Chap紫外可見分光光度法

Chap.11吸光光度法AbsorptionSpectrophotometry可見光1.化教分析化學本章內容§11.1吸光光度法根本原理§11.2吸光光度法儀器§11.3顯色反響及其影響因素§11.4吸光度的測量及誤差控制§11.5吸光光度分析方法§11.6吸光光度法的應用實例2.化教分析化學吸光光度法根本概念和特點吸光光度法：是基于物質對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法。開展階段：目視比色法、光電比色法、分光光度法。分類：可見分光光度法、紫外光譜法、紅外光譜法。3.化教分析化學吸光光度法的特點〔1〕靈敏度高：測定下限可達10-5～10-6mol·L-1；10-4%～10-5%〔2〕作為微量分析方法，準確度較高：能夠滿足微量組分(<1%)的測定要求：Er：1%～5%〔3〕儀器設備簡單，操作簡便快速〔4〕應用廣泛4.化教分析化學一、物質對光的選擇性吸收§11.1吸光光度法根本原理〔一〕單色光與復合光1、光的波粒二象性光是一種電磁波，具有波粒二象性。5.化教分析化學

c－真空中光速：~3.0×108m/s

－波長：1

m=10-6m,1nm=10-9m,1?=10-10m

－頻率，單位：赫茲Hz次/秒

n－折射率，真空中為1：

=c

；波數(shù)=1/

=

/c光的傳播速度:〔1〕光的波動性6.化教分析化學

h－普朗克(Planck)常數(shù)6.626×10-34J·s

－頻率

E－光量子具有的能量單位：J(焦耳)，eV(電子伏特)1eV=1.602×10－19J〔2〕光的微粒性光是由光子流組成，光子的能量：7.化教分析化學

結論：一定波長的光具有一定的能量，波長越長(頻率越低)，光量子的能量越低。

光具有波粒二象性8.化教分析化學光譜區(qū)間

射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見光400～750nm0.1nm～10nm~750nm~0.1cm0.1mm～1m1m～1000m10nm~200nm200~400nm遠紫外近紫外（真空紫外）9.化教分析化學2、單色光與復合光單色光

復合光單一波長的光由不同波長的光組合而成的光白光青藍青綠黃橙紅紫藍互補色10.化教分析化學1.吸收光與透射光當復合光照射到物體上時，一局部光被吸收，而另一局部光那么被透射過去。即：入射光=吸收光＋透射光

吸收光透射光互補〔二〕物質對光的選擇性吸收11.化教分析化學物質的顏色與光的關系完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意光的作用方式表觀現(xiàn)象示意復合光12.化教分析化學不同顏色的可見光波長及其互補光藍黃紫紅綠紫黃綠綠藍橙紅藍綠/nm顏色互補光400-450紫黃綠450-480藍黃480-490綠藍橙490-500藍綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-600黃藍600-650橙綠藍650-760紅藍綠13.化教分析化學2.吸收光譜(AbsorptionSpectra)用不同波長的單色光照射，測吸光度—吸收曲線紫外可見吸收光譜：分子價電子能級躍遷。電子躍遷的同時，伴隨著振動能級、轉動能級的躍遷。帶狀光譜。14.化教分析化學A

c增大定性分析基礎物質對光的選擇性吸收定量分析基礎在一定實驗條件下,A∝cAB

A

最大吸收波長

max3.吸收曲線15.化教分析化學300400500600700

/nm5451.00.80.60.40.2AbsorbanceMnO4-的吸收光譜16.化教分析化學〔1〕吸收光譜的波長分布是由產生譜帶的躍遷能級間的ΔΕ所決定，反映了分子內部能級分布狀況——定性分析根底〔2〕吸收譜帶強度與該物質分子吸收的光子數(shù)成正比——定量分析根底同一種物質不同濃度下，其吸收曲線形狀相似λmax不變。在λmax處吸光度A隨濃度變化的幅度最大。所以測定最靈敏。此特性可作為定量分析時選擇入射光波長的重要依據(jù)。

Lambert-Beer定律吸收曲線的討論：17.化教分析化學1.透光率(透射比,Transmittance)透光率定義:T取值為0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光強度I0透射光強度It一束平行單色光二、朗伯-比爾定律〔一〕朗伯-比爾定律的數(shù)學表達式18.化教分析化學2.吸光度(Absorbance)T=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0溶液的T越大，說明對光的吸收越小，濃度低；T越小，溶液對光的吸收越大，濃度高1.00.50AcA100500T%TA,T,C三者的關系19.化教分析化學K--吸光系數(shù)b--吸光液層的厚度(光程)，cmc--吸光物質的濃度，g/L,mol/L

