大鼠丘腦束旁核神經(jīng)元5-h1a受體mrna不同時間點表達(dá)的變化

大鼠丘腦束旁核神經(jīng)元5-h1a受體mrna不同時間點表達(dá)的變化

心肌缺血是缺血性心臟?。╥wd）的直接導(dǎo)致因素。機(jī)體對心肌缺血的感受是由復(fù)雜的神經(jīng)、化學(xué)和生物學(xué)活動完成的。5-HT(5-羥色胺)是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)痛作用的神經(jīng)遞質(zhì),5-HT能神經(jīng)元在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布較為廣泛。5-HT的鎮(zhèn)痛作用是通過與其受體結(jié)合來實現(xiàn)的。5-HT1A受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體族,其廣泛分布于腦內(nèi)與疼痛有關(guān)的結(jié)構(gòu)。丘腦束旁核(parafascicularnucleus,Pf)是內(nèi)臟痛覺重要的整合中樞,以往對Pf的研究多采用神經(jīng)電生理的方法,用原位雜交的方法來研究心肌缺血不同時點大鼠Pf神經(jīng)元5-HT1A受體mRNA表達(dá)變化的研究鮮有文獻(xiàn)報道。本實驗旨在采用原位雜交技術(shù)來研究急性心肌缺血時大鼠Pf神經(jīng)元5-HT1A受體mRNA表達(dá)的變化,以探討在急性心肌缺血傷害性刺激作用下,大鼠Pf中5-HT1A受體在痛覺調(diào)制中所起的作用及其機(jī)制。1材料和方法1.1小鼠骨髓內(nèi)血流學(xué)模型采用健康成年雄性SD大鼠24只(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),體質(zhì)量260～280g。隨機(jī)分為四組:對照組(C組)、扎閉冠狀動脈(coronaryarteryocclusion,CAO)1h組(CAO1h組)、扎閉冠狀動脈3h組(CAO3h組)、扎閉冠狀動脈6h組(CAO6h組)。將動物麻醉(25%烏拉坦1.2g/kg,ip)后行氣管切開,控制呼吸(RR75次/min,VT8mL/kg)。在左胸骨旁第4～5肋間作1cm長切口,暴露心臟,剪開心包膜后用7-0無損傷縫線結(jié)扎冠狀動脈左前降支(對照組動物僅在冠狀動脈下穿線,不結(jié)扎),并計時。然后逐層關(guān)胸,行胸腔負(fù)壓引流后,解除人工通氣,動物恢復(fù)自主呼吸。每小時經(jīng)尾靜脈補(bǔ)給林格液1mL。所有手術(shù)切口均用0.125%布比卡因施以局部麻醉,總量不超過1mL。1.2開顱腦表面pf、德國濕、細(xì)腦表面下pf、ld5的微電極圖5將心肌缺血的大鼠固定于立體定位儀(ST-7型,日本成茂產(chǎn)品)上。依照大鼠腦立體定位圖譜(以前囟為0點,距前囟向尾側(cè)4.0～4.2mm、距中縫旁開0.8～1.2mm、腦表面下5.5～6.5mm),鉆孔開顱顯露腦組織,用單腔玻璃管微電極(尖端直徑0.5～1.0μm)由微推進(jìn)儀從腦表面垂直刺入,到達(dá)Pf位置后以微電泳(10μA,20min)法行ChicagoBlue電極尖端位置標(biāo)定。到達(dá)規(guī)定的時點后處死動物,取出心臟和大腦做組織學(xué)檢查和鑒定。1.3腦塊沉底、固定經(jīng)主動脈根部灌注4℃4%多聚甲醛固定液300mL,取腦修塊,把含有Pf的腦塊置于前述固定液中后固定10min;然后入4℃30%蔗糖(0.1mol/LPBS配制)中過夜至腦塊沉底。然后用恒冷箱切片機(jī)(LeicaCM-1850,德國Leica公司)行15μm厚冠狀冰凍連續(xù)切片,室溫下空氣中風(fēng)干,-70℃保存。1.4制備7個月期雜交的設(shè)樣雜交前,室溫平衡,孵育在2×SSC5min×2;切片入新鮮配制的0.3%H2O2的甲醇溶液中滅活內(nèi)源性的過氧化物酶,室溫下30min,雙蒸水洗滌3次;切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶以暴露mRNA核酸片段,37℃120s,原位雜交用PBS(0.5mol/LPBS)沖洗5min×3,雙蒸水洗1次;每張切片滴加20μL預(yù)雜交液,恒溫箱內(nèi)孵育3h,吸去多余液體,不洗;每張切片滴加20μL雜交液,加蓋原位雜交專用蓋玻片,37℃恒溫箱內(nèi)雜交12h,揭掉蓋玻片,2×SSC洗滌5min×2,0.5×SSC洗滌15min×1,0.2×SSC洗滌15min×1;滴加封閉液,37℃30min,吸去多余液體,不洗;滴加生物素化鼠抗地高辛37℃60min,0.5mol/LPBS沖洗5min×4;滴加SABC,37℃20min,0.5mol/LPBS沖洗5min×3;滴加生物素化過氧化物酶,37℃2min,0.5mol/LPBS沖洗5min×4;DAB顯色,鏡下適時終止,蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性塑膠封片。