引導(dǎo)基因編輯器迎來升級(jí)版

引導(dǎo)基因編輯器迎來升級(jí)版不再是剪刀，而是橡皮和鉛筆近日，中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所（以下簡稱遺傳發(fā)育所）高彩霞研究組與合作者，在植物中成功建立了一種更高效、廣適的新型基因組引導(dǎo)編輯系統(tǒng)——增強(qiáng)型植物引導(dǎo)編輯器（ePPE），有助進(jìn)一步提高基因組編輯技術(shù)在內(nèi)源基因上進(jìn)行精準(zhǔn)編輯的效率。研究人員還利用該系統(tǒng)創(chuàng)制了抗除草劑的水稻新材料。3月24日，相關(guān)成果在線發(fā)表于《自然—生物技術(shù)》?！斑@項(xiàng)工作論證充分且十分有趣?！币晃粚徃迦藢懙?，“引導(dǎo)編輯器提供了對(duì)基因組進(jìn)行定制化更改的能力，克服了堿基編輯器替代能力有限的問題。作者描述的引導(dǎo)編輯器可在植物基因組上將引導(dǎo)編輯效率提高數(shù)倍?！薄?.0時(shí)代”的引導(dǎo)編輯在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，基因組編輯技術(shù)可以更方便、快捷、精準(zhǔn)地進(jìn)行作物育種和改良。通過基因組編輯可以不添加任何外源性的基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組自身序列的修改，大大節(jié)省時(shí)間和工作量。事實(shí)上，如今的基因組編輯技術(shù)已經(jīng)不僅僅是一把“剪刀”的概念。論文通訊作者、遺傳發(fā)育所研究員高彩霞在接受《中國科學(xué)報(bào)》采訪時(shí)介紹，進(jìn)化至“2.0時(shí)代”的堿基編輯和引導(dǎo)編輯還可以是一塊“橡皮”或一支“鉛筆”?！叭绻粋€(gè)序列有點(diǎn)多，你可以把它剪掉；如果組成DNA的ATCG有一個(gè)錯(cuò)了，你可以像用一塊‘橡皮’一樣把它擦掉，然后用‘鉛筆’寫入正確的，而‘鉛筆’‘橡皮擦’是不留在細(xì)胞里的?！彼扔髡f。更具體地說，引導(dǎo)編輯系統(tǒng)（PE）是一種能在基因組的靶位點(diǎn)處實(shí)現(xiàn)任意堿基替換和小片段精準(zhǔn)刪除、插入的新型基因組編輯工具，也是基因組編輯領(lǐng)域的重大變革。2020年，高彩霞團(tuán)隊(duì)率先在水稻和小麥中成功建立并優(yōu)化了適用于植物的引導(dǎo)編輯器（PPE），開發(fā)了植物引導(dǎo)編輯向?qū)NA（pegRNA）設(shè)計(jì)網(wǎng)站——PlantPegDesigner，極大提高了引導(dǎo)編輯效率并簡化了植物pegRNA的設(shè)計(jì)流程。他們還通過全基因組重測(cè)序發(fā)現(xiàn)，PPE系統(tǒng)在全基因組水平上具有很高的特異性。這些研究為PE在植物領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。盡管如此，PE目前在植物中的編輯效率仍不夠高，且有很大的靶點(diǎn)依賴性?！耙簿褪钦f在一些內(nèi)源靶位點(diǎn)上，現(xiàn)有的PE效率仍然很低，尤其是針對(duì)一些較長片段的刪除、插入等復(fù)雜編輯類型?！闭撐牡谝蛔髡?、高彩霞課題組博士生劉怡靜向《中國科學(xué)報(bào)》解釋道。這些短板嚴(yán)重限制了引導(dǎo)編輯在植物中的廣泛應(yīng)用。因此，如何使PE突破現(xiàn)有的限制，提升引導(dǎo)編輯技術(shù)的高效性、廣適性是一個(gè)研究重點(diǎn)。尋找更高效“突破點(diǎn)”為此，他們先后構(gòu)思嘗試了多種不同策略，最終通過對(duì)蛋白的理性設(shè)計(jì)獲得了能夠穩(wěn)定提高效率的ePPE的版本。不同于大多數(shù)已報(bào)道的通過優(yōu)化pegRNA提高引導(dǎo)編輯效率的思路，ePPE側(cè)重于對(duì)PE的蛋白組分進(jìn)行改造。