純鈦種植體表面經(jīng)微弧氧化工藝處理后的成骨效能

純鈦種植體表面經(jīng)微弧氧化工藝處理后的成骨效能

自半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，純鈦材料在植物的臨床應(yīng)用中發(fā)揮著良好的作用，具有良好的骨生物適應(yīng)性、耐腐蝕性和易于加工的財(cái)務(wù)費(fèi)用。它可以與骨組織形成一定程度的骨結(jié)合（osetintigra），并以各種優(yōu)點(diǎn)（如黑面包面動(dòng)物植物）形成口腔栽培。主要以基本材料為基礎(chǔ)。但在不斷的使用研究中發(fā)現(xiàn),純鈦種植體的表面生物活性差,缺乏骨誘導(dǎo)作用,與周?chē)墙M織難以形成強(qiáng)有力的化學(xué)性結(jié)合而成為口腔醫(yī)學(xué)種植領(lǐng)域中一直未能解決的難題之一。同時(shí)在人體生理環(huán)境中及負(fù)載條件下純鈦種植體的耐磨性較差,并且容易向周?chē)M織內(nèi)釋放金屬離子形成比較明顯的金屬腐蝕圈,這些缺點(diǎn)都嚴(yán)重的影響了鈦種植體的臨床成功率,并明顯制約了種植技術(shù)的廣泛開(kāi)展。持續(xù)性的研究顯示:由于與周?chē)M織發(fā)生金屬反應(yīng)的相互作用區(qū)主要在種植體表面,因此如何通過(guò)種植體表面改性的方法,改善鈦及其鈦合金的耐磨性、耐腐蝕性,并著重增大增強(qiáng)純鈦種植體表面的生物活性,進(jìn)而提高種植體的骨結(jié)合強(qiáng)度,縮短愈合時(shí)間則成為口腔種植學(xué)領(lǐng)域里研究的熱點(diǎn)課題。因而最近人們開(kāi)始在種植體研究中嘗試開(kāi)展新的表面改性方法,使鈦及鈦合金植入材料表面具備有良好的生物活性,從而能得以增強(qiáng)純鈦種植體的早期或即刻承重力,最終達(dá)到牢固的骨愈合。微弧氧化(Micro-arcOxidation,MAO)全稱(chēng)等離子體微弧氧化,它是一種直接在有色金屬表面原位生成陶瓷層的新技術(shù)。將AL、Mg、Ti等金屬樣品放入電解質(zhì)溶液中,通電后,金屬表面立即生成很薄的一層金屬氧化物絕緣膜。在微弧氧化過(guò)程中溶液中電解質(zhì)離子不僅起導(dǎo)電作用,還要參與微弧放電區(qū)的物理化學(xué)反應(yīng),進(jìn)入氧化膜層中。因此可以利用這一現(xiàn)象可以將Ca、P元素引入到鈦氧化膜中。其氧化產(chǎn)物是一種多孔狀,與基質(zhì)結(jié)合牢固、具有陶瓷特性的氧化膜。因此利用微弧氧化技術(shù)處理純鈦種植體后可以得到富含鈣磷元素,表面疏松多孔,并逐漸向與基體結(jié)合牢固的致密氧化層過(guò)渡,具有一定梯度分布的復(fù)合二氧化鈦膜表面。其物理、化學(xué)特性與微弧氧化處理時(shí)電參量的選擇、電解液的配方以及樣品自身的特性有關(guān),經(jīng)微弧氧化工藝處理的種植體與原材料基質(zhì)本身相比,其耐磨、耐腐蝕、電絕緣等性能都得到明顯改善。本實(shí)驗(yàn)利用微弧氧化技術(shù)工藝構(gòu)建出一種新的粗化、活化的純鈦基體二氧化鈦膜表面,并且檢測(cè)觀察其表面性狀,進(jìn)而再采用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)評(píng)定其生物相容性和成骨效能。1材料和方法1.1試驗(yàn)組和方法純鈦組(華南理工大學(xué)材料學(xué)院提供)為對(duì)照組,微弧氧化組(將對(duì)照組的純鈦種植體經(jīng)微弧氧化工藝處理)為試驗(yàn)組,均制備成長(zhǎng)為10mm,直徑為4mm的圓柱狀種植體。