復(fù)元膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨誘導(dǎo)型一氧化氮合酶及血清一氧化氮、前列腺素e

復(fù)元膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨誘導(dǎo)型一氧化氮合酶及血清一氧化氮、前列腺素e

骨關(guān)節(jié)炎（oa）是一種常見(jiàn)的慢性和進(jìn)展性關(guān)節(jié)疾病。除了軟骨的退行性變外，它還伴有滑膜炎。近年來(lái),OA與炎癥介質(zhì)的關(guān)系日益受到人們重視,而一氧化氮(NO)與前列腺素E2(PGE2)兩種炎癥介質(zhì),在OA發(fā)病過(guò)程中有重要作用。中醫(yī)認(rèn)為腎虛血瘀是OA的主要病機(jī),臨床上常用補(bǔ)腎活血法治療OA。復(fù)元膠囊(FYJN)組方由治療OA行之有效的復(fù)元湯化載而來(lái),具有補(bǔ)腎活血益氣作用。前期研究表明,FYJN能夠降低兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨中白介素1β及滑膜中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用Hulth法建立骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型,觀察FYJN對(duì)軟骨iNOS表達(dá)和血清NO、PGE2含量的影響,探討其防治OA的抗炎作用機(jī)理。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動(dòng)物重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供雄性SD大鼠60只,體重250~300g。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(渝)2002007。1.1.2膠囊的制成FYJN由淫羊藿、鹿茸、肉蓯蓉、川芎、當(dāng)歸等組成,由重慶希爾安藥業(yè)有限責(zé)任公司制成膠囊,每粒膠囊重0.41g,每克相當(dāng)于生藥3g,科研制劑批號(hào):12號(hào)B-55。塞來(lái)昔布(CE):由輝瑞制藥有限公司生產(chǎn),0.2g/粒。1.1.3主試劑1.2方法1.2.1hulth法建立ua模型將60只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、CE組、FYJN低、中、高劑量組,每組10只。Hulth法建立OA模型:無(wú)菌條件下切斷大鼠右膝內(nèi)側(cè)副韌帶、完整切除內(nèi)側(cè)半月板以及剪斷前后交叉韌帶。術(shù)后肌注青霉素抗感染,共7d。術(shù)后1w開(kāi)始,每天驅(qū)趕大鼠跑步30min,共驅(qū)趕12w。而正常組不作任何處理。1.2.2灌胃fyjn的單次用藥依據(jù)Meeh-Rubner公式計(jì)算大鼠的等效給藥劑量:FYJN低、中、高劑量組分別給予FYJN371.65、743.30、2229.90mg·kg-1·d-1,CE組予CE50mg·kg-1·d-1,正常組、模型組生理鹽水灌胃,于術(shù)后第2周開(kāi)始,每天灌胃1次,共12w。1.2.3樣品的采集和處理12w后,取右膝股骨內(nèi)側(cè)髁,4%多聚甲醛固定,10%EDTA脫鈣,常規(guī)石蠟包埋后切片,留作免疫組化染色。1.2.4血清nos表達(dá)量檢測(cè)(1)光鏡觀察軟骨病理形態(tài):切片常規(guī)脫蠟至水后行HE染色。(2)iNOS檢測(cè)(免疫組化SABC法):切片常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20min,復(fù)合抗原修復(fù)液抗原修復(fù)10min,正常山羊血清封閉,滴加iNOS多克隆抗體(1∶100稀釋)4℃過(guò)夜,滴加生物素化二抗37℃20min,DAB顯色顯微鏡下觀察,蘇木精復(fù)染1min,烘干、透明、封片。參照Pellerier法,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(400倍),計(jì)算每個(gè)視野里的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),用細(xì)胞分?jǐn)?shù)即陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比來(lái)表示iNOS的表達(dá)量。(3)硝酸基還原酶法檢測(cè)血清NO含量:按試劑盒上說(shuō)明加樣混勻后于550nm,0.5cm光徑分管光度計(jì)測(cè)各管吸光度值。(4)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清PGE2含量。1.3統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,數(shù)據(jù)以x±s表示,采用單因素方差分析,有顯著差異者,用t檢驗(yàn)行兩組間比較。