每一組均設(shè)立試劑(陰性)對照(未使用含有寡核苷酸探針的5-HT1A受體mRNA原位雜交用的雜交液)。5-HT1A受體mRNA原位雜交檢測試劑盒、原位雜交專用蓋玻片、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司,DEPC購自sigma公司。1.5半定量分析用BX51-型Olympus光學(xué)顯微鏡高倍鏡下(×400)結(jié)合IDA-2000數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)(中科院北京空?？萍及l(fā)展有限公司)對Pf部位5-HT1A受體mRNA染色陽性的細(xì)胞進(jìn)行半定量分析。通過組織切片上的電極標(biāo)記點確認(rèn)Pf位置,隨機(jī)選取以標(biāo)記點為中心的周圍6個視野,每張切片隨機(jī)分析包括標(biāo)記點在內(nèi)的7個視野。1.6統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包行單因素方差分析,并做多重比較。如果方差齊,采用LSD法;如果方差不齊,則采用Games-Howell法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1原始位異交3-ht1a受體由心肌缺血引發(fā)的心絞痛是常見的臨床癥狀,而心肌缺血本身是一個非常復(fù)雜的病理生理過程。在心肌缺血性疼痛的產(chǎn)生、傳導(dǎo)和調(diào)制過程中,伴隨著大量神經(jīng)遞質(zhì)及其受體的活動。5-HT及其受體是與痛覺調(diào)制有重要關(guān)系的經(jīng)典的神經(jīng)遞質(zhì)受體系統(tǒng),5-HT主要是通過與5-HT受體結(jié)合來發(fā)揮其作用。關(guān)于5-HT在脊髓以上水平對內(nèi)臟痛覺的調(diào)制作用研究較少,現(xiàn)有結(jié)果較為一致,即腦內(nèi)5-HT主要參與鎮(zhèn)痛作用,但不同類型5-HT受體在痛覺生理和病理生理中則發(fā)揮不同的作用。目前發(fā)現(xiàn),哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中的5-HT受體至少分為7個族14個亞型,這些受體均已被克隆成功。腦內(nèi)5-HT1A受體則主要分布于海馬、中縫大核(NMR)、中縫背核(DRN)、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)、嗅球、隔區(qū)、腳間核、杏仁核、下丘腦和整個皮層,在脊髓則分布于從頸髓到骶髓的全層,其中以低位胸、腰和骶髓背角的I～V層最多;而5-HT神經(jīng)元胞體主要集中于中腦下部、腦橋上部和延髓的中縫核群。5-HT能神經(jīng)元的傳出纖維分上行和下行兩部分。向上可投射到大部分邊緣腦區(qū)、PAG、下丘腦后區(qū)、小腦,向下則投射到脊髓背角、側(cè)角和前角。盡管分布如此廣泛,但中樞神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT只占全身總量的1%～2%。5-HT1A受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體族,其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用都是通過與Gp(Gs或Gi)偶聯(lián)激活或抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC),使細(xì)胞內(nèi)c-AMP水平發(fā)生改變,導(dǎo)致K+電導(dǎo)降低或Cl-電導(dǎo)增加等;然而Peroutka認(rèn)為,5-HT1A受體僅與Gi相偶聯(lián)而抑制AC,開放胞膜K+離子通道,不能與Gs相偶聯(lián)激動AC。此外,5-HT1A受體還有可能與Go偶聯(lián),關(guān)閉Ca2+離子通道。因此,5-HT1A受體在受體水平是多功能的。脊髓是傷害性刺激傳導(dǎo)和調(diào)制的必經(jīng)通路,但關(guān)于5-HT1A受體在脊髓水平的痛覺調(diào)制中究竟是介導(dǎo)抗傷害作用、還是介導(dǎo)痛覺易化作用仍然存在較多的矛盾,5-HT1A受體有可能單獨(dú)或者與5-HT1B受體共同作用而介導(dǎo)鎮(zhèn)痛或痛覺易化作用。大鼠脊髓蛛網(wǎng)膜下腔注射5-HT1A受體拮抗藥,可顯著阻斷側(cè)腦室注射選擇性μ型激動藥,羥甲芬太尼的鎮(zhèn)痛效應(yīng),提示脊髓5-HT1A受體參與腦內(nèi)μ型激動藥,所產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。