下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素與糖皮質激素關系的實驗研究

下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素與糖皮質激素關系的實驗研究

應激反應是以下肢-腎上腺-受體激活為核心的生理和心理反應。應激后促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropinreleasinghormone,CRH)在HPA軸中發(fā)揮重要作用,控制著HPA軸的興奮水平。研究表明海馬對HPA軸有負反饋調節(jié)作用,可能是因為海馬媒介穹窿對下丘腦室旁核產生了抑制作用。本課題組前期實驗通過建立大鼠穹窿切斷模型,觀察到穹窿切斷7d后,下丘腦室旁核神經元CRH的表達升高,10d升高顯著。此結果提示我們,穹窿切斷后海馬對下丘腦室旁核的抑制作用減弱,室旁核合成CRH增多,HPA軸活動增強。但是血中糖皮質激素的濃度升高是否是HPA軸活動增強的結果,這一點還未曾證實。本實驗建立大鼠穹窿切斷模型,檢測糖皮質激素濃度變化情況,以進一步驗證海馬是否媒介穹窿對下丘腦室旁核產生了抑制作用。此外通過實施穹窿切斷術同時摘除其腎上腺,觀察CRH的表達變化,研究糖皮質激素與CRH的關系,為研究揭示應激的變化機理提供一定的理論和實驗依據(jù)。1材料和方法1.1elisa檢測成年健康雄性Wistar大鼠90只,200～220g,購于中國醫(yī)科大學實驗動物中心,實驗室條件飼養(yǎng),隨機分為12組,即穹窿切斷0、4、7、10d組、相應假手術組和相應正常組,每組5只,共60只,用于ELISA檢測。剩余大鼠隨機分為穹窿切斷并摘除腎上腺7d組、相應假手術組和相應正常組。每組10只,共30只,用于免疫組織化學和免疫印跡法各半。1.2實驗方法1.2.1雙刀刀降刀手術將大鼠用戊巴比妥麻醉后,固定于江灣IC型腦立體定位儀,常規(guī)消毒、剪毛,正中切開頭皮,暴露出顱骨,于前囟后1.5mm,中線外左右1.0mm處,用電動開顱器鑿開顱骨,切開硬腦膜,自制的雙刃刀置于上述部位的腦表面(相當于穹窿部位),續(xù)降刀6mm,切斷穹窿,降刀時間約1min,假手術組降刀2mm(未切穹窿),刀在腦中均停留5min。清潔顱面,縫合頭皮,常規(guī)飼養(yǎng),抗生素控制感染。1.2.2腎前外側臟器的切除建立穹窿切斷動物模型后,將大鼠俯臥位固定于蛙板上。從最后胸椎處向后沿背部正中線做約2cm長的皮膚切口。在腎前內側脊柱下方找到淡黃色的腎上腺并摘除,同法摘除右側腎上腺(位置稍靠前),縫合肌肉和皮膚,并涂以碘酊。假手術組進行與實驗組相似的手術,但不摘除腎上腺。術后保持室溫為21～25℃,以葡萄糖、生理鹽水代替飲水。1.3血清標本的制備取穹窿切斷大鼠眼窩靜脈叢血液,每次采血0.5mL,消毒棉球壓迫眼球止血30s。采血后離心取血清,相應反應板孔中加入20μL標準品,20μL血清標本,每板孔再加入200μL酶聯(lián)物,室溫60min。洗滌液洗滌反應板,每孔加入100μL顯色液,室溫溫育15min。每孔加入100μL終止液。輕輕混勻30s;60min內450nm處讀OD值,再換算成質量濃度。1.4crh抗體檢測穹窿切斷并摘除腎上腺大鼠施心灌流、固定,用恒冷箱切片機(型號Leica)制作冷凍切片,厚14μm,3%H2O2-甲醇20min、0.03%TritonX-100浸泡10min,5%BSA封閉20min后,滴加CRH抗體(工作濃度為1:500),陰性對照組加0.01mol/LPBS代替一抗,4℃孵育過夜,滴加二抗IgG37℃、20min,滴加SABC37℃、20min,DAB顯色,脫水,透明,中性樹膠封片,光學顯微鏡(OLYMPUS,BX60,Japan)下觀察,攝片。