實驗二-萌發(fā)麥苗淀粉酶活性的測定

實驗二萌發(fā)麥苗淀粉酶活性的測定生物112周泓兆1102040226一、研究背景及目的酶作為生物體內(nèi)最重要的催化劑，其活性尤其受到關(guān)注。在這次實驗中，我們將對一些經(jīng)典經(jīng)典酶活力測定實驗進(jìn)行分析，對比其思路與設(shè)計差異，了解測定酶活力的基本方向和實驗技巧。完成小麥萌發(fā)過程中淀粉酶活力的測定并分析測定結(jié)果是否合理。二、原理淀粉在淀粉酶的催化作用下生成麥芽糖。本實驗便是通過測定淀粉酶在一定時間內(nèi)分解淀粉所產(chǎn)生的麥芽糖總量來測定酶的活性。根據(jù)其催化產(chǎn)物的特點和現(xiàn)有測定方法規(guī)定酶活力單位為：每分鐘每克鮮重麥種所催化生成的麥芽糖毫克數(shù)（毫克麥芽糖*克-1鮮重*分-1）。本實驗涉及α-淀粉酶與β-淀粉酶，我們可通過鈍化β-淀粉酶的方法單獨測定α-淀粉酶的活性。本實驗所使用的3,5－二硝基水楊酸法是一種對還原糖定量測定的方法。還原糖和堿性二硝基水楊酸試劑一起共熱，產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物，在一定的濃度范圍內(nèi)，棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度與還原糖的量成正比。因此，我們可以測定樣品中還原糖以及總糖的量。麥芽糖是還原性糖，可用該方法對其含量進(jìn)行測定。儀器與試劑儀器：TDL-40B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），722光柵分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司），DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），JP-100架盤藥物天平（常熟市雙杰測試儀器廠），HCTP12A1架盤藥物天平（北京醫(yī)用天平廠）試劑：麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液，pH5.6的檸檬酸緩沖液，3,5-二硝基水楊酸溶液，0.4MNaOH，F(xiàn)olin-酚試劑甲，F(xiàn)olin-酚試劑乙，標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液（1mg/ml）材料：萌發(fā)的小麥種子（芽長約1cm）實驗方法/操作步驟酶液的制備：稱取兩克萌發(fā)的小麥種子（芽長一厘米左右），置研缽中加少量石英砂，以蒸餾水作為勻漿液，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中至40ml左右，室溫浸提15-20分鐘，浸提充分后定容至刻度，混勻后3500r/min離心20min，取上清液備用（初始酶液）。取15支試管，分別編號α-測定管1、α-測定管2、α-對照管1、α-對照管2、α+β-測定管1、α+β-測定管2、α+β-對照管1、α+β-對照管2與1、2、3、4、5、6、7。在α-測定管1、α-測定管2、α-對照管1、α-對照管2中各加入酶液1ml在70℃恒溫水浴中準(zhǔn)確加熱15min，取出后立即在冰浴中冷卻至室溫或更低。取出后分別在四支試管中各加入1mlpH5.6檸檬酸緩沖液，置于40℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫15min。之后向兩支對照管中各加入4ml0.4MNaOH，再向各管分別加入40℃下預(yù)熱的淀粉溶液2ml，搖勻，立即于40℃水浴中準(zhǔn)確保溫5min，然后向兩支測定管分別迅速加入4ml0.4MNaOH，搖勻備用。取制備的酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，混合均勻后，在α+β-測定管1、α+β-測定管2、α+β-對照管1、α+β-對照管2中各加入1ml稀釋后的酶液與1mlpH5.6檸檬酸緩沖液置于40℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫15min。之后向兩支對照管中各加入4ml0.4MNaOH，再向各管分別加入40℃下預(yù)熱的淀粉溶液2ml，搖勻，立即于40℃水浴中準(zhǔn)確保溫5min，然后向兩支測定管分別迅速加入4ml0.4MNaOH，搖勻備用。取編號1、2、3、4、5、6、7的七支試管，分別加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0ml，然后將各管用蒸餾水準(zhǔn)確補(bǔ)充至1.0ml，搖勻。在α-測定管1、α-測定管2、α-對照管1、α-對照管2、α+β-測定管1、α+β-測定管2、α+β-對照管1、α+β-對照管2與1、2、3、4、5、6、7管內(nèi)各加入1ml3,5二硝基水楊酸試劑混勻，同時在沸水浴中準(zhǔn)確保溫5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋到15ml，混勻。依次取各試管溶液在520nm波長下進(jìn)行比色，記錄消光值。以1、2、3、4、5、6、7管消光值作為縱坐標(biāo)，麥芽糖含量作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行結(jié)果計算。Folin-酚測萌發(fā)麥苗水溶性蛋白含量：稱取0.5g萌發(fā)的小麥種子（芽長一厘米左右），置研缽中加少量石英砂，以蒸餾水作為勻漿液，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中至40ml左右，室溫浸提15-20分鐘，浸提充分后定容至刻度，混勻后3500r/min離心20min，取上清液備用。取9支具塞試管，分別標(biāo)上待測液1、待測液2、待測液3與F1-F6。分別在F1-F6中加入標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，然后將各管用蒸餾水補(bǔ)充到1.0ml。再各取1ml上清液（步驟8）于標(biāo)有待測液1、待測液2、待測液3的試管中。