID可能僅在原生殖細(xì)胞主動去甲基化過程中發(fā)揮作用。AID是胞嘧啶脫氨基酶家族的一員,在離體條件下能夠使單鏈DNA胞嘧啶脫氨基,在B細(xì)胞中高表達(dá),促進(jìn)編碼免疫球蛋白IgM的基因轉(zhuǎn)化成編碼IgG的基因。該基因遺傳缺陷將導(dǎo)致常染色體隱性遺傳病——免疫缺陷綜合征(無IgG、IgA、IgE,對細(xì)菌感染高度易感)或Ⅱ型高IgM綜合征(HIGM2)。在脊椎動物細(xì)胞基因組中還存在許多其他DNA胞嘧啶脫氨基酶。不同的胞嘧啶脫氨基酶有不同的DNA序列偏好,如AID偏好WRCY(W=A或T;R=嘌呤;Y=嘧啶),APOBEC偏好胞嘧啶串(Cs)上的末位胞嘧啶,APOBEC1偏好TC位點(diǎn),APOBEC3DC偏好WC位點(diǎn),卻未發(fā)現(xiàn)偏好CpG位點(diǎn)的胞嘧啶脫氨基酶。盡管甲基化胞嘧啶的脫氨基效率明顯高于未甲基化者,胞嘧啶脫氨基-堿基切除修復(fù)途徑是否為脊椎動物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)CpG位點(diǎn)主動去甲基化的主要途徑尚缺乏定論。2009年美國的兩個研究小組同時發(fā)現(xiàn)腦組織和ESCDNA中存在5-羥甲基胞嘧啶(hmC),證明TET1(Ten-eleventranslocationmethylcytosinedioxygenase1)能夠催化DNA中5mC氧化成為hmC(圖2),推測hmC的功能之一是參與DNA主動去甲基化。2011年徐國良等與美國學(xué)者同步報(bào)道,TET1和TET2基因還能夠使hmC進(jìn)一步氧化,形成5-醛基胞嘧啶(fC)和5-羧基胞嘧啶(caC);在離體條件下DNA中的caC可被胸腺嘧啶DNA糖苷酶切除,用siRNA敲減該酶含量后ESC中caC含量升高,推測它參與了caC的堿基切除修復(fù)過程(圖1B)。TET3基因在小鼠受精卵去除雄原核DNA甲基化標(biāo)記過程中也能發(fā)揮作用。Williams等也報(bào)道,在哺乳動物ESC基因組中廣泛存在TET1蛋白結(jié)合和hmC。值得注意的是,Hackett等報(bào)道TET1和TET2蛋白催化的hmC形成與小鼠原始生殖細(xì)胞分裂過程平行,在去除親本DNA甲基化印記過程中發(fā)揮作用,提示TETs介導(dǎo)的DNA主動去甲基化與細(xì)胞分裂過程存在密切關(guān)系。TET1和TET2可與干細(xì)胞因子NANOG相互結(jié)合,共同在誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞獲得多能性過程中發(fā)揮作用。盡管斑馬魚等低等脊椎動物的精子DNA的甲基化水平與其體細(xì)胞相同,在胚胎發(fā)育早期,雄源性DNA的總甲基化水平仍然維持不變[16~18],這與小鼠等哺乳動物胚胎發(fā)育早期基因組存在普遍的去甲基化明顯不同。相反,斑馬魚在卵子成熟過程中就完成了全基因組去甲基化,而小鼠卵子在受精卵分裂(卵裂)過程中才能夠完成全基因組去甲基化,盡管這種去甲基化在卵子成熟過程中就開始了。這些結(jié)果說明,在低等脊椎動物與哺乳動物之間,與ESC獲得全能性相關(guān)的基因組去甲基化方式存在明顯差別。那么,DNA主動去甲基化與被動去甲基化之間是否存在內(nèi)在聯(lián)系呢?在常規(guī)的堿基切除修復(fù)過程中需要切除一小段核苷酸序列(2~6bp),而CpG位點(diǎn)的甲基化在DNA雙鏈中是對稱性的。如果DNA雙鏈上同一甲基化CpG位點(diǎn)發(fā)生同步氧化和堿基切除修復(fù),將導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂,CpG位點(diǎn)密集(如CpG島和Alu元件及重復(fù)序列LINE)的DNA甚至可能碎片化(圖1B)。如果以細(xì)胞分裂過程中形成的半甲基化DNA為切除修復(fù)底物,則可避免這種DNA斷裂或碎片化。如上所述,被動去甲基化和TET氧化5mC均在原生殖細(xì)胞DNA去甲基化過程中發(fā)揮作用。筆者認(rèn)為全基因組TET主動去甲基化存在與DNA被動去甲基化配合完成的可能(圖1C)。在缺乏細(xì)胞分裂相關(guān)的被動去甲基化的條件下,DNA是否能夠?qū)崿F(xiàn)主動去甲基化呢?2012年沈哲鯤等報(bào)道,在非細(xì)胞體系中,DNMT3a和DNMT3b能夠直接切除雙鏈DNA胞嘧啶中的羥甲基,而DNMT1無此作用。