膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物納米脂質體的藥動學及藥效學評價

膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物納米脂質體的藥動學及藥效學評價目的:瘧原蟲感染的紅細胞和惡性腫瘤細胞的通性是膽堿代謝異常,基于此,本課題以膽堿衍生物為靶頭,合成膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物（artelinicacid-cholinederivative,AD）;制備膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物納米脂質體（ADLs）,并對其進行單因素處方優(yōu)化,考察其制劑學性質;對ADLs在大鼠體內(nèi)的藥動學進行初步的研究并分別評價ADLs對約氏鼠瘧（PlasmodiumyoeliiBY265,PyBY265）的抗瘧活性和ADLs對小鼠乳腺癌4T1細胞的體內(nèi)外抗腫瘤活性。方法:1.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物的合成及表征以雙氫青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）為原料藥,通過脫水縮合反應、水解反應合成蒿醚林酸（artelinicacid,AA）,AA與季銨化膽堿衍生物通過酯化反應得到膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物（AD）。采用傅立葉變換離子回旋共振質譜（FT-ICRMS）和核磁共振氫譜、碳譜(¹H-NMR,¹³C-NMR)確證其結構。2.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物脂質體的制備及處方優(yōu)化用高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography,HPLC）建立AD的體外分析方法;采用薄膜分散法制備ADLs,以包封率（encapsulationefficiency,EE）、載藥量（drugloadingefficiency,DL）、粒徑（size）及多分散性指數(shù)（polydispersityindex,PDI）為評價指標,考察藥脂比、水化溫度以及膽固醇的用量對脂質體處方的影響,以獲得較優(yōu)處方。通過透射電鏡（transmissionelectronmicroscopy,TEM）觀察ADLs的表面形態(tài),超濾離心法測定脂質體的包封率,體外透析法測定脂質體的體外釋放,并考察ADLs在一月內(nèi)的穩(wěn)定性。3.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物脂質體在大鼠體內(nèi)的藥動學研究建立高效液相色譜-質譜聯(lián)用法（highperformanceliquidchromatography-massspectrometry,HPLC-MS/MS）測定大鼠血漿中AD和AA的含量。將24只雄性SD大鼠隨機分為4組（n=6）,分別靜脈注射蒿醚林酸溶液（AA-SOL）、蒿醚林酸脂質體（AALs）、AD溶液（AD-SOL）、ADLs,并分別于0.083,0.167,0.25,0.5,0.75,1,2,4,6,8,12和24h眼眶取血0.5ml于肝素管,在3500r/min離心10min以分離血漿,將上層血漿保存于-20℃冰箱中直至測定分析。4.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物脂質體的體內(nèi)抗瘧藥效學研究以PyBY265感染小鼠為模型,以不治療組、空白脂質體組為陰性對照組,以雙氫青蒿素脂質體組（DHALs）、蒿醚林酸脂質體組（AALS）、膽堿衍生物脂質體組（CDLS）、AALs和CDLs的等摩爾物理混合脂質體組（AALs-CDLs）為試驗對照組,以感染率、抑制率、轉陰率、復燃率、存活率為評價指標,通過皮爾遜四天抑制法考察ADLs的體內(nèi)抗瘧活性。5.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物脂質體的體內(nèi)外抗腫瘤活性研究通過MTT法評估ADLs對小鼠乳腺癌4T1細胞的抑制作用;用懸浮的4T1細胞皮下接種Balb/C小鼠乳房,建立Balb/C荷瘤小鼠模型。以腫瘤生長體積、小鼠體重、抑瘤率及生存曲線等為評價指標,通過連續(xù)四次隔天給藥法,考察ADLs的體內(nèi)抗腫瘤活性。結果:1.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物的合成及表征FT-ICRMS測得的精確質量數(shù)和理論值的相對誤差均在±3ppm之內(nèi),¹H-NMR和¹³C-NMR的圖譜結果與對應化合物的結構相一致,表明成功合成AD。其中,季銨化反應生成CD產(chǎn)率為65.65%,AA產(chǎn)率為31.71%,過量的膽堿衍生物與AA發(fā)生酯化反應生成的AD產(chǎn)率為63.31%。2.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物脂質體的制備及處方優(yōu)化建立了HPLC法用于AD的含量測定及其制劑的體外分析,經(jīng)過分析方法的驗證,在2¹200μg/ml的濃度范圍內(nèi),AD的線性關系良好;AD定量限為1.5μg/ml,檢測限為1.0μg/ml;方法的精密度、回收率均符合方法學要求。通過單因素法確定了最佳脂質體處方為:藥脂比1:10,水化溫度40℃,膽固醇與磷脂之比1:25。在該處方下,ADLs外觀透亮,透射電鏡下顯示該脂質體呈圓形或近圓形;ADLs的平均粒徑為（164.4±1.8）nm,Zeta電位為（40.87±0.86）mV;超濾法測得包封率為（95.74±0.10）%,計算得載藥量為（12.60±0.05）%;ADLs的體外釋放行為顯示,脂質體具有較好的緩釋特征,在12h內(nèi)釋放量達48.93%,無明顯突釋現(xiàn)象。3.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物納米脂質體在大鼠體內(nèi)的藥動學研究所建立的HPLC-MS/MS法符合方法學要求,可用于測定大鼠血漿中AD和AA的含量。藥動學結果顯示,ADLs的AUC,t_1/2,CLz,Vz分別是AD-SOL的4.54、2.09、0.23、0.55倍,AALs的AUC,t_1/2,CLz,Vz分別是AA-SOL的2.57,1.94,0.38,0.68,這個結果說明,納米脂質體相比溶液劑可以增加藥物的AUC、延長生物半衰期、減少清除率和表觀分布容積;相比AA的溶液劑和脂質體組,AD的溶液劑和脂質體組的AUC和t_1/2都顯著增加,CLz和Vz顯著減少。4.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物納米脂質體的體內(nèi)抗瘧藥效學研究空白脂質體組、溶劑組、感染不治療組對瘧原蟲的感染率無統(tǒng)計學差異（P>0.05）,說明空白脂質體組和溶劑組對瘧原蟲無抑制作用。各制劑組的感染率、抑制率、轉陰率、復燃率、存活率、ED₅₀和ED₉₀結果表明,各制劑組的抗瘧順序為ADLs>DHALs>AALs>AALs-CDLs>CDLs。5.膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物納米脂質體的體內(nèi)外抗腫瘤活性研究MTT試驗顯示,ADLs對小鼠乳腺癌細胞（4T1）的細胞毒性呈時間和濃度依賴關系,順序依次為:DHA-SOL>ADLs>AA-SOL>生理鹽水組;體內(nèi)抗腫瘤活性結果表明各組抑制腫瘤生長順序依次為:ADLs>DHA-SOL>AA-SOL>生理鹽水組。結論:1.成功合成膽堿衍生物修飾的蒿醚林酸復合物,并用FT-ICRMS、¹H-NMR和¹³C-NMR確證了其結構。2.采用單因素優(yōu)化后的處方制備ADLs,該脂質體的形態(tài)、粒徑及其分布、EE、DL、穩(wěn)定性和釋放度等指標都符合預期的要求。3.藥動學試驗表明,將AD和AA制備成脂質體,或是將AA鍵合膽堿衍生物后,都可以顯著優(yōu)化藥代動力學參數(shù),包括延長生物消除半衰期,降低血液中的消除等。4.體內(nèi)抗瘧藥效學試驗表明,ADLs的抗瘧作用具有濃度依賴性,其抗瘧效果優(yōu)于DHALS,AALS,AALS-CDLS和CDLS,