豬腦內(nèi)lepin長(zhǎng)形受體mrna分布定位

豬腦內(nèi)lepin長(zhǎng)形受體mrna分布定位

leptin是脂肪細(xì)胞分泌的含有167個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)激素。它可以調(diào)節(jié)動(dòng)物的攝食量、能量代謝、生長(zhǎng)、繁殖、內(nèi)外分泌和免疫等。據(jù)報(bào)道,leptin受體(OB-R)有5～6種剪接體,其中OB-Ra、c、d、e、f為短形受體,OB-Rb為長(zhǎng)形受體。只有OB-Rb具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,為功能性受體,主要分布于腦內(nèi)[1,3,4,5,6,7,8,9,10,11]。近年來(lái)對(duì)人、嚙齒類(lèi)、羊和豬腦內(nèi)OB-Rb的分布定位研究表明,腦內(nèi)OB-Rb和OB-RbmRNA除分布于下丘腦、大腦皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)、內(nèi)嗅皮質(zhì)、海馬和杏仁核外,還分布于丘腦、小腦和延髓。文獻(xiàn)中僅見(jiàn)用RT-PCR法研究了豬丘腦、小腦和延髓的極后區(qū)內(nèi)OB-RbmRNA的表達(dá),但OB-RbmRNA在上述腦區(qū)內(nèi)分布于那些核團(tuán)和層次,與其功能有何聯(lián)系,在瘦型豬和肥胖型豬有無(wú)差異?文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用原位雜交法研究了豬丘腦、小腦和延髓一些結(jié)構(gòu)內(nèi)OB-RbmRNA的核團(tuán)分布定位,比較瘦肉型的長(zhǎng)白豬與我國(guó)較肥胖的梅山豬上述腦區(qū)內(nèi)OB-RbmRNA分布的差異,為研究OB-Rb與其他神經(jīng)肽的相互關(guān)系、探討leptin作用的部位及其生理功能提供形態(tài)學(xué)資料。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2～3月齡健康長(zhǎng)白三元雜交豬5頭,購(gòu)自南京象山種豬場(chǎng)。2～3月齡健康純種梅山豬5頭,購(gòu)自江蘇省小梅山豬育種基地。1.2寶靈曼公司的紡粘設(shè)備地高辛RNA標(biāo)記試劑盒、原位雜交顯色試劑購(gòu)自寶靈曼公司。Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、EcoRⅠ酶、ApaⅠ酶、SacⅠ酶等試劑購(gòu)自上海生物工程有限公司。1.3rt-pcr法合成4個(gè)細(xì)胞劑-5-內(nèi)酰胺5.用Trizol法提取長(zhǎng)白母豬下丘腦總RNA。根據(jù)GeneBank上登錄的豬leptin長(zhǎng)形受體基因序列(GI3661588),在其保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物,由上海植物生理所合成。引物1:5′-CCTCCAGGAGAGCTGTTCAC-3′(+3360至+3379)。引物2:5′-GGCTCTTGAAGGCTTTCTCA-3′(+3683至+3702)。用RT-PCR法合成和擴(kuò)增cDNA,可獲得一343bp的目的片段。用QIAquickGelExtractionKit回收純化PCR產(chǎn)物,通過(guò)TA克隆,將PCR產(chǎn)物直接連接到pGEM-TEasy載體上,然后轉(zhuǎn)化到E.coliJM-109感受態(tài)細(xì)胞中。隨后,對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行篩選、提取、純化和鑒定(由上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定)。對(duì)測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增、提取,用ApaⅠ酶或SacⅠ酶使之完全線性化后,用地高辛RNA標(biāo)記試劑盒合成Ob-RbcRNA探針。用斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)合成的正意和反意探針濃度。