在這九支試管中各加試劑甲5ml，混勻后室溫下放置10min，再加試劑乙0.5ml，立即混勻，30min后測定各管的OD650。數(shù)據(jù)整理樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線管號1234567OD5200.0000.0620.2510.3500.4540.6110.649均值管號α-測定管1α-測定管2α-對照管1α-對照管2α+β-測定管1α+β-測定管2α+β-對照管1α+β-對照管2OD5200.2960.3000.1590.1630.3420.3360.1910.175均值0.2980.1610.3390.183樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線待測液管號F1F2F3F4F5F6待測液1待測液2待測液3OD6500.0000.1260.2690.3560.4610.5520.5560.5540.551均值0.554結(jié)果計算與討論分析根據(jù)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：路說明我們在實驗設(shè)計時要考慮其在操作時的合理性，使實驗操作盡可能簡便。α-淀粉酶活性測定時70℃水浴為何要嚴(yán)格保溫15分鐘？保溫后為什么要立即于冰浴中驟冷？而經(jīng)如此處理，為什么在隨后的40℃溫浴和酶促反應(yīng)中就能保證β-淀粉酶不會再參與催化反應(yīng)。答，保溫時間過短β-淀粉酶失活不完全，時間過長導(dǎo)致α-淀粉酶也有一部分被鈍化，所以要嚴(yán)格保溫15分鐘。立即于冰浴中驟冷是為了減小β-淀粉酶在降溫過程中的復(fù)性。經(jīng)過巨大的溫度變化，不耐高溫的β-淀粉酶會徹底失活，所以在隨后的40℃溫浴和酶促反應(yīng)中就能保證β-淀粉酶不會再參與催化反應(yīng)。酶的最適反應(yīng)溫度（一般都是生理溫度）和最適保存溫度（一般0℃以下）為什么不一樣？而這兩個狀態(tài)都是需要維護(hù)酶的空間結(jié)構(gòu)。答：最適反應(yīng)溫度時，酶的結(jié)構(gòu)最適合誘導(dǎo)底物與之結(jié)合形成酶-底物復(fù)合物，因此體現(xiàn)出酶的活性最強(qiáng)。而在最適保存溫度時，酶的穩(wěn)定性最好，催化能力很低，從而很好地保存了酶的活性。6.為什么3，5-二硝基水楊酸與還原糖的反應(yīng)要先沸水浴然后再稀釋測定？答：原糖和堿性二硝基水楊酸試劑一起共熱，產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物。因此在沸水浴時，溶液濃度越大反應(yīng)越完全。而在比色法測定時，濃度過大無法測定，因此需要稀釋以后進(jìn)行測定，使數(shù)據(jù)盡可能符合朗伯-比爾定律。7.在設(shè)計酶活測定的實驗時，要求酶促反應(yīng)初速度對底物濃度的小量變化不敏感，具體要求為：在底物濃度有10%的變化幅度范圍內(nèi)，而所測初速度的變化幅度小于1%。則[S]/Km應(yīng)該大于多少才能保證這一點？（設(shè)定為米氏酶）答：根據(jù)米氏方程：v=(Vmax[S])/(Km+[S])，根據(jù)題意：0.9[S]≤[S']≤1.1[S]，則0.99v≤v'≤1.01v,計算可得：[S]/Km＞8.18。8.轉(zhuǎn)氨酶在細(xì)胞內(nèi)的作用及生理意義？細(xì)胞內(nèi)有眾多的轉(zhuǎn)氨酶，但相關(guān)研究及醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中卻幾乎都是只檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）的活力，而極少測定其它轉(zhuǎn)氨酶活力，你推測可能的原因會是什么？為什么？答：轉(zhuǎn)氨酶在細(xì)胞內(nèi)催化酮酸與氨基酸或氨基酸之間的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，可以生成非必須氨基酸或產(chǎn)生酮酸分解產(chǎn)能或作為糖和脂肪酸的原料。轉(zhuǎn)氨酶在肝臟中作用巨大，其中以谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）最為重要。前者是催化谷氨酸與丙酮酸之間的轉(zhuǎn)氨作用，后者是催化谷氨酸與草酰乙酸之間的轉(zhuǎn)氨作用，其反應(yīng)產(chǎn)物丙酮酸和草酰乙酸都是代謝的重要中間產(chǎn)物，而且GPT和GOT的活性在人體轉(zhuǎn)氨酶中是最高的，所以但相關(guān)研究及醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中卻幾乎都是只檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）的活力。9、轉(zhuǎn)氨酶催化的是雙底物可逆反應(yīng)，根據(jù)酶活力測定的總體思路，要保證測定反應(yīng)的初速度，根據(jù)實驗指導(dǎo)所提供的資料，你認(rèn)為是否保證了這一點？是如何保證的？答：保證了這一點。通過加入過量的底物促進(jìn)了正反應(yīng)進(jìn)行，而且適當(dāng)增長了反應(yīng)時間，使正反應(yīng)反應(yīng)充分。10、指導(dǎo)所提供的兩個轉(zhuǎn)氨酶活力測定實驗方案，設(shè)計的酶促反應(yīng)時間是多少？終止酶促反應(yīng)用的什么試劑？與淀粉酶活力測定規(guī)定的酶促反應(yīng)時間相比是否有差異？差異可能的原因你分析認(rèn)為會是因為什么？答：酶促反應(yīng)的時間是10min，用4ml0.4MNaOH終止酶促反應(yīng)，時間較淀粉酶活力測定規(guī)定的酶促反應(yīng)的時間5min要多5min，我認(rèn)為差異的原因為粉酶催化的反應(yīng)為不可逆反應(yīng)而轉(zhuǎn)氨酶化的反應(yīng)為可逆反應(yīng)，時間適當(dāng)延長可以使正反應(yīng)充分。九、實