湖南地標+水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中地西泮的測定+液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（征求意見稿）1

ICS03.120.20A00湖DB43Determinationofdiazapaninaquacultureenvironment(water,sediment)byliquidchromatographytandemmassspec湖南省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB43/TXXX-2024 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語與定義 4方法原理 5試劑與材料 6儀器與設(shè)備 2 2 29結(jié)果計算和表述 10檢測方法的靈敏度、準確度和精密度 5 DB43/TXXX-2024本文件按GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分:標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。請注意本文件某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件發(fā)布機構(gòu)不承擔識別這些專利的責任。本文件由湖南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件由湖南省農(nóng)業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位：湖南省水產(chǎn)科學研究所、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（長沙）、邵陽縣畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心。本文件主要起草人：李小玲、萬譯文、楊霄、索紋紋、謝仲桂、雷琴、謝玉昆、何詠、陳湘藝、曾春芳、黃向榮、張永勇、尹升福、劉伶俐、洪波、黃華偉、肖維。1DB43/TXXX-2024水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中地西泮的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件規(guī)定了水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中地西泮的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本文件適用于我省水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中地西泮的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB17378.5海洋監(jiān)測規(guī)范第5部分：沉積物分析HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)SL187水質(zhì)采樣技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4方法原理水體試樣經(jīng)過濾，底泥試料經(jīng)氨化乙酸乙酯提取，氮氣濃縮。所得樣液加入甲酸酸化，固相萃取柱富集凈化，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標法定量。5試劑與材料5.1試劑除特殊注明外，所用試劑均為分析純，實驗用水為符合GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1.1乙腈（CH3CN色譜純。5.1.2乙酸乙酯：色譜純。5.1.3甲酸（HCOOH）：色譜純。5.1.4氨水（NH3?H2O）：分析純。5.2溶液配制5.2.11%氨水-乙酸乙酯：取5mL氨水（5.1.4）加入495mL乙酸乙酯中，混合均勻，備用。5.2.21%甲酸-水溶液：取10mL甲酸（5.1.3）加入990mL水中，混合均勻，備用。5.2.35%氨水-乙腈溶液：取25mL氨水（5.1.4）加入475mL乙腈（5.1.1）中，混合均勻，備用。2DB43/TXXX-20245.2.4流動相（0.1%甲酸-水溶液）：取1mL甲酸（5.1.3）加入1000mL水中，混合均勻，備用。5.3標準品5.3.1地西泮（Diazepam,C16H13ClN2O,CAS號：439-14-5），純度≥99.9%。5.3.2氘代地西泮（Diazepam-d5,C16H8D5ClN2O,CAS號：65854-76-4），純度≥99.9%。5.4標準溶液配制5.4.1標準儲備液（0.10mg/mL）：取10mg地西泮（5.3.1）標準品，用乙腈（5.1.1）溶解并稀釋定容至100mL，配制成濃度均為0.10mg/mL的標準儲備液。-18℃避光保存，有效期12個月。5.4.2內(nèi)標儲備液（0.10mg/mL）：稱取10mg氘代地西泮（5.3.2）標準品，用乙腈（5.1.1）溶解并稀釋定容至100mL，配制成濃度均為0.10mg/mL的標準儲備液。-18℃避光保存，有效期12個月。5.4.3標準中間液（1.0μg/mL）：準確移取地西泮標準儲備液（5.4.1）1mL，于100mL容量瓶中，用乙腈（5.1.1）稀釋至刻度，配制成濃度為1.0μg/mL的標準中間液。-18℃避光保存，有效期6個月。5.4.4內(nèi)標中間液（1.0μg/mL）：準確移取氘代地西泮標準儲備液（5.4.2）1mL，于100mL容量瓶中，用乙腈（5.1.1）稀釋至刻度，配制成濃度為1.0μg/mL的內(nèi)標中間液。-18℃避光保存，有效期6個月。5.4.5標準使用液（0.10μg/mL）：準確移取5.00mL地西泮標準中間液（5.4.3）于50mL棕色容量瓶中，用乙腈（5.1.1）稀釋至刻度，配制成濃度為0.10μg/mL的標準使用液。于4℃下避光保存，有效5.4.6內(nèi)標使用液（0.10μg/mL）：準確移取5.00mL氘代地西泮內(nèi)標中間液（5.4.4）于50mL棕色容量瓶中，用乙腈（5.1.1）稀釋至刻度，配制成濃度為0.10μg/mL的內(nèi)標使用液。于4℃下避光保存，有效期1個月。5.5材料5.5.1混合型強陽離子交換（MCX）固相萃取小柱：150mg/6mL，或者相當者。5.5.2微孔濾膜:0.22μm聚四氟乙烯濾膜。5.5.3玻璃纖維濾紙（GF/F）：孔徑0.45μm。