當一束平行單色光通過均勻、透明的吸光介質時，吸光度與吸光質點的濃度和吸收層厚度的乘積成正比.Lambert-Beer定律3、朗伯-比爾定律20.化教分析化學吸光度與光程的關系

A=Kbc

0.10b0.202b0.00光源檢測器顯示器參比朗伯定律(1760)21.化教分析化學吸光度與濃度的關系

A=Kbc0.10c0.202c0.00光源檢測器顯示器參比比爾定律(1852)22.化教分析化學K

K

a吸光系數(shù)，L·g–1·cm-1c：mol/Lc：g/Lc：g/100mLK

比吸光系數(shù),100mL·g-1·cm-1吸光系數(shù)(K)入射光波長物質的性質溫度與濃度無關,取值與濃度的單位相關摩爾吸光系數(shù)，L·mol–1·cm-123.化教分析化學4.朗伯-比爾定律的適用條件單色光

應選用

max處或肩峰處測定.

稀溶液

濃度增大，分子之間作用增強.

吸光質點形式不變

離解、絡合、締合會破壞線性關系,

應控制條件(酸度、濃度、介質等).24.化教分析化學溶液濃度的測定A＝

bc工作曲線法(校準曲線)外標法5.朗伯-比爾定律的分析應用01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx25.化教分析化學6.摩爾吸光系數(shù)ε的討論

摩爾吸光系數(shù)ε

(L·mol-1·cm-1)在數(shù)值上等于濃度為1mol/L,液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度吸收物質在一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)在溫度和波長等條件一定時，ε僅與吸收物質本身的性質有關，與待測物濃度無關；同一吸光物質在不同波長下的ε值是不同的。在最大吸收波長λmax處的摩爾吸光系數(shù)，以εmax表示說明了該吸收物質最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物質可能到達的最大靈敏度。26.化教分析化學吸光光度法的靈敏度的表示方法>105超高靈敏度=(6～10〕×104高靈敏=(2～6)×104中等靈敏度;<2×104不靈敏.〔1〕越大,靈敏度越高27.化教分析化學A=

bc=0.001

bc

＝0.001/

變換單位:bcmcmol/L=bcM106

g/1000cm2定義：當產生吸光度為0.001時，單位截面積(1cm2)的液層內所能檢測出的吸光物質的最低含量。用S表示，單位：

g·cm-2S小靈敏度高；相同的物質，M小那么靈敏度高?！?〕Sandell(桑德爾)靈敏度(S)28.化教分析化學例1鄰二氮菲光度法測鐵:

(Fe)=1.0mg/L,

b=2cm,A=0.38,計算，S

解：c(Fe)=1.0mg/L=1.0×10-3g/L

/55.85g/mol=1.8×10-5mol/LS=M/

=55.85/1.1×104=0.0051(

g/cm2)29.化教分析化學〔二〕朗伯比爾定律的推導〔自學〕1.吸光度的加合性在多組分體系中如果各吸光物質之間無相互作用這時體系總的吸光度等于各個吸光物質的吸光度之和。2.朗伯比爾定律建立的前提條件〔1〕入射光為平行單色光且垂直照射；〔2〕吸光物質為均勻非散射體系；〔3〕吸光質點之間無相互作用；〔4〕輻射與物質之間的作用僅限于光吸收過程，無熒光和光化學現(xiàn)象發(fā)生。30.化教分析化學§11.2吸光光度法的儀器紫外-可見分光光度計一般包括光源、單色器、吸收池和檢測顯示幾局部，根本結構如下：通過棱鏡或光柵得到一束近似的單色光，波長可調,應選擇性好,準確度高。光源單色器檢測系統(tǒng)吸收池31.化教分析化學

可見分光光度計廣州泰納UV-4501紫外可見分光光度計

32.化教分析化學

紫外-可見分光光度計33.化教分析化學1、光源：發(fā)出所需波長范圍內的連續(xù)光譜，有足夠 的光強度,穩(wěn)定。 可見光區(qū)：鎢燈，碘鎢燈(320～2500nm)

紫外區(qū)：氫燈，氘燈(180～375nm)

氙燈：紫外、可見光區(qū)均可用作光源

/nm鎢燈（熱輻射光源）4006008001000氙燈（氣體放電光源）氫燈強度一、分光光度計的構成34.化教分析化學氙燈氫燈鎢燈35.化教分析化學2、單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的 裝置。

〔1〕棱鏡:依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同入射狹縫準直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ2800