1.2先鋒vi小瓶消毒兩種不同的種植體共36枚,經(jīng)丙酮超聲清潔5min,無(wú)水乙醇超聲清潔5min,去離子水清洗后,密封包裝于潔凈的先鋒VI小瓶中高壓蒸氣消毒后備用。1.3分組及命名將9只成年Beagle犬(中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),雌雄不拘,平均體質(zhì)量在10～12kg,隨機(jī)分配到甲、乙、丙3個(gè)組(對(duì)應(yīng)取材時(shí)間為4、8、12周),每組3只,組內(nèi)分別編號(hào)為1、2、3。每只犬下頜可以植入4顆種植體(左右側(cè)各兩顆),每只試驗(yàn)動(dòng)物左,右兩側(cè)分別種入純鈦和微弧氧化兩種種植體。1.4骨髓細(xì)胞處理采用體積分?jǐn)?shù)為3%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,劑量為30mg/kg體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)Beagle犬仰臥位位于手術(shù)臺(tái),固定頭部四肢。術(shù)區(qū)消毒(以體積分?jǐn)?shù)為0.1%的新潔爾滅行口腔內(nèi)消毒,面部以體積分?jǐn)?shù)為3%的碘酒,體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒),鋪巾。嚴(yán)格遵守外科無(wú)菌操作技術(shù),沿下頜骨下緣切開(kāi)皮膚,鈍性分離皮下組織肌肉,充分暴露下頜骨。位于左下頜第一磨牙下方球鉆定位第一種植位置,(第二位置在第一位置近中1cm處),擴(kuò)孔鉆逐級(jí)擴(kuò)大種植釘孔,鉆時(shí)以生理鹽水持續(xù)冷卻,以防止骨灼傷。最后完成洞深約10mm,直徑約為4mm。鉆孔時(shí)盡量使釘洞方向保持平行并注意防止頰舌側(cè)穿。嚴(yán)密縫合粘骨膜瓣。術(shù)中補(bǔ)液200mL糖鹽+先鋒Ⅵ1g。術(shù)后3日連續(xù)每天肌注2g/d,連續(xù)一周半流飲食。每天清洗傷口,一周后拆線,改普食。動(dòng)物圈養(yǎng)于中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。分別于4、8、12周氯安酮肌注麻醉動(dòng)物后用氣栓法處死動(dòng)物,截取下頜骨標(biāo)本固定于體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛液。手術(shù)刀、鑷子、組織剪、持針器、止血鉗、骨膜剝離器、不銹鋼直尺,牙周探針、BLB種植工具、牙科專(zhuān)用微型電機(jī)。1.5種植體骨結(jié)合力的測(cè)定觀察術(shù)后試驗(yàn)動(dòng)物的麻醉清醒情況,飲食情況,行動(dòng)情況。每天清潔傷口一次,觀察傷口愈合情況,檢查種植區(qū)有無(wú)感染情況。檢查雙側(cè)下頜區(qū)有無(wú)腫大淋巴結(jié)。取材后,去除下頜骨上的牙齦及軟組織,顯露種植體,肉眼觀察種植體愈合情況,注意種植體有無(wú)松動(dòng),脫落。檢查周?chē)浗M織情況。所有標(biāo)本均在取材后2h內(nèi)拍攝X光片(牙科X攝片機(jī),德國(guó)),拍攝條件:40kV/100mA、曝光時(shí)間0.05s拍攝距離為5cm。分別觀察手術(shù)后第4周、第8周、第12周種植體與下頜骨骨體的結(jié)合情況,種植體周?chē)怯捕?、骨密度情況,特別注意觀察有否骨壞死及吸收等現(xiàn)象。取材后24h內(nèi)完成頂出實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前用金剛砂片切開(kāi)種植體周?chē)墙M織,修整種植體兩端多余骨質(zhì),顯露種植體兩端。