A型塞尼卡病毒與O型、A型、亞洲I型口蹄疫病毒鑒別檢測 多重RT-PCR和多重qRT-PCR法

1A型塞尼卡病毒與O型、A型、亞洲I型口蹄疫病毒鑒別檢測多重RT-PCR和多重qRT-PCR法本文件規(guī)定了用于A型塞尼卡病毒與O型、A型、亞洲I型口蹄疫病毒的鑒別檢測的多重RT-PCR和qRT-PCR方法，包括試劑、主要儀器設(shè)備、操作步驟及結(jié)果判定等技術(shù)要求。本文件適用于A型塞尼卡病毒與O型、A型、亞洲I型口蹄疫病毒鑒別檢測診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18935-2018口蹄疫診斷技術(shù)GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范SN/T1193基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3縮略語下列縮略語適用于本文件。SVA：A型塞尼卡病毒（SenecavirusA）FMDV：口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus）RT-PCR:反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）qRT-PCR:實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Real-timeRT-PCR）Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號量達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Cyclethreshold）4試劑4.1引物探針引物序列見附錄A，上游、下游引物的使用濃度均為25pmol/μL。4.2RNA提取試劑盒宜選取商品化的病毒RNA提取試劑試劑盒。4.3PCR和qRT-PCR擴(kuò)增試劑應(yīng)按照不同的PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR平臺的說明書選取推薦的PCR和qRT-PCR擴(kuò)增試劑。4.4其他試劑宜選取商品化的反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、T4連接酶試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和電泳緩沖液。5主要儀器設(shè)備生物安全柜、普通PCR儀、熒光PCR儀、高速臺式冷凍離心機(jī)、電熱恒溫水槽、混勻器、組織勻漿機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、微量移液器。6操作步驟26.1操作環(huán)境有相應(yīng)的生物安全設(shè)施和不同功能分區(qū)，如樣品處理區(qū)、核酸提取區(qū)、樣品配液區(qū)、PCR擴(kuò)增區(qū)、結(jié)果觀察區(qū)等，各功能區(qū)須有專用試劑和實(shí)驗(yàn)耗材，不可交叉混用。操作時(shí)，應(yīng)在生物安全Ⅱ級及以上防護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)、無RNA酶的環(huán)境下進(jìn)行。6.2待檢樣品處理無菌采取發(fā)病豬淋巴結(jié)、水皰皮、痂皮等約1g樣品，置于2.0mLEP管中，加入滅菌的1mol/LPBS（pH7.2）1mL，用組織勻漿機(jī)或研缽充分研磨后，反復(fù)凍融3次；以10000×g離心5min，收集上清，用于RNA抽提，或置-20℃保存?zhèn)溆谩?.3待檢樣品RNA/DNA提取取200μL待檢樣品于無RNA/DNA酶的1.5mL離心管中，按照RNA/DNA提取試劑盒操作說明書抽提RNA/DNA。6.4反轉(zhuǎn)錄(RT)提取樣品總RNA后，以樣品總RNA為模板，按下列反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：5×RT緩沖液4μLAMV反轉(zhuǎn)錄酶（5U/μL）0.5μLdNTP混合物（各10mM/L）1μLRNA酶抑制劑（40U/μL）0.5μL隨機(jī)引物6聚體（50pmol/μL）1.5μL待檢總RNA模板5μL滅菌雙蒸水補(bǔ)足總體積至50μL加完試劑后瞬時(shí)離心混勻。將PCR反應(yīng)管置于普通RT-PCR儀內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃,10min；48℃,45min；95℃,5min。獲得的cDNA直接用于多重PCR擴(kuò)增，或置-20℃保存?zhèn)溆谩?.5多重PCR擴(kuò)增6.5.1反應(yīng)體系的配置反轉(zhuǎn)錄后，以獲得的cDNA為模板,建立25μLPCR反應(yīng)體系。在冰浴條件下，在PCR反應(yīng)管中按下列用量分別加入各成分：2×TaqPCRMasterMix12.5μLSVA和O型FMDV上游、下游引物（10pmol/μL）各0.75μL亞洲I型和A型FMDV上游、下游引物（10pmol/μL）各0.6μLcDNA模板2.5μL滅菌雙蒸水補(bǔ)足總體積至25μL6.5.2多重PCR反應(yīng)加完試劑后瞬時(shí)離心混勻。將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)，設(shè)置如下反應(yīng)參數(shù)：94℃3min；然后94℃30s，58℃30s,72℃30s,循環(huán)40次；最后72℃10min。PCR產(chǎn)物直接用于電泳，或置4℃保存?zhèn)溆谩?.6多重qRT-PCR6.6.1反應(yīng)體系的配置采用20μL反應(yīng)體系，擴(kuò)增體系配制如下：PremixExTaqTM(ProbeqPCR)SVA、A型及亞洲I型FMDV上、下游引物（20pmol/μL）SVA、A型及亞洲I型FMDV探針（20pmol/μL）O型FMDV特異性上、下游引物及探針（20pmol/μL）樣品RNA3滅菌雙蒸水6.6.2多重qRT-PCR反應(yīng)補(bǔ)足總體積至20μL在熒光PCR儀上選用CY5、FAM和JOE通道，設(shè)置如下反應(yīng)參數(shù)：42℃反轉(zhuǎn)錄15min，95℃預(yù)變性30s；然后40個(gè)循環(huán)（95℃5s；58℃34s），在每次循環(huán)的退火延伸時(shí)分別收集CY5、FAM和JOE通道的熒光信號。6.7陰性及陽性對照6.7.1陰性對照用滅菌雙蒸水作為陰性對照，與待檢樣品同時(shí)提取，再反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。6.7.2陽性對照已知病毒SVA分離株，F(xiàn)MDVO型疫苗株（O/Mya98/XJ/2010）、亞洲I型疫苗株（JSL株），A型疫苗株（AF/72株）作為陽性對照，與待檢樣品同時(shí)提取，再反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。7結(jié)果判定7.1多重RT-PCR結(jié)果判定7.1.1瓊脂糖凝膠制備稱取1.5g瓊脂糖加入到100mL1倍電泳緩沖液，煮沸溶解瓊脂糖，冷卻至約50℃時(shí)，加入10mg/mL的瓊脂糖凝膠10μL，充分混合后倒入水平的已插入合適梳子的凝膠盤中，凝膠厚度控制在3mm~5mm之間。待凝膠充分凝固后，拔出梳子，將凝膠連同托架一起放入電泳槽中，加入1倍電泳緩沖液，使之沒過凝膠表面2mm，以備加樣電泳。7.1.2加樣將5μLPCR產(chǎn)物與1μL加樣緩沖液混合均勻，加入一個(gè)瓊脂糖凝膠樣品孔中。