-花青素細(xì)胞刺激素對(duì)下丘腦葡萄糖敏感神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響

-花青素細(xì)胞刺激素對(duì)下丘腦葡萄糖敏感神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響

i-mth是由阻斷氨基酸（popc）生產(chǎn)的黑皮質(zhì)素家族（mh）引起的最具抑制作用的黑皮質(zhì)素家族的成員。在已知的5種黑皮質(zhì)素受體中只有MC3R和MC4R分布于腦內(nèi),α-MSH是其內(nèi)源性配體,介導(dǎo)生理性飽感信號(hào),從而在調(diào)控體質(zhì)量和能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。研究表明,在第四腦室或迷走神經(jīng)背核注射MC3R/4R激動(dòng)劑MTII或拮抗劑SHU9119分別產(chǎn)生抑制和促進(jìn)攝食的效應(yīng)。下丘腦室旁核(PVN)和下丘腦外側(cè)區(qū)(LHA)接受大量由弓狀核(ARC)POMC/CART神經(jīng)元發(fā)出的傳入信號(hào),經(jīng)過(guò)整合后進(jìn)一步作用于下游的孤束核(NTS)。而NTS內(nèi)的POMC神經(jīng)元在參與迷走-迷走反射的同時(shí),進(jìn)一步將外周來(lái)的信號(hào)整合投射到下丘腦的PVN等核團(tuán)。我們先前已觀察到α-MSH對(duì)腦干背側(cè)迷走復(fù)合體(DVC)的葡萄糖敏感神經(jīng)元和胃擴(kuò)張敏感神經(jīng)元的放電活動(dòng)具有調(diào)制作用,但是α-MSH對(duì)下丘腦葡萄糖敏感神經(jīng)元的作用仍不清楚。大量的研究結(jié)果已證明,LHA主要含有葡萄糖抑制型(GI)神經(jīng)元,VMH主要含有葡萄糖興奮型(GE)神經(jīng)元,而PVN中含有GI和GE兩類神經(jīng)元。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察α-MSH對(duì)下丘腦葡萄糖敏感神經(jīng)元放電活動(dòng)影響,從而進(jìn)一步探討α-MSH在下丘腦參與攝食調(diào)控的可能機(jī)制。1材料和方法1.1飼養(yǎng)管理健康Wistar大鼠150只,雌雄各半,體質(zhì)量250～300g,由青島市藥品檢驗(yàn)所提供。依據(jù)青島大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)道德規(guī)范飼養(yǎng),室溫20～25℃,12-12h晝夜循環(huán)光照條件下,自由攝食和飲水,預(yù)養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)藥品α-MSH、SHU9119及葡萄糖D-(+)-Glucose均系Sigma公司產(chǎn)品,其使用濃度分別為500nmol/L、1mol/L和0.5mol/L,pH7.4,以上藥品均以9g/L的NaCl溶液配制。1.2立體定位儀烏拉坦(1.0g/kg)腹腔麻醉大鼠,手術(shù)中酌情追加水合氯醛。維持體溫(37±1)℃。將大鼠置于立體定位儀上,門齒條低于耳桿中心3.4mm。剪去大腦上方皮膚,用牙科鉆去除顱骨,清除腦膜,以加熱的30～40g/L瓊脂生理鹽水溶液覆蓋在大腦表面,并保持前后囟水平。1.3壓力注射檢測(cè)paxilus-w龍制備四管玻璃微電極,尖端直徑約3～10μm,電極阻抗5～20MΩ,用于電生理記錄和微量注射。記錄電極充灌0.5mol/L的醋酸鈉和2g/L滂胺天藍(lán)(pH7.7)。另外3管分別充灌α-MSH、葡萄糖及生理鹽水或SHU9119,分別與壓力注射儀的管道相連。按照Paxinos-Watson圖譜定位。LHA:前囟后(AP)1.8～2.3mm,旁開(L/R)1.5～2.0mm,深度(D)7.5～9.0mm。PVN:AP為1.8～2.3mm,L/R為0.1～0.4mm,D為7.7～8.4mm。VMH:AP為2.8～3.3mm,L/R為0.2～1.0mm,D為9.3～10.0mm。1.4葡萄糖敏感神經(jīng)元放電頻率的測(cè)定通過(guò)監(jiān)聽器聲音變化和監(jiān)視器顯示基線漂移突然變細(xì)的現(xiàn)象來(lái)判斷電極尖端到達(dá)空氣與瓊脂界面,用液壓推進(jìn)操縱器將微電極下至接近預(yù)定深度尋找神經(jīng)元,經(jīng)4-導(dǎo)壓力注射儀(PM2000B,MicroDataInstrument,Inc.USA)將藥物注射到神經(jīng)元表面。