使用采用WE-10型萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(日本)測(cè)種植體骨結(jié)合力。將帶種植體骨塊固定于拉伸機(jī)的測(cè)力底座,使測(cè)力桿方向與拉伸長(zhǎng)軸一致,然后用測(cè)力夾具夾住測(cè)力桿上端,儀器調(diào)零后,開(kāi)始加力,以0.5mm/min速度拉伸,記錄種植體被拉出時(shí)的最大值,作為骨結(jié)合的值。計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)不同處理組的結(jié)合力均值,并進(jìn)行不同處理組結(jié)合力的比較。使用SPSS10.00統(tǒng)計(jì)軟件利用多因素方差分析進(jìn)行分析比較。將2個(gè)月時(shí)標(biāo)本用金剛砂片片切成骨組織帶種植釘?shù)墓菈K橫截面。戊二醛固定標(biāo)本一周后,PBS液中沖洗標(biāo)本20次。再用PBS液浸泡沖洗后標(biāo)本24h,按以下方式制樣:(1)上行脫水:用體積分?jǐn)?shù)為50%的酒精浸泡標(biāo)本10min、體積分?jǐn)?shù)為70%酒精浸泡標(biāo)本10min,體積分?jǐn)?shù)為90%酒精浸泡標(biāo)本10min、體積分?jǐn)?shù)為100%的丙酮(加無(wú)水CaCl2)30min;(2)置換:醋酸異戊酯(加無(wú)水CaCl2)20min;(3)噴金:取觀察面向上,慢速噴金。通過(guò)日立S-520掃描電鏡觀察種植體-骨結(jié)合面情況。1.5.6組織學(xué)觀察在種植后4周、8周、12周各處死動(dòng)物三只,獲取帶種植體的骨組織標(biāo)本,用體積分?jǐn)?shù)為10%的福爾馬林固定。將標(biāo)本用金剛砂片分切后,各組共6份標(biāo)本,其中一分標(biāo)本做大體組織橫截面觀察(4周份標(biāo)本)、電鏡掃描(8周份標(biāo)本)或者不脫鈣硬組織切片(12周份標(biāo)本)。不脫鈣硬組織切片(12周標(biāo)本):將帶種植體骨塊用丙酮脫水(更換三次丙酮,12h一次),樹(shù)脂包埋,用硬組織鋸氏切片機(jī)(Leitz-1600德國(guó))制作帶種植體的切片,切成1mm厚的4份標(biāo)本,然后逐級(jí)研磨成厚度150μm的切片,采用甲苯安藍(lán)染色,觀察種植體-骨結(jié)合界面。顯微鏡觀察種植體骨界面處骨質(zhì)形成情況。采用APOLLODN-35OO計(jì)算機(jī)輔助圖象處理系統(tǒng)對(duì)組織切片作定量組織學(xué)測(cè)量計(jì)算骨性結(jié)合率(OR)。脫鈣骨組織切片:每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每種材料其余三份標(biāo)本作頂出實(shí)驗(yàn)后,將骨組織用體積分?jǐn)?shù)為14%硝酸脫鈣后,依次用100%、90%、80%、70%酒精下行梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。用Leica自動(dòng)切片機(jī)切取厚6μm的切片。HE染色。顯微鏡觀(Axiovision4.0德國(guó))觀察種植體骨界面新骨形成情況,并用Axioplan2Imaging軟件拍攝鏡下切片。2結(jié)果2.1半流質(zhì)、行動(dòng)能力9只犬均術(shù)后1h左右麻醉清醒,即日即可進(jìn)食半流質(zhì),行動(dòng)良好,無(wú)其他不適。每天清洗傷口一次,觀察傷口愈合良好,種植區(qū)均未見(jiàn)明顯感染,未有種植體脫落,雙側(cè)頜下區(qū)未捫及腫大淋巴結(jié)。