-20℃保存?zhèn)溆?。此?本實(shí)驗(yàn)也使用了少量武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的OB-Rb寡核苷酸探針和原位雜交試劑盒。1.4載玻片的制備(1)取材、固定和切片:實(shí)驗(yàn)豬用20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉(5ml/kg),用4%多聚甲醛/0.1MPBS經(jīng)心或頸總動(dòng)脈灌注,固定后取出丘腦、小腦和延髓,置同一固定液中后固定4～6h,然后浸入20%蔗糖/0.1MPBS中,置4℃直至腦塊完全下沉。腦組織冰凍切片,片厚20μm,裱貼至用多聚賴(lài)氨酸預(yù)處理過(guò)的載玻片上,室溫干燥。(2)原位雜交:切片置37℃烘箱干燥過(guò)夜后,按以下方法進(jìn)行雜交反應(yīng):①雜交前預(yù)處理:切片順次經(jīng)過(guò)0.5%H2O2/甲醇、胃蛋白酶/3%檸檬酸等溶液。②預(yù)雜交和雜交:切片在預(yù)雜交液中預(yù)雜交(40℃)3h。然后切片在雜交液中雜交過(guò)夜(43℃,16h),雜交液中含地高辛標(biāo)記的Ob-Rb反意探針(0.5μg/ml)。③雜交后處理:切片順次經(jīng)過(guò)遞減濃度的SSC(37℃)、封閉液(37℃,30min)、生物素化鼠抗地高辛抗體(37℃,1h)、SABC(37℃,20min)、生物素化過(guò)氧化物酶(37℃,20min)等試劑。④顯色:DAB顯色30min(博士德生物工程有限公司DAB試劑盒)。然后干燥、透明、封片,明視野下觀察結(jié)果、照像。(3)對(duì)照實(shí)驗(yàn):雜交液中含地高辛標(biāo)記的Ob-Rb正意探針(0.5μg/ml)或不加任何探針,其余步驟均相同,結(jié)果為陰性。2結(jié)果2.1r-pcr產(chǎn)物的電泳結(jié)果提取的下丘腦總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到大小為340bp左右的擴(kuò)增片段(圖1),這與設(shè)計(jì)的RT-PCR產(chǎn)物大小一致。2.2巖石學(xué)和酶基因片段的鑒定重組質(zhì)粒及酶切鑒定電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。從電泳結(jié)果可以看出,重組質(zhì)粒(第4泳道)條帶清晰,說(shuō)明純度較高;EcoRⅠ酶切片段(第3泳道)大小約340bp,與預(yù)計(jì)插入的目的基因片段基本一致;ApaⅠ酶(第1泳道)和SacⅠ酶(第2泳道)線性化cDNA完全。2.3綜合固碳序列測(cè)定結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)DNA序列測(cè)定,與已報(bào)道的豬Ob-Rb基因序列(GeneBank,GI3661588,+3360至3702)完全一致。2.4ob-rbrnna標(biāo)記神經(jīng)元含Ob-RbmRNA的標(biāo)記神經(jīng)元呈黃褐色,分布于丘腦、小腦和延髓。在丘腦內(nèi),Ob-RbmRNA標(biāo)記神經(jīng)元幾乎分布于所有核團(tuán),在中線核、丘腦室旁核和丘腦前核內(nèi)出現(xiàn)大量的Ob-RbmRNA標(biāo)記神經(jīng)元,其余核團(tuán)Ob-RbmRNA標(biāo)記神經(jīng)元分布較少(圖3-5)。在小腦,皮質(zhì)三層中均出現(xiàn)Ob-RbmRNA標(biāo)記神經(jīng)元,以梨狀神經(jīng)元層和顆粒層分布較密集(圖6)。在延髓,下橄欖核、孤束核、迷走神經(jīng)背核和舌下神經(jīng)核出現(xiàn)Ob-RbmRNA標(biāo)記神經(jīng)元(圖7-10)。長(zhǎng)白豬與梅山豬上述腦區(qū)內(nèi)Ob-RbmRNA的分布定位無(wú)明顯的差異。標(biāo)記神經(jīng)元呈現(xiàn)多種形態(tài),有多邊形、三角形、梨形、卵圓形等,因腦的部位及層次而異。在典型的Ob-RbmRNA標(biāo)記神經(jīng)元,胞核清楚,色淺,胞質(zhì)深染,特別是核周區(qū)染色較深。