1.5e變性凝膠電泳取穹窿切斷并摘除腎上腺大鼠新鮮下丘腦組織經勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心,11000r/min,取上清;每例標本提取蛋白50μg,7.5%SDS變性凝膠電泳,濃縮膠80V,30min,分離膠120V,90min;轉印,40V,95min和100V,120min;TBS浸泡10min,5%脫脂奶粉封閉60min,TTBS中洗2×5min;CRH一抗(工作濃度1∶1000)中孵育4℃過夜;HRP標記IgG(工作濃度1∶1500)孵育2h,TTBS洗2×5min,TBS洗1×10min,HRP-ECL法顯色,dH2O漂洗,掃描膠片,ScionImage軟件分析。1.6統(tǒng)計處理所得實驗數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,用SPSS13.0軟件處理,采用方差分析進行兩兩比較,以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。2結果2.1elisa試驗結果ELISA結果表明穹窿切斷后0、4d,糖皮質激素的濃度無明顯變化,7d后糖皮質激素濃度升高,10d升高顯著(表1)。2.2對外周血小鼠骨髓細胞crh表達的影響正常組及假手術組CRH免疫反應陽性產物呈棕黃色斑塊狀,主要分布于室旁核神經元的細胞質內。穹窿切斷并摘除腎上腺組下丘腦室旁核神經元CRH的陽性表達(0.499±0.077)較正常組(0.387±0.065)、假手術組(0.379±0.082)明顯增高,CRH免疫反應的平均光密度值升高,細胞染色變深,(P<0.05)(圖1)。2.3各組小鼠血清中免疫組化指標的比較免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)下丘腦CRH的表達在穹窿切斷并摘除腎上腺組(91.21±8.73)與假手術組(43.83±4.16)、正常組(39.72±3.48)相比明顯升高(P<0.05)(圖2)。3糖激素對crh的調節(jié)作用CRH是一種重要的神經遞質,與機體的內分泌、代謝、心血管功能、神經化學和行為反應密切相關。CRH廣泛表達于中樞神經系統(tǒng),但在應激后僅在下丘腦室旁核表達增加。下丘腦室旁核是HPA軸活動的直接控制部位。應激狀態(tài)下,室旁核分泌CRH經正中隆起、垂體門脈系統(tǒng)作用于垂體前葉細胞上高度表達的CRHR1(CRH的I型受體),刺激垂體前葉合成、分泌ACTH,促進腎上腺皮質分泌糖皮質激素,發(fā)揮神經內分泌功能。研究表明海馬對HPA軸有負反饋調節(jié)作用。但是從海馬到室旁核沒有直接的神經投射,間接路徑都匯聚到穹窿,由此可推斷海馬對HPA軸的調節(jié)作用可能是媒介穹窿對下丘腦旁核產生了抑制作用。本課題組的前期實驗通過建立大鼠穹窿切斷的模型,觀察到穹窿切斷7d后,CRH的表達升高。提示穹窿切斷后,海馬對HPA軸的抑制作用減弱,室旁核合成CRH增多,HPA軸活動增強,證明了海馬可能通過穹窿對室旁核發(fā)揮抑制作用。但是CRH表達升高,HPA軸活動增強的最終結果是糖皮質激素的水平升高。為此,本實驗在已有的研究基礎上建立了大鼠穹窿切斷的模型,檢測血中糖皮質激素的濃度,實驗結果表明穹窿切斷7d后,糖皮質激素的濃度升高,進一步驗證了海馬通過穹窿對下丘腦室旁核發(fā)揮抑制作用?，F(xiàn)將穹窿切斷的動物并摘除腎上腺,即在糖皮質激素水平下降的情況下,觀