通過對(duì)不同策略構(gòu)建的多種PE進(jìn)行篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)，刪除PE中逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLVRT（依賴RNA的DNA聚合酶）的RNA核酸酶H（RNaseH）結(jié)構(gòu)域或在M-MLVRT的N端融合病毒核衣殼蛋白（NC），可分別將PPE的編輯效率提高2倍和3.2倍。研究人員進(jìn)一步整合以上兩種優(yōu)化策略，開發(fā)出了ePPE。相比于PPE，在堿基替換、小片段插入和刪除以及較大片段的插入和刪除等多種編輯類型下，ePPE編輯效率平均可提高5.8倍，且不增加脫靶及副產(chǎn)物的發(fā)生?！癳PPE作為一個(gè)更高效、廣適的PPE，可以算作是一支流暢的‘鉛筆’、一塊干凈好用的‘橡皮’了?！眲⑩o表示。對(duì)此，另一位審稿人也表示：“這項(xiàng)研究在植物基因組編輯領(lǐng)域作出了及時(shí)而重要的貢獻(xiàn)。”種質(zhì)創(chuàng)新“小試牛刀”除了高效和廣適性，合作團(tuán)隊(duì)通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把ePPE與該課題組此前報(bào)道的dual-pegRNA策略和美國哈佛大學(xué)、博德研究所教授劉如謙實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的epegRNA策略相結(jié)合時(shí)，可進(jìn)一步提高PE在內(nèi)源基因上進(jìn)行精準(zhǔn)編輯的效率。這些特性在很大程度上拓展了其應(yīng)用范圍?；诖?，研究人員利用ePPE系統(tǒng)成功創(chuàng)制了對(duì)兩種除草劑（甲咪唑煙酸和煙嘧磺?。┚邆淇剐缘乃拘虏牧?。劉怡靜介紹，乙酰乳酸核酶（ALS）基因是支鏈氨基酸合成途徑中的第一個(gè)酶，諸如磺酰脲類、咪唑啉酮、三唑嘧啶等除草劑都是該酶的抑制劑，通過抑制支鏈氨基酸的合成導(dǎo)致植物死亡，從而除去很多雜草。同時(shí)，這類除草劑對(duì)哺乳動(dòng)物毒性非常小，應(yīng)用價(jià)值很高。“通過在ALS基因的特定位置上產(chǎn)生單個(gè)氨基酸的突變，可以獲得抗性酶，賦予植物這一類除草劑抗性?！彼硎?，研究團(tuán)隊(duì)選擇了Trp548Met突變作為目標(biāo)靶點(diǎn)，該位點(diǎn)突變雖然可通過傳統(tǒng)誘變的方法獲得，但耗時(shí)耗力，需要巨大的工作量。而使用基因編輯方法不存在誘變產(chǎn)生的其他有害突變，沒有脫靶，也無需回交，突變體植株可快速投入應(yīng)用生產(chǎn)。研究人員在這一位點(diǎn)將編碼色氨酸的“TGG”密碼子修改為編碼甲硫氨酸的密碼子“ATG”，通過“鉛筆”+“橡皮擦”，同時(shí)實(shí)現(xiàn)“T到A”和“G到T”的突變。據(jù)介紹，這是目前除引導(dǎo)編輯外的其他編輯工具所不能實(shí)現(xiàn)的。最終他們以高出原始PPE5.6倍的效率成功獲得了抗除草劑的水稻新材料，新材料在甲咪唑煙酸和煙嘧磺隆兩種除草劑的篩選下有非常好的抗性表型?！拔覈m然在動(dòng)植物基因編輯技術(shù)研發(fā)和應(yīng)用上居世界前列，但原始專利嚴(yán)重缺位，核心專利及底層技術(shù)大多被以美國為首的西方國家壟斷，產(chǎn)業(yè)安全面臨嚴(yán)重挑戰(zhàn)，加快推動(dòng)基因組編輯基礎(chǔ)研究是國家發(fā)展和戰(zhàn)略布局的迫切需求?！闭撐墓餐ㄓ嵶髡摺⑦z傳發(fā)育所研究員曹曉風(fēng)院士在接受《中國科學(xué)報(bào)》采訪時(shí)曾說。而新系統(tǒng)的開發(fā)有望推動(dòng)引導(dǎo)編輯在農(nóng)業(yè)