記錄放電神經(jīng)元穩(wěn)定放電至少150s后,加壓注射葡萄糖(GS),觀察其放電頻率的變化,注射前后放電頻率改變?cè)?0%以上者記為葡萄糖敏感神經(jīng)元。待放電頻率恢復(fù)穩(wěn)定至少150s后,再微量注射α-MSH觀察3～6min,待放電頻率再次恢復(fù)并穩(wěn)定至少150s后注入生理鹽水作為對(duì)照?；蛘叽烹娀謴?fù)并穩(wěn)定150s后注入SHU9119,然后于20s內(nèi)注入α-MSH對(duì)比觀察其放電頻率的變化。放電信號(hào)經(jīng)MEZ-8201型微電極放大器輸入VC-11雙道示波器的上線顯示波形,電信號(hào)經(jīng)由示波器同步Y(jié)軸輸出,通過(guò)SUMP-PC生物信號(hào)處理系統(tǒng)輸入計(jì)算機(jī),由Histo軟件進(jìn)行放電頻率分析。1.5大鼠腦注射法記錄完畢,通過(guò)玻璃微電極電泳,滂胺天藍(lán)標(biāo)記最后一個(gè)記錄位點(diǎn)(-20μA,15min)。大鼠在過(guò)量麻醉下,經(jīng)心臟灌注生理鹽水100mL,隨后用40g/L多聚甲醛溶液150mL灌注固定;取腦后固定4h;冠狀冷凍切片(厚度100μm),確定記錄神經(jīng)元的位置。1.6神經(jīng)元棄之用量對(duì)符合鑒定標(biāo)準(zhǔn)的神經(jīng)元進(jìn)行分析,非葡萄糖敏感或者記錄位置在3個(gè)核團(tuán)之外的神經(jīng)元棄之不用。用MATLAB7.0和SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示。加藥前后頻率變化比較采用成對(duì)t檢驗(yàn),放電頻率變化百分比之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1gs對(duì)火炬放空頻率的影響在LHA記錄到的78個(gè)神經(jīng)元中有26個(gè)(33.33%)GE神經(jīng)元,36個(gè)(46.15%)GI神經(jīng)元。36個(gè)GI神經(jīng)元中有75%(27個(gè))被α-MSH所抑制。而26個(gè)GE神經(jīng)元中被α-MSH所興奮和抑制的神經(jīng)元數(shù)目相等,均為8個(gè)。對(duì)于被α-MSH抑制的27個(gè)GI神經(jīng)元,在加入GS前后放電頻率分別為(5.61±0.87)和(2.62±0.55)Hz,加入GS前后放電頻率比較差異有極顯著意義(t=6.79,P<0.01),平均降低了56.16%±3.84%;而在加入α-MSH前后其放電頻率分別為(3.72±0.49)和(1.39±0.29)Hz,加入α-MSH前后其放電頻率比較差異有顯著性(t=6.08,P<0.01),平均降低了59.99%±4.51%。其中12個(gè)被α-MSH抑制的GI神經(jīng)元,先后加入SHU9119和α-MSH,神經(jīng)元的放電頻率變化百分比由(52.90±1.53)%降低到(20.88±0.60)%(t=3.38,P<0.01),表明α-MSH對(duì)GI神經(jīng)元的抑制效應(yīng)部分被阻斷。2.2-msh前后放電頻率的變化在PVN共記錄到68個(gè)神經(jīng)元,其中有27個(gè)(39.71%)GE神經(jīng)元,其中24個(gè)被α-MSH興奮;有20個(gè)(29.41%)GI神經(jīng)元,其中14個(gè)被α-MSH抑制。其中被α-MSH興奮的24個(gè)GE神經(jīng)元,在加入GS前后的放電頻率分別為(3.20±0.75)和(5.99±1.03)Hz,加入GS前后的放電頻率比較差異有顯著意義(t=6.88,P<0.01),平均升高了128.64%±18.87%;在加入α-MSH前后放電頻率分別為(2.06±0.22)和(5.00±0.54)Hz,加入α-MSH前后放電頻率比較差異有顯著性(t=7.05,P<0.01),平均升高了(156.53±19.65)%。