600

50040036.化教分析化學〔2〕光柵：在鍍鋁的玻璃外表刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。M1M2出射狹縫光屏透鏡平面透射光柵光柵衍射示意圖原理：利用光通過光柵時發(fā)生衍射和干預現(xiàn)象而分光.波長范圍寬,色散均勻,分辨性能好,使用方便37.化教分析化學3、吸收池(比色皿)：用于盛待測及參比溶液。 可見光區(qū)：光學玻璃池〔350～3200nm〕 紫外區(qū)：石英池玻璃〔185～4000nm〕5、顯示器：

低檔儀器：刻度顯示中高檔儀器：數(shù)字顯示，自動掃描記錄4、檢測器：利用光電效應，將光能轉換成

電流訊號。 光電池，光電管，光電倍增管38.化教分析化學吸光光度法儀器主要差異比較可見光(400～750nm)紫外光(200～400nm)光源鎢燈碘鎢燈320～2500氫燈氘燈180～375吸收池材料玻璃（350～3200）石英（185～4000）39.化教分析化學二、分光光度計的類型單光束分光光度計雙光束分光光度計其他類型分光光度計多通道儀器

同時測量200～820nm范圍內的整個光譜，比單個檢測器快316倍，信噪比增加3161/2倍。

纖維光度計

將光度計放入樣品中，原位測量。

對環(huán)境和過程監(jiān)測非常重要。40.化教分析化學0.575光源單色器吸收池檢測器顯示1.單波長單光束分光光度計簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。41.化教分析化學2.單波長雙光束分光光度計比值光源單色器吸收池檢測器顯示光束分裂器自動記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結構分析。儀器復雜，價格較高。42.化教分析化學§11.3顯色反響及其影響因素一、顯色反響的類型及要求被測元素在某種試劑的作用下，轉變成有色化合物的反響，稱之為顯色反響。mX(待測物)＋nR(顯色劑)＝XmRn(有色化合物)主要有配位反響(為主)和氧化復原反響。43.化教分析化學配位顯色反響當金屬離子與有機顯色劑形成配合物時，通常會發(fā)生電荷轉移躍遷，產生很強的紫外—可見吸收光譜。氧化復原顯色反響例如：鋼中微量錳的測定，Mn2＋不能直接進行光度測定

2Mn2＋＋5S2O82-＋8H2O=2MnO4-+10SO42-＋16H+將Mn2＋氧化成紫紅色的MnO4-后，在525nm處進行測定。44.化教分析化學1.配位顯色反響類型二元配合物體系三元配合物體系多元配合物體系混合配合物顯色體系離子締合物顯色體系金屬離子-配體-外表活性劑顯色體系45.化教分析化學混合配合物顯色體系：由一種金屬離子與兩種不同配體通過共價鍵結合成有色配合物的顯色體系。如：V：H2O2：PAR〔吡啶偶氮間苯二酚〕離子締合物顯色體系：金屬離子首先與配體生成配陰離子或陽離子，然后再與帶相反電荷的離子締合物的顯色體系。如：Ag+:鄰二氮菲：溴鄰苯三酚紅〔深藍色離子締合物〕。特點：第一配體已使金屬離子配位飽和，但電荷尚未飽和，可與帶相反電荷的離子締合；這類締合物在水中溶解度低，易溶于有機溶劑，多用于萃取光度法。46.化教分析化學金屬離子-配體-外表活性劑顯色體系如：稀土元素：二甲酚橙：溴化十六烷基吡啶〔藍色配合物，測定稀土總量〕常用的外表活性劑：溴化十六烷基吡啶、溴化十六烷基三甲基銨十二烷基磺酸鈉曲通X-100、OP等。47.化教分析化學2.對顯色反響的要求選擇性好靈敏度足夠高：>104比照度要大：>60nm有色化合物的組成恒定，且穩(wěn)定性好。顯色條件易于控制，重現(xiàn)性好。48.化教分析化學二、無機離子的常用顯色劑：：：：助色團：－NH，－OH，－X(孤對電子)neO生色團：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N〔共軛雙鍵〕πe無機顯色劑:

SCN-

[Fe(SCN)]2+

；H2O2

[TiO·H2O2]2+有機顯色劑:49.化教分析化學CH3－C－C－CH3HO－NN－OH＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH

OHON型：PARNHNHNSNS型：雙硫腙NN型：丁二酮肟鄰二氮菲磺基水楊酸

有機顯色劑50.化教分析化學三、影響顯色反響的因素c(R)c(R)c(R)1.顯色劑用量

Mo(SCN)32+

淺紅Mo(SCN)5

橙紅Mo(SCN)6-淺紅Fe(SCN)n3-n選擇曲線變化平坦處。51.化教分析化學2.溶液的酸度OH-酸度的影響影響被測物質的存在狀態(tài)M+nR=MRnH+影響顯色劑的平衡濃度和顏色RH=R-+H+