2.2覆蓋釘?shù)倪x擇所有種植釘(36枚)均未發(fā)生松動(dòng),脫落,存留完好,種植體與骨結(jié)合良好部分種植釘頂部被骨皮質(zhì)覆蓋。種植體周?chē)浗M織未見(jiàn)感染、化膿、壞死(見(jiàn)圖1)。2.3骨與種植體的連接可以看到標(biāo)本(4周)時(shí),骨-種植體之間結(jié)合良好,圖2中可以看到種植體靠近骨髓腔的一面有新骨形成,圖3可以看到骨與種植體直接連接,沒(méi)有看到明顯的間隙存在。2.4種植體密度和密度所有標(biāo)本均在取材后2h內(nèi)拍攝X光片,4周時(shí),可見(jiàn)純鈦種植體周?chē)钥梢?jiàn)明顯的低密度區(qū),尤其以上部明顯,兩側(cè)緣與骨結(jié)合處也可見(jiàn)密度明顯低于正常區(qū)域。微弧氧化組可見(jiàn)種植釘周?chē)琴|(zhì)密度稍低于正常骨密度,頂端見(jiàn)明顯低密度暗影。8周時(shí),可見(jiàn)純鈦組種植體頂端仍見(jiàn)低密度暗影,但較4周時(shí)密度增高,兩側(cè)緣未見(jiàn)明顯低密度暗影。微弧氧化組種植體周?chē)匆?jiàn)明顯低密度暗影。12周時(shí),兩組種植體周?chē)匆?jiàn)明顯低密度暗影,但是純鈦組種植體周?chē)芏纫缘陀谖⒒⊙趸M。微弧氧化組種植體周?chē)敲芏纫呀?jīng)接近正常骨組織,骨密度均勻,骨小梁排列整齊。2.5小鼠骨結(jié)合力、微弧氧化組骨結(jié)合力明顯低于純鈦組兩種種植體表面骨結(jié)合強(qiáng)度存在明顯差異,總的趨勢(shì)是微弧氧化組骨結(jié)合力明顯強(qiáng)于純鈦組。兩種種植體的骨結(jié)合力有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。2.6組織結(jié)合和表面涂層從掃描電鏡照片可以看到微弧氧化組形成比較厚的新骨,并且新骨與種植體和原來(lái)成熟的骨組織結(jié)合非常緊密,基本看不到間隙。同時(shí)也可以看到表面涂層與鈦基體沒(méi)有明顯的界限。純鈦種植體表面也可以看見(jiàn)新骨形成,但是相比較前兩組新骨形成的寬度明顯窄,新骨由于強(qiáng)度不夠,故制備掃面橫截面時(shí),種植體有松動(dòng),在鏡下可以看到比較明顯的裂隙。2.7界面性質(zhì)成骨細(xì)胞4周時(shí)(圖5A、B),可見(jiàn)純鈦組界面主要為結(jié)締組織和類(lèi)骨質(zhì)成分為主,只有少量新骨形成,靠近種植體部分可見(jiàn)大量的間充質(zhì)細(xì)胞聚集成膜狀,在新骨周?chē)梢?jiàn)大量單層排列的橢圓形成骨細(xì)胞,周?chē)谴罅康念?lèi)骨質(zhì),其中可見(jiàn)骨源細(xì)胞包埋于類(lèi)骨質(zhì)中。而微弧氧化組可見(jiàn)較多骨小梁形成,新生的骨小梁邊緣可見(jiàn)大量單層排列的低柱狀成骨細(xì)胞,骨小梁之間是類(lèi)骨質(zhì)和結(jié)締組織,還有很多新生的毛細(xì)血管,靠近種植體的邊緣是由間充質(zhì)細(xì)胞組成的膜。8周時(shí)(圖5C、D),純鈦組界面處可見(jiàn)少量的骨小梁,以編織骨為主,也可見(jiàn)大量的類(lèi)骨質(zhì)和結(jié)締組織共存,大量成骨細(xì)胞排列于新生骨周?chē)?成骨活躍,但是所形成的骨仍不成熟。微弧氧化組8周時(shí),界面大部分由骨組織構(gòu)成,部分骨小梁已逐漸融合成不規(guī)則的密質(zhì)骨,不過(guò)未見(jiàn)成熟的哈佛氏系統(tǒng),提示新骨并不成熟。新骨周?chē)钥梢?jiàn)大量的單層排列成骨細(xì)胞,靠近種植體邊緣可見(jiàn)結(jié)締組織形成的膜。