DNMTs基因在ESC中基本不表達(dá),在分化的細(xì)胞(如胚球和衍生的體細(xì)胞)中表達(dá),在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。DNMTs是否的確參與這些分化細(xì)胞的主動去甲基化過程還有待研究。在植物細(xì)胞去甲基化方面,2012年Qian等發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞內(nèi)的乙酰化酶IDM1可以與甲基化的DNA結(jié)合,催化該區(qū)域的組蛋白發(fā)生乙?；?創(chuàng)造環(huán)境使5mC糖苷酶發(fā)揮功能,從而使DNA發(fā)生去甲基化。hmC不僅參與原生殖細(xì)胞和ESC去甲基化,而且還可不進(jìn)一步氧化,穩(wěn)定地存在于成體組織細(xì)胞中。在不同成年組織的細(xì)胞中,hmC的分布與核小體組蛋白H3K27me3存在高度的相關(guān)性。hmC在成年組織的細(xì)胞基因組內(nèi)為什么不會象在ESC中那樣進(jìn)一步氧化?其功能尚未明確。在小鼠腦組織中,hmC可以較高的豐度穩(wěn)定存在;在斑馬魚和人體細(xì)胞老化過程中,其體細(xì)胞基因組中臨近CpG島周圍區(qū)域(CpGislandshores)的甲基化水平不斷降低;在胰腺腫瘤基因組中hmC的含量不斷降低,可聚集在原癌基因DNA上。最近研究表明,hmC的形成還受環(huán)境因素影響,二甲基亞砜(DMSO)處理會顯著促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞hmC含量;還原型維生素C處理可明顯提高小鼠ESCTET1的催化活性和hmC水平;苯巴比妥處理能夠迅速誘發(fā)大鼠肝臟基因組hmC的分布改變。這些結(jié)果提示hmC的穩(wěn)定性比5mC低,對環(huán)境因素更加易感,與環(huán)境適應(yīng)基因的甲基化狀態(tài)改變關(guān)系更密切。2轉(zhuǎn)錄基因維持去甲基化狀態(tài)的機(jī)制基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(TSS)周圍CpG島甲基化是基因長期穩(wěn)定沉默的標(biāo)志,在細(xì)胞分化過程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。哺乳動物的胚泡(Blastocyst)內(nèi)完全去甲基化的ESC按照不同的分化方向,在DNMT3a和3b的催化下發(fā)生有序的從頭甲基化,建立細(xì)胞分化相關(guān)甲基化譜。從頭甲基化和去甲基化現(xiàn)象還廣泛存在于機(jī)體正常適應(yīng)環(huán)境和疾病的發(fā)生發(fā)展過程中,建立環(huán)境適應(yīng)相關(guān)甲基化譜。在DNMTs高表達(dá)的細(xì)胞中(例如腫瘤細(xì)胞),DNA中的CpG位點(diǎn)的默認(rèn)狀態(tài)到底是非甲基化的還是甲基化的?腫瘤抑制基因的甲基化失活是腫瘤組織中的常見現(xiàn)象,一般認(rèn)為這種失活的機(jī)制是這些基因的轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物招募了DNMTs,導(dǎo)致CpG島甲基化。然而,這一理論不能解釋為什么在體細(xì)胞基因的軀干部位(Genebody)70%以上的散在CpG位點(diǎn)都是甲基化的。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種轉(zhuǎn)錄基因維持去甲基化狀態(tài)的機(jī)制。長鏈非編碼RNA(lncRNA)不僅可通過競爭性結(jié)合miRNA或PcG蛋白等途徑來發(fā)揮正向調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用[28~35],而且還可通過與DNMT1結(jié)合來阻斷其甲基化活性,維持目的基因DNA的去甲基化狀態(tài)。H3K4me3是基因存在轉(zhuǎn)錄活性的標(biāo)志,H3K4me1則是H3K4me3形成的基礎(chǔ)。