細(xì)胞原代培養(yǎng)與傳代

目錄細(xì)胞培養(yǎng)根本概念細(xì)胞培養(yǎng)根本要求細(xì)胞培養(yǎng)根本技術(shù)1整理ppt細(xì)胞培養(yǎng)定義定義：模擬機體內(nèi)生理條件，將細(xì)胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細(xì)胞生命過程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問題的研究。優(yōu)點：1．活細(xì)胞：同時、大量、均一性、重復(fù)性；2．可控制：各種物理、化學(xué)、生物等因素可調(diào)控；3．研究方法多樣：倒置、熒光、電子、激光共焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記；4．應(yīng)用廣：不同物種、不同年齡、不同組織、正?；虍惓！材[瘤〕；缺點：人工所模擬的條件與體內(nèi)實際情況仍不完全相同；當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，時間久了，必然發(fā)生變化。2整理ppt細(xì)胞培養(yǎng)的根本概念

傳代：細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。

原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。

3整理ppt接觸抑制〔Contactinhibition〕細(xì)胞相互接觸時，將停止增長；細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的G0期；轉(zhuǎn)化的細(xì)胞卻可以繼續(xù)生長導(dǎo)致細(xì)胞重疊堆積生長。4整理ppt體外培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力不是無限的，傳代次數(shù)有一定的界限，稱為“Hayflick極限〞。傳代次數(shù)與物種壽命有關(guān)：小鼠壽命3年，傳代12次；龜壽命200年，傳代140次。傳代次數(shù)與個體年齡成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病兒童，2-10代。細(xì)胞傳代次數(shù)〔PassageNumber〕5整理ppt原代培養(yǎng)

〔primary

culture〕從動物機體取出的進行培養(yǎng)的細(xì)胞群。生長緩慢，繁殖一定的代數(shù)后〔一般10代以內(nèi)〕停止生長?？寺　瞔lone〕亦稱無性繁殖系或無性系。對細(xì)胞來說，克隆是指由同一個祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。

細(xì)胞系〔cell

line〕從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖

細(xì)胞株〔cell

strain〕從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。原代培養(yǎng)與細(xì)胞系6整理ppt原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿原代培養(yǎng)期傳代期衰退期7整理ppt8整理ppt

TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)TheEuropeanCollectionofAnimalCellCulture(ECACC)NationalInstituteofHealth(NIH),USANationalCancerInstitute(NCI),USA細(xì)胞系資源9整理ppt有限細(xì)胞系，無限細(xì)胞系

細(xì)胞系

cellline細(xì)胞株

cellstrain

10整理ppt培養(yǎng)細(xì)胞的特性培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式貼附生長：必須貼附于支持物外表才能生長。見于各種實體瘤細(xì)胞懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物外表。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞11整理ppt

每代貼附生長細(xì)胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期〔平臺期〕12整理ppt游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時13整理ppt貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白〔生長基質(zhì)〕，這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)〔化學(xué)合成的功能基團〕14整理ppt15整理ppt16整理ppt潛伏期此時細(xì)胞有生長話動，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時。17整理ppt對數(shù)生長期：細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最正確，最適合進行實驗研究。18整理ppt停止期〔平臺期〕：細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性19整理ppt20整理ppt二、細(xì)胞培養(yǎng)根本要求常用儀器設(shè)備培養(yǎng)器皿培養(yǎng)基血清其他細(xì)胞培養(yǎng)試劑21整理ppt培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件1細(xì)胞的營養(yǎng)需要2細(xì)胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4

滲透壓

3無污染

4無毒22整理ppt常用儀器設(shè)備

超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱枯燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板，凍存管23整理ppt壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱枯燥箱：干熱消毒〔160℃，2小時〕。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等外表消毒24整理ppt

超凈臺

超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

25整理ppt濾器26整理ppt27整理pptCO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒〔90℃，14h)。③箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。28整理ppt29整理ppt自動雙重純水蒸餾器純水儀30整理ppt酶標(biāo)儀微孔板震蕩器31整理pptCultureflaskCulturePlate

培養(yǎng)器皿32整理ppt

浸泡〔自來水〕、刷洗〔洗衣粉〕、酸泡〔24小時〕、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干常用玻璃器皿清洗33整理ppt

清潔液的配制34整理ppt細(xì)胞培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌，其優(yōu)點是價格廉價。缺點是配制過程繁瑣，質(zhì)量不易控制液體培養(yǎng)基是由專業(yè)廠家按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)?；a(chǎn)，不僅質(zhì)量得到保證，而且使用十分方便常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640〔標(biāo)準(zhǔn)型〕、DMEM-高糖〔標(biāo)準(zhǔn)型〕、DMEM-低糖〔標(biāo)準(zhǔn)型〕、McCoys5A、M199、F12等35整理ppt培養(yǎng)基的選擇沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點建議可供參考：

建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I，或在購置細(xì)胞株時咨詢。其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最正確培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。36整理ppt血清使用本卷須知血清必須貯存于–20～-70℃，假設(shè)存放于4℃，請勿超過一個月。如果一次無法用完一瓶，可將40～45ml分裝于無菌50ml離心管中，由于血清結(jié)凍時體積會增加約10%，必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否那么易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。

血清解凍步驟(逐步解凍法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝。在溶解過程中須規(guī)那么搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。熱滅活〔heat-inactivation〕是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍之血清。此熱處理之目的是使血清中之補體成份(complement)去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為會造成沉淀物之顯著增多，且會影響血清之品質(zhì)。

勿將血清置于37℃太久，假設(shè)在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)37整理ppt凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin)造成，這些凝絮沉淀物不會影響血清本身之品質(zhì)。假設(shè)欲減少這些凝絮沉淀物，可用離心3000rpm,5min去除，或離心后上清液可以參加培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沉淀物，因為會阻塞過濾膜。

顯微鏡下觀察之“小黑點〞：通常經(jīng)過熱處理之血清，沉淀物的形成會顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點〞，常會誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37℃中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37℃環(huán)境下，又會使此沉淀物增多，更會誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點應(yīng)不會影響細(xì)胞之生長，但假設(shè)疑心此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號的血清。血清沉淀物

38整理ppt如何防止沉淀物的產(chǎn)生?