每次電泳應(yīng)加陽性和陰性對照的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且設(shè)立DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作為分子質(zhì)量大小的對照。7.1.3電泳條件以100V穩(wěn)壓進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)離瓊脂糖凝膠末端2cm~3cm時(shí)停止。7.1.4電泳結(jié)果判定7.1.4.1將電泳后的瓊脂糖凝膠用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。當(dāng)陰性對照無任何DNA擴(kuò)增帶，而陽性對照在460bp、320bp、240bp和157bp位置出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立；否則，此次檢測無效。7.1.4.2若被檢樣品在460bp位置出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，判定為AsiaI型FMDV陽性，標(biāo)記為I-FMDV（+若被檢樣品在460bp位置未出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，判定為AsiaI型FMDV陰性，標(biāo)記為I-FMDV（-）。7.1.4.3被檢樣品在320bp位置出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，判定為A型FMDV陽性，標(biāo)記為A-FMDV（+）；若被檢樣品在320bp位置未出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，判定為A型FMDV陰性，標(biāo)記為A-FMDV（-）。7.1.4.4被檢樣品在240bp位置出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，判定為O型FMDV陽性，標(biāo)記為O-FMDV（+）；若被檢樣品在329bp位置未出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，判定為O型FMDV陰性，標(biāo)記為O-FMDV（-）。7.1.4.5被檢樣品在157bp位置出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，判定為SVA陽性，標(biāo)記為SVA（+）；若被檢樣品在157bp位置未出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，判定為SVA陰性，標(biāo)記為SVA（-）。7.2多重qRT-PCR結(jié)果判定7.2.1結(jié)果分析條件設(shè)定閾值設(shè)定根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性對照樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。47.2.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)7.2.2.1陰性對照樣品Ct值≥37。7.2.2.2陽性對照樣品的Ct值均應(yīng)<28，并出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。反之，此次檢測無效。7.2.3結(jié)果描述及判定7.2.3.1被檢樣品在CY5通道出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判定為SVA陽性，標(biāo)記為SVA（+）；若被檢樣品在CY5通道未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判定為SVA陰性，標(biāo)記為SVA（-）。7.2.3.2被檢樣品在FAM通道出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判定為O型FMDV陽性，標(biāo)記為O-FMDV（+）；若被檢樣品在FAM通道未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判定為O型FMDV陰性，標(biāo)記為O-FMDV（-）。7.2.3.3被檢樣品在TXR通道出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判定為A型FMDV陽性，標(biāo)記為A-FMDV（+）；若被檢樣品在TXR通道未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判定為A型FMDV陰性，標(biāo)記為A-FMDV（-）。7.2.3.4被檢樣品在JOE通道出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判定為AsiaI型FMDV陽性，標(biāo)記為I-FMDV（+）；若被檢樣品在JOE通道未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判定為AsiaI型FMDV陰性，標(biāo)記為I-FMDV（-）。5（規(guī)范性）引物探針序列及結(jié)果判定A.1多重RT-PCR特異性引物序列及擴(kuò)增片段長度見表A.1。表A.1引物序列及擴(kuò)增片段長度AGCCCCACGCACGTCATTGAGCCCAAGAGCACCCAAACACGGCGGTCTTGTGTGGTGA.2多重qRT-PCR特異性引物及探針序列見表A.2。表A.2引物序列、探針序列及擴(kuò)增片段長度AACAGATTGCAGCTTCTCGAGTCY5-CCTACTTCAAACCAGGAAAACAGCTGAGGAYTTYGTGAFAM-AACGGTTCTTCAAAACCCACCTGTTTXR-TGCCCCAGGCCACTACTGGCAJOE-CGAAAACATCACTGAGCTGCTGATCCA.3SVA和O型、A型、亞洲I型FMDV多重RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳6見圖A.1。M.DN分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000圖A.1SVA和O型、A型、亞洲I型FMDV多重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖A.4SVA和O型、A型、亞洲I型FMDV多重qRT-PCR擴(kuò)增曲線見圖A.2。圖A.2多重qRT-PCR擴(kuò)增曲線圖7（規(guī)范性）重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備B.1特異性引物特異性引物序列及擴(kuò)增片段長度見附錄A中的表A.1、A.2。B.2多重RT-PCR重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備以人工合成的含有SVA目的片段，以及O型、亞洲I型、A型FMDV疫苗株的cDNA為模板，應(yīng)用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得SVA3D基因157bp、O型FMDVVP1基因240bp、A型FMDVVP1基因320bp和亞洲I型FMDVVP1基因460bp的目的片段。經(jīng)回收PCR產(chǎn)物，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定正確后，獲得的重組質(zhì)粒分別命名為pSVA-3D、pO-VP1、pAsiaI-VP1及pA-VP1，作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。B.3