赤靈芝多糖抗病毒活性和增強(qiáng)免疫作用研究

赤靈芝多糖抗病毒活性和增強(qiáng)免疫作用研究畜禽傳染性疾病,尤其是病毒性疾病,是危害畜牧業(yè)發(fā)展的首要問題,由于它們能造成畜禽養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失而在全世界范圍內(nèi)備受關(guān)注。因病毒具有獨(dú)特的生物特征和發(fā)病機(jī)理,目前還沒有針對(duì)病毒性疾病有效的治療方法,所以疫苗接種則成了主要的預(yù)防措施。雖然有關(guān)傳染性疾病疫苗的研究和應(yīng)用很多,但現(xiàn)有疫苗的免疫效果卻不盡人意,很多疫苗由于病毒的易變異性和理化因素等影響,經(jīng)常出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象。近年來,在畜禽免疫方面,中藥多糖增強(qiáng)免疫應(yīng)用受到了獸醫(yī)界醫(yī)藥科研者的廣泛關(guān)注。研究證明,許多中藥及其組分具有一定的抗病毒和增強(qiáng)免疫作用,一些中藥及其組分在疫苗接前后使用,這樣可以提高機(jī)體免疫力,降低傳染病發(fā)病率。靈芝(Ganodermalucidum)在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久,靈芝的藥用成分非常豐富,尤其是從靈芝中提取的靈芝多糖(Ganodermalucidumpolysaccharides,GLP)。近年來試驗(yàn)研究表明,靈芝多糖具有增強(qiáng)免疫功能、抗病毒、抗炎癥、抑制腫瘤、降血壓、護(hù)肝等作用,上述研究主要集中在人醫(yī)上,且相關(guān)作用已得到多方面的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,但靈芝多糖在畜禽生產(chǎn)方面的研究還很有限,尤其是在畜禽生產(chǎn)中抗病毒和增強(qiáng)免疫作用方面的研究甚少。因此,本論文以赤靈芝多糖為研究目標(biāo),通過相關(guān)體內(nèi)外試驗(yàn),研究了赤靈芝多糖抗病毒與免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)理,為赤靈芝多糖在養(yǎng)禽養(yǎng)殖上的應(yīng)用以及在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開發(fā)新型免疫增強(qiáng)劑奠定基礎(chǔ)。具體試驗(yàn)安排分以下八個(gè)部分:1.赤靈芝多糖對(duì)NDV、IBDV感染細(xì)胞能力的影響目的:探究赤靈芝多糖的體外抗病毒活性作用。方法:將赤靈芝多糖與IBDV、NDV兩種病毒分別以3種加樣方式(先加藥,先加病毒,病毒和多糖感作后同時(shí)加入)加入培養(yǎng)24h的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上,MTT法測(cè)定細(xì)胞活性以評(píng)價(jià)赤靈芝多糖對(duì)雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)、雞新城疫病毒(NDV)兩種病毒感染CEF能力的影響。結(jié)果:先加赤靈芝多糖后接種病毒的方式,赤靈芝多糖在9.766～625μg.mL-1時(shí),其A570均顯著大于病毒對(duì)照組;先加病毒后,赤靈芝多糖對(duì)NDV無(wú)明顯抑制作用,且只有在高濃度才體現(xiàn)抑制IBDV作用;病毒和多糖感作后同時(shí)加入,赤靈芝多糖在9.766～625μg·mL-1時(shí),其A570均顯著大于IBDV對(duì)照組,而所有的多糖組A570均顯著大于NDV對(duì)照組。結(jié)論:赤靈芝多糖對(duì)IBDV、NDV兩種病毒感染CEF有一定的抑制作用,尤其是提前給多糖方式效果較好,提示赤靈芝多糖對(duì)病毒吸附宿主細(xì)胞有阻斷和抑制作用。2.赤靈芝多糖對(duì)CEF細(xì)胞中IFN-β的mRNA表達(dá)影響目的:探討赤靈芝多糖對(duì)CEF抗病毒感染的能力的影響機(jī)理。