影響配合物的組成和顏色例，磺基水楊酸(ssal)–Fe3+pH=2~3FeR紫紅色pH=4~7FeR2橙色pH=8~10FeR3黃色

pH>12Fe(OH)3

沉淀52.化教分析化學pH1<pH<pH2選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)ApH酸度的影響53.化教分析化學鄰二氮菲－亞鐵反響完全度與pH的關系pH3～8(檸檬酸鹽介質)為適宜的酸度范圍32+3NNFe

桔紅色

max檸檬酸鹽介質+Fe2+54.化教分析化學3、顯色反響的時間和溫度〔1〕顯色時間：不同的顯色反響需要放置不同的時間，才能到達溶液顏色的穩(wěn)定形成。另一方面，不同的顯色物具有不同的穩(wěn)定持續(xù)時間，測定一定要在其穩(wěn)定期進行，否那么，有較大的測定偏差?！?〕顯色溫度25℃50℃t/minA55.化教分析化學4.有機溶劑和外表活性劑有機溶劑：降低有色化合物的接力度，提高顯色反響的靈敏度；影響顯色反響速率、配合物的顏色、溶解度和組成等。外表活性劑：具有膠束增溶、增敏作用，提高顯色反響的靈敏度，增加有色化合物的穩(wěn)定性。56.化教分析化學共存干擾離子的消除Co2＋,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(藍)⑴NaFSCN－Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN－測Co2＋(含F(xiàn)e3+):

(掩蔽法)

化學法5.共存離子的干擾57.化教分析化學如無法通過控制酸度和掩蔽的方法消除干擾，那么需采取別離法。測Fe3＋:(控制pH)，用磺基水楊酸Fe3+,Cu2+Fe(ssal)+〔紫紅〕Cu2+pH2.5ssal58.化教分析化學

物理法—選擇適當?shù)臏y定波長415500鈷-亞硝基紅鹽A絡合物試劑

/nm59.化教分析化學測量條件的選擇：除高效顯色劑外，分光光度法的準確度和靈敏度還與適宜的測量條件相關，包括入射光波長、吸光度讀數(shù)范圍和參比溶液的選擇?！?1.4吸光度的測量及誤差控制

60.化教分析化學1.測量波長的選擇原那么：“吸收最大，干擾最小〞A

X

maxY(2)一、測量波長和參比溶液的選擇61.化教分析化學2.參比溶液的選擇參比液的選擇方法溶劑作參比

試液空白(不加顯色劑)作參比試劑空白(不加試樣溶液)作參比加掩蔽劑(M)后的試液作參比試液無吸收，顯色劑無吸收試液有吸收，顯色劑無吸收試液無吸收，顯色劑有吸收試液有吸收，顯色劑有吸收62.化教分析化學二、比爾定律的偏離依據(jù)Beer定律，A與C關系應為經(jīng)過原點的直線偏離Beer定律的主要因素表現(xiàn)為以下兩個方面〔一〕光學因素〔二〕化學因素63.化教分析化學〔一〕光學因素1．非單色光的影響：

Beer定律應用的重要前提——入射光為單色光照射物質的光經(jīng)單色器分光后并非真正單色光其波長寬度由入射狹縫的寬度和棱鏡或光柵的分辨率決定為了保證透過光對檢測器的響應，必須保證一定的狹縫寬度這就使別離出來的光具一定的譜帶寬度64.化教分析化學2．雜散光的影響：雜散光是指從單色器分出的光不在入射光譜帶寬度范圍內，與所選波長相距較遠雜散光來源：儀器本身缺陷；光學元件污染造成雜散光可使吸收光譜變形，吸光度變值3．反射光和散色光的影響：反射光和散色光均是入射光譜帶寬度內的光直接對T產生影響散射和反射使T↓，A↑，吸收光譜變形注：一般可用空白比照校正消除4．非平行光的影響：使光程↑，A↑，吸收光譜變形65.化教分析化學〔二〕化學因素Beer定律適用的另一個前提：稀溶液濃度過高會使C與A關系偏離定律〔三〕介質均勻程度66.化教分析化學微分：兩式相除得：以有限值表示可得：假設讀數(shù)的絕對誤差為△T=1%，用不同的T代入上式，可得相應濃度測量的相對誤差△c/c，作圖測定結果的精度常用濃度的相對誤差△c/c表示,〔Δc/c〕不僅與儀器的透光度誤差ΔT有關，而且與其透光度讀數(shù)T的值也有關三、吸光度測量的誤差