Pf是內(nèi)臟痛覺感受、調(diào)制和整合的重要中樞。因此在脊髓上水平,尤其是在Pf水平來研究5-HT1A受體作用及其機(jī)制的研究就顯得更為必要。研究表明,Pf內(nèi)含有豐富的5-HT能神經(jīng)末梢和受體。5-HT1A受體可分布在突觸前膜或突觸后膜,若分布在5-HT神經(jīng)元胞體上,則稱為自身受體。腦干的5-HT1A受體激活抑制5-HT神經(jīng)元的電沖動,從而使5-HT神經(jīng)遞質(zhì)釋放減少;而分布在突觸后膜上的5-HT1A受體激動后除了調(diào)節(jié)5-HT的釋放外,還能引起NE的釋放,從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。然而,也有大量的研究認(rèn)為,5-HT1A受體對抗傷害感受起抑制作用,但關(guān)于5-HT1A受體激動藥削弱嗎啡鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制尚不清楚。本實驗研究結(jié)果顯示,對照組Pf中5-HT1A受體mRNA的表達(dá)處于較低水平,而CAO后則顯著增加。Korzeniewska等的研究表明,5-HT1A受體在內(nèi)臟痛模型的大鼠行為反應(yīng)中發(fā)揮著重要的抑制性作用。雷亞娟等的研究提示,5-HT1A受體激動藥烏拉地爾對Pf痛敏神經(jīng)元的放電具有抑制作用,并被5-HT拮抗藥美西麥角所逆轉(zhuǎn)。張玉秋等采用原位雜交的方法觀察到5-HT1A受體mRNA在正常大鼠的脊髓背角、NRM、DRN和PAG內(nèi)均有少到中等程度的表達(dá),角叉菜膠致炎后3h,上述部位5-HT1A受體mRNA的表達(dá)明顯增多,8h達(dá)高峰,24h仍有較高表達(dá)。此外,原位雜交結(jié)合免疫組化雙重標(biāo)記法研究顯示,這些部位的5-HT1A受體mRNA主要分布在5-HT陽性神經(jīng)元上。本實驗中則觀察到CAO1h后Pf5-HT1A受體mRNA表達(dá)即顯著增加,可能是因為使用的動物模型不同、觀察部位和觀察時點也不一樣所導(dǎo)致的。冠狀動脈阻塞造成心肌缺血后,隨著心臟代謝功能的變化,各種痛敏介質(zhì)和促炎物質(zhì)通過多種途徑釋放出來,通過外周和中樞敏感化的機(jī)制,造成大量化學(xué)性傳入通路的激活,從而引起心絞痛的傳入沖動增加,通過Pf與PAG、NMR、腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、大腦皮層以及脊髓灰質(zhì)等之間廣泛的神經(jīng)纖維聯(lián)系,使其接受的傷害性刺激也增加,最終導(dǎo)致Pf5-HT1A受體mRNA的轉(zhuǎn)錄和合成增加、表達(dá)增多。這種5-HT1A受體合成和表達(dá)的增加很可能是通過負(fù)反饋作用來限制炎癥和疼痛導(dǎo)致的5-HT的過度釋放,從而使內(nèi)源性5-HT的作用保持某種平衡。劉保堅等認(rèn)為,中樞5-HT1A受體激動后,通過抑制5-HT的釋放來調(diào)節(jié)交感和迷走神經(jīng)的活動,使交感神經(jīng)活性降低,心肌缺血傷害性刺激傳入沖動減少。新近的研究也表明,激動腦內(nèi)5-HT1A受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng),并且與ATP敏感的K+離子通道的開放有關(guān)。本實驗中還觀察到:CAO后隨著心肌缺血時間延長,大鼠Pf中5-HT1A受體mRNA的表達(dá)也逐漸增加,在CAO后6h表達(dá)明顯高于CAO后3h和1h。分析其原因,可能是因為心肌缺血引起心肌局部組織損傷,各種炎性物質(zhì)、細(xì)胞因子和痛敏介質(zhì)引發(fā)心肌炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致心絞痛的外周敏感化,并通過所謂的“神經(jīng)源性炎癥”機(jī)制引起心臟神經(jīng)纖維末梢中P物質(zhì)和CGRP的釋放,進(jìn)一步加重心肌組織損傷。另一方面,心肌組織損傷以及炎癥反應(yīng)時,NMDA受體和神經(jīng)激肽受體介導(dǎo)了炎性內(nèi)臟痛的中樞敏感化,從而導(dǎo)致心臟傳入沖動的進(jìn)一步增多。本實驗的觀察時限為6h,未能觀察到這種增加趨勢的全過程,有待于進(jìn)一步研究。4大鼠pf5-ht1a受體mrna單純心肌缺血即可明顯誘發(fā)大鼠Pf部位5-HT1A受體mRNA的表達(dá),5-HT1A受體參與了急性心肌缺血性疼痛/傷害刺激在大鼠Pf的調(diào)制。組織切片背底清晰,呈淺藍(lán)色或不著色,對照組中有染色陽性神經(jīng)元無規(guī)律地零星、散在分布,胞漿不著色或輕度著色,胞核淺淡,神經(jīng)元形