方法:選用Oligo7軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)干擾素-β(Interferonβ,IFN-β)引物,用熒光定量PCR方法測(cè)定了赤靈芝多糖對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞IFN-β的mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果:赤靈芝多糖能誘導(dǎo)CEF中IFN-β的表達(dá),使IFN-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高,尤其是靈芝多糖在156.25μg·mL-1時(shí),能夠顯著促進(jìn)CEF中IFN-β的表達(dá)(P<0.05),在39.065和78.125μg·mL-1時(shí)能促進(jìn)IFN-βmRNA的表達(dá),但與對(duì)照組差異不顯著。結(jié)論:結(jié)合之前抗病毒試驗(yàn)結(jié)果分析,赤靈芝多糖對(duì)CEF抗病毒作用的影響與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-β有關(guān),可能是IFN-β干擾了病毒吸附宿主細(xì)胞,這也許是赤靈芝多糖增強(qiáng)CEF抗病毒感染能力的分子機(jī)制之一。3.赤靈芝多糖對(duì)雞外周血淋巴細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響目的:探討赤靈芝多糖對(duì)體外培養(yǎng)雞外周血淋巴細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響。方法:將不同濃度的赤靈芝多糖單獨(dú)或協(xié)同伴刀豆素球蛋白(ConA)刺激仔雞外周血淋巴細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞,采用MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果:單獨(dú)刺激外周血淋巴細(xì)胞時(shí),GLP在0.070～2.25mg·mL-1的劑量范圍內(nèi),其吸光度值均顯著大于細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05),協(xié)同ConA刺激外周血淋巴細(xì)胞時(shí),GLP+ConA組在0.141～2.25mg·mL-1吸光度值顯著大于ConA對(duì)照組(P<0.05)。單獨(dú)刺激脾臟淋巴細(xì)胞時(shí),GLP在0.035～2.25mg·mL-1濃度時(shí)的吸光度值顯著大于細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05),協(xié)同ConA刺激脾臟淋巴細(xì)胞時(shí),GLP+ConA組在0.035～2.25mg·mL-1吸光度值顯著大于ConA對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論:赤靈芝多糖在體外不僅能單獨(dú)刺激雞淋巴細(xì)胞增殖,與ConA具有協(xié)同刺激作用,且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。4.赤靈芝多糖體外對(duì)雞外周血淋巴細(xì)胞中IL-6、IFN-γmRNA表達(dá)的影響目的:探究赤靈芝多糖增強(qiáng)免疫的機(jī)理。方法:用Oligo7軟件設(shè)計(jì)了白介素-6(Interleukin6,IL-6)引物、干擾素-γ(Interferonγ,IFN-y)引物,利用多糖輔助ConA刺激的雞外周血淋巴細(xì)胞,并從中提取總RNA。熒光定量PCR方法測(cè)定赤靈芝多糖對(duì)雞外周血淋巴細(xì)胞IL-6、IFN-y的mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果:赤靈芝多糖在合適的濃度下能夠協(xié)同ConA促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞中IL-6、IFN-ymRNA的表達(dá),與ConA對(duì)照組相比,GLP在562.5μg·mL-1、281.25μg·mL-1時(shí)能夠顯著促進(jìn)IL-6mRNA的表達(dá)(P<0.05),GLP在140.63μg·mL-1時(shí)能夠顯著促進(jìn)IFN-ymRNA的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論:赤靈芝多糖在合適的濃度下能夠促進(jìn)IL-6、IFN-γmRNA的表達(dá),這可能是其增強(qiáng)免疫的機(jī)理之一。