改良旁核注射微量催產(chǎn)素對(duì)大鼠胃缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制

改良旁核注射微量催產(chǎn)素對(duì)大鼠胃缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制

在大腦的pdv細(xì)胞中，有豐富的脈沖產(chǎn)素（oxytolin，ot），能神經(jīng)細(xì)胞和高密度ot受體。對(duì)于pvn和pvn中的微注射ot，可以減少胃腸道的分泌，緩解潰瘍。近年來(lái),在研究缺血器官的細(xì)胞凋亡及增殖修復(fù)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中,絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶Akt是一個(gè)細(xì)胞存活信號(hào)激酶,它可被胰島素和各種生長(zhǎng)因子通過(guò)PI-3K(phosphoinositide3-kinase)依賴(lài)的機(jī)制激活。激活的Akt作用于它的底物如Bad、糖原合成酶-3及caspases等,使其失活而促進(jìn)細(xì)胞存活。我們?cè)l(fā)現(xiàn)電刺激PVN可減輕胃缺血-再灌注(gastricischemia-reperfusion,GI-R)損傷。本研究探討了Akt在PVN內(nèi)注射微量OT對(duì)GI-R損傷影響中的作用機(jī)制。1材料和方法1.1免疫組織化學(xué)p-Akt(ser473)小鼠單克隆抗體、cleavedcaspase-3(Asp175)兔多克隆抗體(Cellsignaling公司);PowerVisionTM二步法免疫組化檢測(cè)系統(tǒng)、DAB顯色試劑盒、枸櫞酸鹽緩沖鹽溶液、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG和多聚賴(lài)氨酸溶液(北京中杉生物技術(shù)有限公司);堿磷酶底物NBT/BCIP顯色濃縮液(PromegaTechnology公司)。其他試劑均為市售化學(xué)純。1.2pvn微量注射是治療di-r損傷的有效方法4～5月齡、體質(zhì)量230～250g的健康SD大鼠(本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),雌雄不拘。實(shí)驗(yàn)前禁食24h、自由飲水。動(dòng)物在麻醉下(腹腔注射10%水合氯醛400mg/kg),按文獻(xiàn)方法定位PVN或側(cè)腦室后,在2min內(nèi)將OT24、120、600和3000ng/0.3μL微量注射到PVN(每個(gè)劑量組均為6例),或在PVN微量注射OT和GI-R之前,將atosiban1.2μg/5μL注射到側(cè)腦室,以觀(guān)察PVN微量注射OT對(duì)GI-R損傷的保護(hù)效應(yīng)是否由中樞內(nèi)的OT受體介導(dǎo)。溶劑對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。按文獻(xiàn)方法制備大鼠GI-R模型。1.3損傷分?jǐn)?shù)的測(cè)定參照Guth等方法加以改進(jìn)。正常為0分;損傷小于1mm計(jì)1分;1～2mm計(jì)2分;2～3mm計(jì)3分;余類(lèi)推。損傷寬度超過(guò)1mm時(shí),分?jǐn)?shù)加倍。每組大鼠損傷分?jǐn)?shù)的平均值為胃黏膜損傷指數(shù)(gastricmucosaldamageindex,GMDI)。測(cè)量完損傷指數(shù)的胃沿胃大彎剪開(kāi),一半腺胃在冰盤(pán)上快速剪取胃黏膜,置-80℃冰箱備用。另一半腺胃部分在10%中性甲醛固定,石蠟包埋切片后用于免疫組化。1.4免疫組織化學(xué)染色法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色,用圖像分析軟件對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)或表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。