2結(jié)果2.1軟骨細(xì)胞排列正常組關(guān)節(jié)軟骨表層光滑,軟骨細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)層次清楚,基質(zhì)染色均勻,潮線完整;模型組軟骨細(xì)胞排列極為紊亂,細(xì)胞數(shù)目減少、變形,部分區(qū)域有大量簇聚軟骨細(xì)胞,基質(zhì)染色不均,潮線消失;各藥物組軟骨細(xì)胞排列較模型組整齊,軟骨細(xì)胞數(shù)目增多,潮線斷裂,其中,FYJN中、高劑量組與CE組一樣軟骨細(xì)胞形態(tài)正常、排列整齊,基質(zhì)染色也較均勻。2.2各組小鼠in-os表達(dá)iNOS陽(yáng)性表達(dá)為胞核/和胞漿出現(xiàn)棕黃色染色。正常關(guān)節(jié)軟骨僅少數(shù)幾例標(biāo)本見(jiàn)iNOS散在少量表達(dá)。模型組iNOS表達(dá)較正常組多,全層軟骨細(xì)胞均見(jiàn)iN-OS表達(dá)。各藥物組iNOS表達(dá)較模型組少,尤其是FYJN中、高劑量組僅見(jiàn)表中層軟骨細(xì)胞有少量iNOS表達(dá)。FYJN各組iN-OS表達(dá)見(jiàn)圖1。各組iNOS表達(dá)陽(yáng)性率:FYJN低、中、高劑量組iNOS表達(dá)均低于模型組(P<0.05,P<0.01,P<0.001),其中,低劑量組與CE組作用相近。見(jiàn)表1,圖1。2.3低劑量組和ce組作用比較FYJN低、中、高劑量組血清NO均低于模型組(P<0.05、P<0.01、P<0.001),其中,低劑量組與CE組作用相近;FYJN低、中、高劑量組血清PGE2含量低于模型組(P<0.05、P<0.01、P<0.001),其中,高劑量組與CE組作用相近。見(jiàn)表1。3討論3.1小鼠軟骨損傷模型Hulth法為經(jīng)典手術(shù)造模方法,其能改變關(guān)節(jié)應(yīng)力。在此基礎(chǔ)上驅(qū)趕大鼠跑步,加速軟骨破壞,具有造模時(shí)間短、成功率高的特點(diǎn)。用鼠類(lèi)來(lái)誘導(dǎo)OA模型,其軟骨損傷較大型動(dòng)物更迅速,更有利于抗骨關(guān)節(jié)藥物研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示術(shù)后12w后即可獲得典型的膝OA模型。3.2no的檢測(cè)作為軟骨組織中唯一的細(xì)胞成分,軟骨細(xì)胞在受到機(jī)械和化學(xué)因素刺激下,持續(xù)表達(dá)iNOS。過(guò)多產(chǎn)生的iNOS催化L-左型精氨酸產(chǎn)生大量NO,從而抑制蛋白多糖和膠原合成、激活金屬蛋白酶、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等。NO有脂溶性,極易通過(guò)細(xì)胞膜擴(kuò)散進(jìn)入血液循環(huán),因此檢測(cè)血液中NO濃度能反應(yīng)局部NO釋放量,間接反映軟骨的損害程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示OA與iNOS表達(dá)增加及NO過(guò)度生成有關(guān),FYJN能有效抑制軟骨iN-OS表達(dá),從而減少NO產(chǎn)生,且這種抑制作用隨FYJN劑量增加而增強(qiáng)。3.3pge2核心在關(guān)節(jié)軟骨降解和OA病理進(jìn)程中,PGE2是最主要的分解代謝因子之一。Attur等報(bào)道在體外培養(yǎng)人OA軟骨細(xì)胞中PGE2通過(guò)EP4受體途徑抑制蛋白多糖合成并刺激基質(zhì)降解。PGE2參與炎癥反應(yīng)、致痛、影響血管擴(kuò)張及生成,從而產(chǎn)生癥狀。目前臨床上廣泛用于治療OA的最主要藥物——非甾體抗炎劑(NSAIDs)就是通過(guò)抑制環(huán)氧合酶,使PGE2的合成減少而達(dá)到消炎、鎮(zhèn)痛的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示FYJN能有效抑制PGE2產(chǎn)生,從而達(dá)到抗炎、鎮(zhèn)痛的治療作用。3.4時(shí)藥治療對(duì)aa治療OA相當(dāng)于中醫(yī)“骨痹”范疇?！澳I主骨、藏精、生髓”,OA與腎虛相關(guān)?！吨胁亟?jīng)·五痹》謂“骨痹者,乃嗜欲不節(jié),傷于腎也……則邪氣妄入”,指出風(fēng)寒濕邪內(nèi)搏于骨,氣血痹阻經(jīng)絡(luò)是本病的重要病機(jī)。故OA治療應(yīng)注重補(bǔ)腎與活血并重。中醫(yī)藥在治療OA方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn),梁祖建等人的實(shí)驗(yàn)研究表明補(bǔ)腎活血中藥可以抑制炎癥,對(duì)OA的軟骨有保護(hù)和促進(jìn)修復(fù)作用。FYJN是臨床上治療OA有效制劑,由淫羊藿、鹿茸、肉蓯蓉、川