5.赤靈芝多糖對(duì)雛雞黏膜免疫功能的影響目的:探討赤靈芝多糖對(duì)免疫雛雞黏膜免疫功能的影響。方法:1日齡非免疫羅曼蛋公雞飼養(yǎng)至14日齡,隨機(jī)選取225只,分為5組,除空白對(duì)照組外均用新城疫Ⅳ苗滴鼻、點(diǎn)眼免疫,1羽份/羽,28日齡二免。在每次免疫的同時(shí),3個(gè)藥物劑量組分別灌服不同濃度的赤靈芝多糖溶液,連續(xù)3天,免疫對(duì)照組和空白對(duì)照組不給藥。在二免后第14天分別各組隨機(jī)抽取5羽,放血致死,采取十二指腸和盲腸扁桃體,用免疫組化法測(cè)定腸絨毛和盲腸扁桃體SIgA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果:赤靈芝多糖在50、25、12.5mg·kg-1劑量時(shí)可以顯著提高十二指腸和盲腸扁桃體的SIgA細(xì)胞陽(yáng)性數(shù),其中25mg·kg-1劑量組SIgA水平最高。結(jié)論:赤靈芝多糖可以有效地提高SIgA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目,從而增強(qiáng)機(jī)體黏膜免疫。6.赤靈芝多糖對(duì)免疫雛雞外周血淋巴細(xì)胞IL-6、IFN-γmRNA表達(dá)的影響目的:探討赤靈芝多糖對(duì)免疫雛雞白介素-6(Interleukin6,IL-6)、干擾素-γ(Interferonγ,IFN-γ)表達(dá)的影響,分析赤靈芝多糖體內(nèi)增強(qiáng)免疫機(jī)理。方法:1日齡非免疫羅曼蛋公雞飼養(yǎng)至14日齡,隨機(jī)選取225只,分為5組,除空白對(duì)照組外均用新城疫Ⅳ苗滴鼻、點(diǎn)眼免疫,1羽份/羽,28日齡二免。在每次免疫的同時(shí),3個(gè)藥物劑量組分別灌服不同濃度的靈芝多糖溶液,連續(xù)3天,免疫對(duì)照組和空白對(duì)照組不給藥。在首免后第28天分別各組隨機(jī)抽取5羽,無(wú)菌心臟采血,分離淋巴細(xì)胞,并從中提取總RNA。用Oligo7軟件設(shè)計(jì)IL-6引物、IFN-γ引物。熒光定量PCR方法測(cè)定赤靈芝多糖對(duì)免疫雛雞外周血淋巴細(xì)胞IL-6、IFN-γmRNA表達(dá)的影響。結(jié)果:赤靈芝多糖在50、25mg·kg-1時(shí)能夠顯著促進(jìn)IL-6、IFN-γmRNA的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論:赤靈芝多糖在體內(nèi)能夠促進(jìn)細(xì)胞因子IL-6、IFN-γmRNA的表達(dá),這可能是其增強(qiáng)免疫的機(jī)理之一。7.赤靈芝多糖對(duì)雛雞新城疫疫苗免疫應(yīng)答影響目的:研究赤靈芝多糖對(duì)新城疫免疫雛雞外周血淋巴細(xì)胞增殖、免疫器官指數(shù)以及抗體效價(jià)的影響。方法:300只1日齡羅曼蛋公雞飼養(yǎng)至14日齡,隨機(jī)分為6組,除空白對(duì)照組外均用新城疫疫苗滴鼻、點(diǎn)眼免疫,1羽份/羽,28日齡時(shí)進(jìn)行二免,在每次免疫的同時(shí),分別灌服3種不同濃度的赤靈芝多糖溶液,藥物對(duì)照組灌服黃芪多糖溶液,連續(xù)3天,免疫對(duì)照組和空白對(duì)照組不給藥。分別在首免后的第7天、14天,21天、28天測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞增殖活性、新城疫抗體效價(jià),在首免后第28天隨機(jī)抽取5只處死,稱取胸腺、脾臟和法氏囊重量,計(jì)算免疫器官指數(shù)。結(jié)果:赤靈芝多糖在50、25mg·kg-1時(shí)可以促進(jìn)雛雞外周血淋巴細(xì)胞增殖、提升機(jī)體血清抗體效價(jià),提高免疫器官指數(shù)等。結(jié)論:赤靈芝多糖可以提高機(jī)體的免疫能力,增強(qiáng)疫苗的免疫效果。8.赤靈芝多糖對(duì)免疫雛雞抗新城疫病毒影響目的:研究赤靈芝多糖對(duì)免疫雛雞抗新城疫病毒影響。方法:280只1日齡羅曼蛋公雞飼養(yǎng)至14日齡,隨機(jī)分為7組,除空白對(duì)照組外均用新城疫疫苗滴鼻、點(diǎn)眼免疫,1羽份/羽,28日齡時(shí)進(jìn)行二免,在每次免疫的同時(shí),分別灌服3種不同濃度的赤靈芝多糖