說(shuō)明Ob-RbmRNA主要位于胞質(zhì)中,近核區(qū)密度較大。在使用Ob-Rb正意核酸探針或不加探針的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中,上述結(jié)構(gòu)中僅見(jiàn)背底染色,未見(jiàn)明顯的Ob-RbmRNA標(biāo)記神經(jīng)元。3討論3.1ob-rb探針的穩(wěn)定性RT-PCR產(chǎn)物、重組質(zhì)粒和酶切鑒定電泳結(jié)果及重組質(zhì)粒序列測(cè)定結(jié)果表明,自制的Ob-RbmRNA探針與設(shè)計(jì)的探針大小一致,與GeneBank上登錄的豬Ob-Rb基因序列完全相同,說(shuō)明探針具有高度的特異性。本文使用少量博士德公司OB-Rb寡核苷酸探針也得到相同的結(jié)果,但其特異性不如自制探針的高。3.2ob-rb基因表達(dá)許多研究表明,Ob-Rb分布于丘腦、小腦和延髓。Yamamoto等人和Baskin等人報(bào)道,Ob-Rb免疫陽(yáng)性神經(jīng)元廣泛分布于大鼠丘腦內(nèi),特別是丘腦前內(nèi)側(cè)核,Ob-Rb樣蛋白質(zhì)分布于胞漿核周區(qū)。Mercer等人和Udagawa等人分別報(bào)道Ob-RmRNA在小鼠和小鼠胚胎丘腦內(nèi)表達(dá)。Lin等人用RT-PCR法研究發(fā)現(xiàn),Ob-RbmRNA分布于豬丘腦、小腦和延髓的極后區(qū)。Couce等人和Burguera等人報(bào)道,Ob-R免疫陽(yáng)性神經(jīng)元和Ob-RbmRNA分布于人小腦的蒲肯野氏細(xì)胞和齒狀核、下橄欖核和腦神經(jīng)核(舌下神經(jīng)核),特殊的雜交信號(hào)見(jiàn)于神經(jīng)元胞體的胞漿、樹(shù)突和近端軸突內(nèi)。Mercer、等人報(bào)道,Ob-rbmRNA在小鼠外側(cè)臂旁核、孤束核和延髓網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等處表達(dá),但在大鼠的小腦高度表達(dá),在孤束核表達(dá)較少,在外側(cè)臂旁核不表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Ob-RbmRNA分布于豬丘腦、小腦和延髓。在丘腦內(nèi),Ob-RbmRNA標(biāo)記神經(jīng)元幾乎分布于所有核團(tuán),但在中線核、丘腦室旁核和丘腦前核內(nèi)分布較密集。在小腦,皮質(zhì)三層中均出現(xiàn)Ob-RbmRNA標(biāo)記神經(jīng)元,以梨狀神經(jīng)元層和顆粒層分布較密集。在延髓,下橄欖核、孤束核、迷走神經(jīng)背核和舌下神經(jīng)核出現(xiàn)Ob-RbmRNA標(biāo)記神經(jīng)元。Ob-RbmRNA主要位于胞質(zhì)中,近核區(qū)密度較大。本文的結(jié)果與別人在嚙齒類(lèi)、人和豬上獲得的結(jié)果基本一致,但也有一些差異,如本文在小腦皮質(zhì)顆粒層、迷走神經(jīng)背核、孤束核等均觀察到Ob-Rb基因表達(dá),人丘腦中有無(wú)Ob-Rb未見(jiàn)報(bào)道。這些結(jié)果的異同,既反映了Ob-Rb基因表達(dá)種系發(fā)生上的保守性,也反映存在種間差異,但也不排除實(shí)驗(yàn)方法的差異。本文結(jié)果進(jìn)一步肯定了別人的研究結(jié)果,彌補(bǔ)了豬丘腦、小腦和延髓內(nèi)Ob-RbmRNA核團(tuán)分布定位資料的空白,為理解leptin的生理功能提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。3.3不同性能豬的ob-rbmrna的分布Leptin的表達(dá)和分泌,與體脂總量和脂肪細(xì)胞的大小高度相關(guān),其血液濃度通常與體脂的含量成一定比例。長(zhǎng)白三元雜交豬瘦肉率較高,體脂含量相對(duì)較低;梅山豬較肥,體脂含量相對(duì)較高。盡管本文未對(duì)長(zhǎng)白豬與梅山豬丘腦、小腦和延髓內(nèi)Ob-RbmRNA的分布定位做定量分析,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在兩者之間分布定位無(wú)明顯的差異。其原因之一可能是2～3月齡的長(zhǎng)白三元