1.5caspase的制備將已制備的細(xì)胞蛋白提取液測(cè)其蛋白濃度后,經(jīng)100℃水浴變性5min,按每孔30μL蛋白上樣,經(jīng)10%SDS分離后,以濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至NC膜上,室溫封閉3h,加入一抗(p-Akt1∶200、caspase-31∶1000),4℃過(guò)夜,洗膜后加入相應(yīng)的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育2h,洗膜后加入顯色劑(NBT/BCIP顯色試劑盒),反應(yīng)達(dá)到要求后流水洗滌終止反應(yīng)。條帶經(jīng)圖象處理儀行激光掃描后測(cè)各條帶吸光度(A)值,以相應(yīng)區(qū)帶的吸光度值相對(duì)于對(duì)照組的倍數(shù)表示。1.6統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x—±s)(x—±s)表示,多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析法(ANOVA)。2結(jié)果2.1劑量依賴(lài)的保護(hù)作用單側(cè)PVN內(nèi)微量注射OT(24、120、600和3000ng/0.3μL生理鹽水)后,劑量依賴(lài)性減輕胃黏膜損傷。其中600ngOT可產(chǎn)生非常明顯的保護(hù)效應(yīng)(n=6,P<0.01)(圖1)。因此本實(shí)驗(yàn)采用600ng作為以后實(shí)驗(yàn)的劑量。2.2側(cè)腦室ot受體抗劑的影響側(cè)腦室注射atosiban1.2μg可完全阻斷OT(600ng)減輕GI-R損傷的效應(yīng)(P<0.05,表1)。2.3atosiban檢測(cè)PVN微量注射OT(600ng)可明顯增加GI-R1h后p-Akt蛋白的表達(dá)水平(P<0.01),而atosiban可取消OT的這種效應(yīng)(表1,圖2)。2.4atosiban對(duì)caspase-3蛋白水平和atosiban表達(dá)的影響GI-R1h后胃黏膜caspase-3蛋白水平較高,PVN微量注射OT(600ng)后,caspase-3蛋白水平較GI-R組明顯減少(P<0.01),而atosiban可阻斷OT的這種效應(yīng)(P<0.01)(表1,圖3)。3pvn參與了多通道藥物治療對(duì)ga-r損傷的影響本研究發(fā)現(xiàn)單側(cè)注射微量OT到大鼠PVN后,能劑量依賴(lài)性減輕GI-R損傷,OT受體拮抗劑atosiban可阻斷該效應(yīng),表明OT減輕GI-R損傷的作用可能是通過(guò)PVN內(nèi)的OT受體實(shí)現(xiàn)的。我們?cè)l(fā)現(xiàn)電刺激PVN可減輕GI-R損傷,由于電刺激PVN時(shí)可同時(shí)興奮PVN內(nèi)的多種神經(jīng)元,其中包括OT能神經(jīng)元,并且PVN內(nèi)的OT能神經(jīng)元對(duì)胃的多種生理功能具有調(diào)控作用,如胃電刺激2h后可明顯增加PVN內(nèi)OT陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá);PVN內(nèi)注射OT后,胃酸排出量減少;電刺激PVN對(duì)胃運(yùn)動(dòng)的抑制作用可被迷走神經(jīng)運(yùn)動(dòng)背核或側(cè)腦室內(nèi)注射OT受體拮抗劑所阻斷。因此,我們推測(cè)PVN內(nèi)注射OT后,由于胃酸排出量減少,胃運(yùn)動(dòng)減弱,從而減輕了GI-R損傷。本研究的另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是,PVN給予OT能明顯增加p-Akt在胃黏膜細(xì)胞中的表達(dá)及降低caspase-3的蛋白水平,而atosiban取消了這些效應(yīng),表明OT能通過(guò)激活胃黏膜細(xì)胞Akt信號(hào)通路,從而減輕GI-R損傷。Akt是在體或離體組織器官缺血再灌注后細(xì)胞存活的一個(gè)重要調(diào)控因子。Akt的磷酸化和激活參予多種組織器官缺血預(yù)處理的保護(hù)作用,例如心肌缺血預(yù)處理,而使用PI-3K抑制劑LY294002和wortmannin可阻斷缺血預(yù)處理對(duì)心肌的保護(hù)作用;其他重要臟器如腦、肝臟及腎臟等缺血預(yù)處理時(shí)均可明顯增加p-Akt蛋白表達(dá)水平,降低caspase-3的蛋白水平,從而減輕缺血再灌注損傷。Akt信號(hào)通路的激活也參與其他因素如HGF-MSP減輕腎臟缺血再灌注損傷及脂多糖減輕心肌缺血再灌注損傷的過(guò)程,并伴有caspase-3蛋