2009年Hu等發(fā)現(xiàn)未甲基化的H3K4是DNMT3L的結(jié)合區(qū),能夠促進(jìn)DNMT3L-DNMT3a復(fù)合物的從頭甲基化作用。未甲基化的H3K4還能夠誘導(dǎo)DNMT3a蛋白的構(gòu)象變化,提高其甲基化酶活性;DNMT3a的甲基化活性與H3K4me1的含量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。近年來,包括ENCODE研究在內(nèi)的各種高分辨率的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合組和DNA甲基化組研究揭示,活性基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近序列是轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的穩(wěn)定結(jié)合區(qū),在這些區(qū)域染色質(zhì)中普遍存在甲基化的H3K4,DNA則呈低甲基化狀態(tài)。基因組中DNA的甲基化與核小體的分布亦存在高度的相關(guān)性。在人胃癌發(fā)生過程中,p16基因CpG島甲基化具有以核小體為基本單元脈沖式擴(kuò)展的特征。在降低組蛋白甲基化酶G9A和SUV39H1蛋白水平和基因啟動子區(qū)H3K9me2/3水平后,啟動子區(qū)結(jié)合的HP1和DNMT1減少。Ficz等用hmC特異性抗體對全基因組進(jìn)行hMeDIP-測序分析,發(fā)現(xiàn)hmC大部分分布于小鼠胚胎干細(xì)胞常染色質(zhì)區(qū)。Sun等用AbaSI酶切-測序法發(fā)現(xiàn),hmC主要分布在小鼠ESC基因組的CTCF結(jié)合區(qū),特別是存在H3K4me1的區(qū)域,而不是在H3K27ac富集區(qū)。在骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中也存在高水平的hmC。種種跡象表明,在DNMT1充分表達(dá)的條件下,DNA中大部分CpG位點(diǎn)的默認(rèn)狀態(tài)是甲基化的。在基因常轉(zhuǎn)錄的區(qū)域存在活躍的DNA去甲基化現(xiàn)象。上述現(xiàn)象說明,基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及其相關(guān)的組蛋白修飾在維持DNA去甲基化狀態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。一旦基因處于非轉(zhuǎn)錄狀態(tài),則將失去這些去甲基化機(jī)制的保護(hù),發(fā)生甲基化。我們最近的工作表明,盡管腫瘤細(xì)胞中p16基因的甲基化和非甲基化狀態(tài)非常穩(wěn)定,仍然伴有低水平的局部甲基化和羥甲基化及去甲基化,這種局部甲基化變化不穩(wěn)定地存在于每個細(xì)胞中,說明該基因的甲基化狀態(tài)是以穩(wěn)態(tài)(Homeostasis)的模式維持(待發(fā)表)。因此,有必要對甲基化狀態(tài)穩(wěn)態(tài)維持是否具有普遍性、穩(wěn)態(tài)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成等開展進(jìn)一步研究,以了解表觀遺傳的本質(zhì)。3dna甲基化是未來資人體內(nèi)存在200多種不同類型的細(xì)胞,不僅各自有不同的細(xì)胞分化相關(guān)DNA甲基化譜,而且還有隨著生存環(huán)境因素和年齡的變化而變化的適應(yīng)相關(guān)DNA甲基化譜。顯然,與基因組相比較,人體內(nèi)DNA甲基化組等表觀遺傳組更加復(fù)雜多樣,研究工作尤其艱巨。DNA基因組序列完全相同的人ESC如何分化成不同的細(xì)胞?DNA甲基化如何與其他表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)工作?這些網(wǎng)絡(luò)是怎樣有效適應(yīng)不同生存環(huán)境因素變化的?這些網(wǎng)絡(luò)在疾病發(fā)生過程中究竟發(fā)揮了什么作用?哪些能夠用于疾病的預(yù)防、診斷和治療?這些都是仍然有待闡明的熱點(diǎn)問題。表觀遺傳現(xiàn)象極其復(fù)雜,一方面需要