67.化教分析化學1086420204060800.70.40.20.1AT%Er(36.8)0.434濃度測量的相對誤差與T(或A)的關系實際工作中，應控制T在10～70％,

A在0.2～0.7之間(調c,b,

)最正確值最正確讀數(shù)范圍68.化教分析化學【例】某一有色溶液在2.0cm的吸收皿中，測得透光率T＝1％，假設儀器透光度的絕對誤差△T＝0.5％，計算〔1〕測定的濃度的相對誤差△c/c〔2〕為使測得吸光度在最適讀數(shù)范圍內，溶液應稀釋或濃縮多少倍？〔3〕假設濃度不變，而改變比色皿厚度〔0.5cm,1.0cm，2.0cm,3.0cm〕,那么應選擇那種厚度的吸收皿最適宜，此時△c/c為多少？69.化教分析化學解：〔1〕〔2〕A=-lgT=-lg1%=2設有色溶液原始濃度為co，當b一定時，A＝εbc＝Kc,要使A＝0.2～0.7，那么即稀釋3～10倍70.化教分析化學〔3〕當c一定時即co，A＝εbc＝Kb,要使A＝0.2～0.7，那么bo=2cmb=0.5cm71.化教分析化學四、共存組分的干擾及消除

控制溶液酸度參加掩蔽劑配位掩蔽劑氧化復原掩蔽劑72.化教分析化學§11.5吸光光度分析方法1.校準曲線法(校準曲線，工作曲線法，外標法〕A＝

bc01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx標準系列未知樣品一、經(jīng)典光度分析方法73.化教分析化學1.單一組分的測定標準工作曲線法

先配制一系列標準溶液，在最大吸收波長處，測出它們的吸光度，作圖，同條件測未知液的吸光度，從圖中查出未知液的濃度cA標準工作曲線圖Axcxc1c2c3c4c5A1A2A3A4A574.化教分析化學微量鐵的測定氨基酸的測定鄰二氮菲法茚三酮法(紫色化合物)蛋白質的測定考馬斯亮藍法總磷的測定海水中營養(yǎng)鹽的測定磷鉬藍法單組分的測定75.化教分析化學

磷的測定：DNA中含P～9.2%,RNA中含P～9.5%，可得核酸量。H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O磷鉬黃(

小)磷鉬(V)藍(ε大)

λmax=660nmSn2+76.化教分析化學

2.多組分的測定根據(jù)加合性原那么解聯(lián)立方程，可求得Cx,Cy為物質的特征參數(shù)，可通過配制標準溶液測得:由x,y標液在

1,

2處分別測得.如果兩組分吸收峰相互不重疊，可在不同λmax處測定A

XY

1

2x,y組分不能直接測定77.化教分析化學在

1處測組分x,在

2處測組分y.b)在

1處測組分x;在

2處測總吸收,扣除x吸收,可求y.2.多組分的測定78.化教分析化學二、示差光度法以濃度為Cs的標準溶液為參比〔Cx>Cs〕

ΔAx適宜高濃度的測定ΔA△C△CxΔAx差示工作曲線標準溶液cs

、

c1、c2、c3……。以cs作參比，調A=0.測

c1、

c2、c3……的△A，用△A對△c作圖.同條件下測△Ax.從差示工作曲線中查出△cx.

79.化教分析化學示差法提高準確度的實質常規(guī)法TxT051050100

落在測量誤差較大的范圍示差法T051050100TrTsTs

落在測量誤差較小的范圍結論：示差法通過提高測量的準確度提高了方法的準確度標尺擴展10倍80.化教分析化學三、絡合物組成的測定(1)摩爾比法(飽和法)

固定cM,改變cR

從0開始增大M+nR=MRnCMRnCR81.化教分析化學在特定波長測定

R=0,

M=0,

MRn>0

R>0,

M>0,

MRn=0CR/CMAACR/CMnACR/CMn82.化教分析化學(2)等摩爾連續(xù)變化法〔Job〕:CM/C從0→1

R=0,

M=0,

MRn>0

R>0,

M>0,

MRn=000.51.0ACM/C0.33n=1,CM/C=0.5n=2,CM/C=0.3300.51.0ACM/C83.化教分析化學定性法簡介：目視比色法標準系列未知樣品特點利用自然光比較吸收光的互補色光準確度低(半定量)不可分辨多組分方法簡便，靈敏度高84.化教分析化學1.了解分子對光的吸收。吸收曲線—定性分析根底。2.掌握光吸收根本定律：朗伯-比爾定律—定量分析的根底A=Kbc=-lgT式中各參數(shù)的物理意義，定量計算。3.分光光度計根本部件；4.靈敏度的