被α-MSH抑制的14個(gè)GI神經(jīng)元,加入GS前后的放電頻率分別為(1.74±0.31)和(0.61±0.16)Hz,加入GS前后的放電頻率比較差異有顯著性(t=6.71,P<0.01),平均降低了(67.86±3.73)%;給予α-MSH前后放電頻率分別為(1.43±0.17)和(0.28±0.07)Hz,給予α-MSH前后放電頻率比較差異有顯著性(t=8.46,P<0.01),平均降低了(77.79±4.08)%。對(duì)7個(gè)被α-MSH抑制的GI神經(jīng)元先后加入SHU9119及α-MSH,放電頻率變化百分比由(152.32±37.46)%降低到(27.09±7.56)%(t=3.27,P<0.01)。對(duì)18個(gè)被α-MSH興奮的GE神經(jīng)元同樣預(yù)先給予SHU9119,其放電頻率變化百分比由(143.48±22.06)%降低到(39.84±6.28)%(t=4.52,P<0.01),結(jié)果表明α-MSH的效應(yīng)部分被阻斷。2.3gs前后e神經(jīng)元放電頻率的變化在VMH共記錄到的56個(gè)神經(jīng)元中GE神經(jīng)元有22個(gè)(39.29%),GI神經(jīng)元有8個(gè)(14.29%)。22個(gè)GE神經(jīng)元中被α-MSH所興奮的神經(jīng)元有20個(gè)(90.91%)。被α-MSH所興奮的20個(gè)GE神經(jīng)元,加入GS前后其放電頻率分別為(1.68±0.22)和(4.12±0.51)Hz,加入GS前后其放電頻率比較差異有顯著意義(t=6.44,P<0.01),平均升高了(167.42±20.66)%;而在加入α-MSH前后其放電頻率分別為(1.59±0.19)和(3.93±0.32)Hz(t=9.24,P<0.01),平均升高了(181.91±32.52)%。其中有10個(gè)被α-MSH所興奮的GE神經(jīng)元預(yù)先給予SHU9119,其放電頻率變化百分比由(186.20±50.36)%降低到了(24.31±5.89)%(t=3.19,P<0.05),表明α-MSH對(duì)GE神經(jīng)元的興奮效應(yīng)部分被阻斷。3mc4r基因缺陷對(duì)人類實(shí)驗(yàn)者的作用中樞POMC系統(tǒng)調(diào)節(jié)能量平衡是通過(guò)黑質(zhì)素受體(MC4R/3R)的內(nèi)源性激動(dòng)劑α-MSH及其內(nèi)源性的拮抗劑AgRP的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。POMC的過(guò)度表達(dá)會(huì)伴隨MC4R/3R以及α-MSH的表達(dá)增加,從而導(dǎo)致饑餓感增強(qiáng),這些效應(yīng)都能夠通過(guò)預(yù)先給予SHU9119而得到抑制。有研究結(jié)果表明,用α-MSH免疫后大鼠與正常組對(duì)比在限制攝食和繼續(xù)腹腔給予α-MSH后,其攝食量有明顯增加。預(yù)先腦室注射SHU9119,下丘腦促進(jìn)攝食的臨界點(diǎn)就會(huì)上調(diào)。POMC神經(jīng)元僅在ARC和NTS兩核內(nèi)分布,而這兩個(gè)部位又是通過(guò)與下丘腦的LHA、PVN、VMH等核團(tuán)的纖維聯(lián)系進(jìn)行整合作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在LHA內(nèi)主要是GI神經(jīng)元且大部分被α-MSH所抑制,在VMH內(nèi)則主要為GE神經(jīng)元且絕大部分被α-MSH所興奮,而在加入MC4R拮抗劑SHU9119后,α-MSH的作用則大部分被阻斷。我們傳統(tǒng)認(rèn)為L(zhǎng)HA為饑餓中樞,VMH為飽食中樞,α-MSH通過(guò)抑制饑餓中樞同時(shí)興奮飽食中樞從得達(dá)到抑制攝食的效應(yīng)。人們普遍認(rèn)為PVN在控制食欲以及能量平衡方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,對(duì)促進(jìn)和抑制食欲的信號(hào)的處理起到一個(gè)中轉(zhuǎn)站的作用。本實(shí)驗(yàn)PVN內(nèi)有88.89%的GE神經(jīng)元被α-MSH所興奮,70%的GI神經(jīng)元被α-MSH所抑制,同時(shí)給予SHU9119后α-MSH的作用部分被阻斷,說(shuō)明了在PVN內(nèi)這兩類神經(jīng)元的興奮性可以被α-MSH所調(diào)制。本文結(jié)果也進(jìn)一步證明了PVN在