6儀器與設(shè)備6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源。6.2分析天平：感量0.01g和0.0001g。6.3冷凍干燥機。6.4渦旋混合器。6.5高速離心機。6.6超聲波清洗器。6.7固相萃取裝置，帶真空泵。6.8氮吹儀。7樣品7.1樣品采集水樣按SL187規(guī)定的方法進行采集。底泥樣品按HJ494規(guī)定的方法進行采集。3DB43/TXXX-20247.2試樣的制備采集的水樣經(jīng)玻璃纖維濾紙（5.5.3）過濾后，置于樣品瓶中，在0℃~4℃避光保存。采集的底泥樣品經(jīng)冷凍干燥機冷凍干燥后，剔除石塊和植物體等異物，用研缽研磨后過60目（孔徑0.25mm）網(wǎng)篩，在0℃~4℃避光保存。7.3空白試樣的制備選取不含地西泮的同類樣品，按照與試樣制備（7.2）相同的步驟進行空白試樣的制備。8測定步驟8.1提取8.1.1水體準確移取100mL水樣置于離心管中，加入100μL內(nèi)標使用液（5.4.6），加入1.0mL甲酸（5.1.3）調(diào)節(jié)pH，旋渦震蕩，充分混合，8000r/min離心5min，待凈化。8.1.2底泥稱取5g（準確至±0.02g）底泥樣品于50mL離心管中，加水3mL水潤濕，加入100μL混合內(nèi)標使用液（5.4.6加入15mL1%氨水-乙酸乙酯（5.2.1）渦旋混合2min，超聲提取10min，8000r/min離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至25mL比色管中，殘渣用10mL1%氨水-乙酸乙酯（5.2.1）重復(fù)提取一次，合并提取液，45℃氮氣吹干，加入5mL乙腈（5.1.1）溶解，加入250μL甲酸（5.1.3）渦旋混合，待凈化。8.2凈化MCX固相萃取小柱（5.5.1）依次用3mL乙腈（5.1.1）和3mL1%甲酸水溶液（5.2.2）活化。預(yù)處理水體和底泥提取試樣全部轉(zhuǎn)移過柱，控制流速不超過1.0mL/min。待水樣全部通過小柱后，用3mL1%甲酸水溶液（5.2.2）和3mL乙腈（5.1.1）淋洗，減壓抽干，用3mL5%氨水乙腈溶液（5.2.3）洗脫。收集洗脫液，洗脫液45℃氮氣吹干。加入1mL乙腈（5.1.1）溶解殘渣，過0.22μm微孔濾膜（5.5.2），供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（6.1）測定。8.3底泥含水率測定稱取5g底泥樣品，按照GB17378.5中規(guī)定的方法進行含水率測定。8.4標準曲線的制備8.4.1水體分別移取標準使用液（5.4.5）和內(nèi)標使用液（5.4.6），用乙腈（5.1.1）配制成地西泮的質(zhì)量濃度為0.20μg/L、0.50μg/L、1.00μg/L、5.00μg/L、10μg/L、50μg/L，氘代地西泮質(zhì)量濃度為10.0μg/L的系列標準工作液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。以測得特征離子質(zhì)量色譜峰峰面積為縱坐標、對應(yīng)的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。8.5測定8.5.1液相色譜參考條件a)色譜柱：C18(100×2.1mm,粒徑2.6μm)，或相當者；4DB43/TXXX-2024b)流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸-水溶液。梯度洗脫條件見表1；c)進樣量：5μL；d)流速：0.30mL/min；e)柱溫：40℃。表1流動相梯度洗脫條件時間（min）A(%)B(%)0900.5904.09556.0955908.5908.5.2質(zhì)譜參考條件a)離子源：電噴霧離子源；b)掃描方式：正離子掃描；c)檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；d)噴霧電壓：5.5kV；e)脫溶劑氣溫度：550℃;f)多反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量見表2。表2多反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量化合物名稱母離子m/z子離子m/z去簇電壓V碰撞能量eV地西泮285.14440氘代地西泮290.140a為定量離子。8.5.3定性測定在相同測試條件下，試樣中待測物的保留時間與標準工作液中待測物的保留時間一致，偏差在±2.5%以內(nèi)，且試樣中待測物定性離子的相對豐度與濃度相當?shù)臉藴嗜芤簩?yīng)的定性離子的相對豐度一致。其允許偏差應(yīng)符合表3的要求。表3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度>50%>20%～50%>10%～20%≤10%允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%8.5.4定量測定按8.5.1和8.5.2設(shè)定儀器條件，取標準工作溶液、試樣溶液、空白試樣溶液等體積進樣測定，內(nèi)標法定量。標準工作溶液和試樣溶液中目標物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測線性范圍內(nèi)。上述液相色譜-質(zhì)譜條件下，地西泮標準溶液特征離子質(zhì)量色譜圖見附錄A。8.6空白實驗5DB43/TXXX-2024按照與上述測定步驟相同的條件進行空白試樣（7.3）的測定。9結(jié)果計算和表述水體中待測物含量按式（1）計算。計算結(jié)果須扣除空白值，保留兩位有效數(shù)字。1X10V0…………式中：X1——試樣中待測物的含量，單位為微克每升(μg/L）；Ci——從標準工作曲線得到的待測物溶液濃度，單位為微克每升(μg/L）；V——試樣最終定容體積，單位為毫升（mL）；V0——試樣體積，單位為毫升（mL）。底泥中待測物含量按式（2）計算。計算結(jié)果須扣除空白值，保留兩位有效數(shù)字。2X2 VV…………(2)式中：X2——試樣中待測物的含量，單位為微克每千克(μg/kg）；V1——試樣提取液體積，單位為毫升（mL）。V2——準確移取的備用液體積，單位為毫升（mL）。m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。w——試樣含水率，單位為質(zhì)量分數(shù)（%）。10檢測方法的靈敏度、準確度和精密度10.1靈敏度本方法在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境水體中地西泮的檢出限均為0.002μg/L，定量限