12周(圖5E、F):純鈦組可見(jiàn)新生骨較前明顯成熟,新生的骨小梁融合成不規(guī)則密質(zhì)骨。未見(jiàn)新形成的密質(zhì)骨中有明顯的骨單位(哈佛氏系統(tǒng))形成。不過(guò)仍可見(jiàn)大量類(lèi)骨質(zhì)和結(jié)締組織位于界面邊緣,內(nèi)有大量成骨細(xì)胞。微弧氧化組12周時(shí),大部分新生骨組織融合在一起形成密質(zhì)骨,骨組織比較成熟,可見(jiàn)多個(gè)成熟哈佛氏系統(tǒng),界面處的膜已經(jīng)逐漸吸收?？梢?jiàn)部分新骨在界面外突成不規(guī)則狀,可能是長(zhǎng)入種植體表面的孔洞里所致。各個(gè)時(shí)間段各組組織學(xué)檢查切片如圖6～8。2.8微弧氧化加“骨”12周時(shí)可以看見(jiàn),純鈦與種植體之間仍有明顯的軟組織成分存在,新骨形成相對(duì)不如微弧氧化組成熟。微弧氧化組新形成的骨突入種植體凹凸不平的表面,形成犬牙交錯(cuò)的骨結(jié)合形狀。三個(gè)月時(shí)不脫鈣組織學(xué)結(jié)果(圖5G、H)。3微弧氧化對(duì)成骨細(xì)胞的控制作用種植體與骨形成良好的骨結(jié)合需要具備以下幾個(gè)條件:(1)增加骨結(jié)合力(率);(2)促進(jìn)骨的快速沉積,縮短愈合時(shí)間;(3)增加植入初期的穩(wěn)定性。以上三個(gè)目的實(shí)現(xiàn)與種植體表面四個(gè)因素有關(guān):(1)表面成分(2)表面能(3)表面形貌(4)粗糙度。通過(guò)種植體表面改性的方法,改善鈦及其鈦合金的耐磨性、耐腐蝕性,并著重增大增強(qiáng)純鈦種植體表面的生物活性,進(jìn)而提高種植體的骨結(jié)合強(qiáng)度,縮短愈合時(shí)間已成為口腔種植學(xué)領(lǐng)域里研究的熱點(diǎn)課題。經(jīng)微弧氧化處理后的純鈦表面二氧化鈦膜含有很高的鈣磷成分,而且鈣磷分布由表面較高逐漸向基體減低形成一個(gè)梯度分布。富含鈣磷的表面可以誘導(dǎo)鈣磷鹽的沉積,可以加速骨化和骨成熟。體外礦化實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明可以促進(jìn)鈣磷鹽的沉積在SBF浸泡后形成的仿生礦化層主要成分是類(lèi)似自然骨組織的低結(jié)晶度的CHA(表面碳酸羥基磷灰石,Carbonate-HychroxyApatite),所以也可以很好的在體內(nèi)誘導(dǎo)鈣磷鹽沉積,并促進(jìn)骨組織早期形成。同時(shí)有學(xué)者研究證明皮下埋植實(shí)驗(yàn)也一樣可以誘導(dǎo)鈣磷鹽的沉積:4周時(shí),沉積層已經(jīng)初步形成,之后經(jīng)過(guò)不斷的改建和鈣化,8周時(shí)可以形成穩(wěn)定的類(lèi)似骨組織成分的沉積層。經(jīng)觀察,經(jīng)微弧氧化處理后的種植體表面最終生成的微弧氧化膜表面粗糙不平,呈現(xiàn)大小不等的類(lèi)似火山噴發(fā)后的殘留形貌。每個(gè)大顆粒中間殘留一個(gè)幾微米大小的放電氣孔,如同火山口狀。顆粒熔化后連在一起,在大顆粒表面能觀察到膜熔化過(guò)的痕跡。膜表面還有許多直徑小于1μm的氣孔。氧化膜與基體結(jié)合緊密,二者之間沒(méi)有明顯界面。氧化膜表層和內(nèi)部致密程度有所區(qū)別,表層氧化膜明顯可見(jiàn)許多胞狀孔穴缺陷,疏松多孔,在靠近鈦基體的厚約10μm的氧化膜部分孔洞減少,較表層致密,并嵌入基底內(nèi)部,與基底結(jié)合呈犬牙交錯(cuò)狀。這種表面粗糙多孔,并且具有二級(jí)孔洞的結(jié)構(gòu),不僅植入骨組織后可以與其形成鑲嵌狀的物理性結(jié)合,有利于新骨長(zhǎng)入孔洞內(nèi),可以增加種植體的早期穩(wěn)