解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，假設(shè)血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，實驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。

解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

請勿將血清置于37℃太久。假設(shè)在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，假設(shè)非必要，可以無須做此步驟。

假設(shè)必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原那么，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。39整理ppt谷氨酰胺谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加配制好的培養(yǎng)液〔含谷氨酰胺〕在4℃放置2周以上時，要重新參加原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時參加培養(yǎng)液內(nèi)使用終濃度為1-4mM一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mM〔29.22g/L〕配制方法為：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂蟆矐?yīng)加溫30℃〕，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中參加0.5-2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mM40整理ppt酚紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH指示紅色表示中性pH黃色代表酸性pH紫色表示堿性pH在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅因為已有一些研究說明：酚紅能模擬類固醇激素〔尤其是雌激素〕樣作用41整理ppt水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20

加水至1000ml

細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制42整理ppt抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定43整理ppt完全培養(yǎng)基的組成根底培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100單位／毫升44整理ppt培養(yǎng)基的配制RPMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.0g青、鏈霉素各100單位／毫升加三蒸水至1000ml,過濾除菌。

調(diào)節(jié)pH值至7.2

加血清〔終濃度10％〕

45整理ppt細(xì)胞消化液別離組織和分散細(xì)胞常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液，單獨或混合使用胰蛋白酶溶液主要作用：使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散消化細(xì)胞時，參加一些血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用EDTA·4Na溶液一種化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。

注意：使用EDTA處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會影響細(xì)胞生長46整理ppt三、細(xì)胞培養(yǎng)根本技術(shù)細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞換液與傳代細(xì)胞凍存與復(fù)蘇47整理ppt鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污切割：用平衡鹽溶液將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清消化、接種培養(yǎng)：參加0.25％胰蛋白酶消化液〔5-10倍量〕，與組織塊混勻。置37℃水浴，觀察消化情況〔每隔幾分鐘搖動一下試管〕，靜止，吸去上清，參加5～10ml細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48整理ppt49整理ppt換液：全量換液和半量換液換液時機的選擇：培養(yǎng)液pH值：細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)積累增多，pH值下降，營養(yǎng)液酸化變黃，。細(xì)胞狀態(tài)細(xì)胞換液50整理ppt細(xì)胞傳代原代細(xì)胞傳代以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株細(xì)胞系傳代以得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)接觸抑制營養(yǎng)枯竭將培養(yǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)器皿中消化下來，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的器皿中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)細(xì)胞“一代〞指從細(xì)胞接種到別離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同，在一代中，細(xì)胞培增3～6次51整理ppt細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種。1.懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心〔1000轉(zhuǎn)/分〕去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2半懸浮生長細(xì)胞傳代〔Hela細(xì)胞〕此類細(xì)胞局部呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。52整理ppt貼壁生長細(xì)胞傳代方法：1.吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2.參加1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn)〕靜置2-10min〔顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測〕。3.吸去胰蛋白酶液，參加培養(yǎng)液。4.用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。5.加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。6.將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。53整理ppt細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。54整理ppt

凍存和復(fù)蘇的原那么：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。55整理ppt細(xì)胞凍存冷凍保存要點冷凍過程要緩慢：4℃30－60分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時〔或過夜〕→液氮長期保存或使用程序降溫盒，每秒下降1℃凍存細(xì)胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。細(xì)胞濃度控制在：5x106－2x107/ml。常用細(xì)胞冷凍保存液5%或10％DMSO＋完全培養(yǎng)液10％甘油＋完全培養(yǎng)液56整理ppt低溫保護劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時參加低溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。57整理ppt細(xì)胞凍存方法1預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基10%DMSO2取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，參加適量凍存液,用吸管吹打制成細(xì)胞懸液〔1×106～5×106細(xì)胞/ml)3參加1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。4年后，存活率可達80％一90％。DMSO液用培養(yǎng)液配好，防止因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。58整理ppt細(xì)胞復(fù)蘇快速解凍凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化〔不要超過3分鐘〕解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO如果細(xì)胞對冷凍保護劑特別敏感解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中59整理ppt收到細(xì)胞的處理方式(一)

1.收到細(xì)胞株包裹時，請檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形，假設(shè)有請立即通知。細(xì)胞株請盡速開始培養(yǎng)，或立即冷凍保存(置于–70°C，隔夜后，移到液氮)。

2.冷凍細(xì)胞解凍程序:

2.1.依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之根底培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無法立即適應(yīng)不同之根底培養(yǎng)基或不同之血清種類，假設(shè)因?qū)嶒炐枰仨氂兴煌瑫r，務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細(xì)胞適應(yīng)后，方進行所需之實驗。

2.2.FBS(fetalbovineserum,胚牛血清),CS(calfserum,小牛血清)和HS(horseserum,馬血清)，對細(xì)胞而言差異極大，請務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。

60整理ppt2.3.將培養(yǎng)基置于37°C水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。取出冷凍管，立即放入37°C水槽中快速解凍，水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿，否那么易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化后，以70%ethanol擦拭冷凍管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

2.4.依據(jù)細(xì)胞種類和濃度，于無菌操作臺內(nèi)取10ml培養(yǎng)基加至T25或T75flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩參加T25或T75flask內(nèi)之培養(yǎng)基，混合均勻，放入37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.5.對絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1%以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除，待第二天確定細(xì)胞