大鼠硅肺纖維化組織cDNA消減文庫(kù)的構(gòu)建和差異表達(dá)基因的克隆

大鼠硅肺纖維化組織cDNA消減文庫(kù)的構(gòu)建和差異表達(dá)基因的克隆前言:肺纖維化是一組由多種病因引起的肺破壞性疾病,肺纖維化過(guò)程包括肺組織的炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞以及隨后伴有的肺間質(zhì)細(xì)胞積聚的組織修復(fù)過(guò)程。在此過(guò)程中,肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等生物活性物質(zhì),發(fā)揮直接或間接的作用,從而使這些參與肺纖維化的多種細(xì)胞共同構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò),彼此間相互影響,共同促進(jìn)了病變發(fā)展。但目前對(duì)該疾病發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用的細(xì)胞分子機(jī)制尚不清楚,迄今為止仍未找到有效的防治措施。目前肺纖維化的動(dòng)物研究模型大多數(shù)僅限于在病變?cè)缙?尚未形成典型的肺纖維化病變,因此也不能分析肺纖維化病變與其他疾病的關(guān)系。目前認(rèn)為慢性阻塞性肺疾病、間質(zhì)性肺病(石棉肺、硅肺、特發(fā)性間質(zhì)性肺纖維化等)均為肺癌的危險(xiǎn)因素,間質(zhì)性肺纖維化引發(fā)肺癌的機(jī)制目前尚不清楚,大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為,間質(zhì)性肺纖維化由于炎癥損傷和修復(fù)的相互作用可導(dǎo)致局部上皮反復(fù)的細(xì)胞及基因損傷,通過(guò)連續(xù)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?nèi)缁?異常增生,非典型增生而最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。故加深對(duì)肺纖維化發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí),并在此基礎(chǔ)上發(fā)展新的治療策略已成為更加迫切的需要。目的:本研究擬通過(guò)建立大鼠慢性硅肺纖維化動(dòng)物模型,利用SSH技術(shù),篩選和鑒定硅肺纖維化大鼠與正常大鼠之間肺組織差異表達(dá)基因,旨在獲得與肺纖維化相關(guān)的特異表達(dá)基因,為肺纖維化發(fā)生機(jī)制及與其他疾病的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:本研究以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用氣管插管灌注二氧化硅粉塵,經(jīng)過(guò)360天,建立硅肺肺纖維化動(dòng)物模型;應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)(SSH),結(jié)合T/A克隆技術(shù)和藍(lán)白篩選構(gòu)建了硅肺肺纖維化正反向差異表達(dá)消減cDNA文庫(kù)(SNA,SNB);經(jīng)過(guò)菌液PCR技術(shù)初步驗(yàn)證,插入片段大小,采用半定量RT—PCR技術(shù)證實(shí)部分基因確實(shí)存在差異表達(dá),隨機(jī)挑取部分含有插入片段的克隆進(jìn)行測(cè)序分析及生物信息學(xué)分析。結(jié)果:1、360天,X線(xiàn)顯示大鼠肺紋理增粗,肺野有散在分布的高密度影出現(xiàn)。肉眼見(jiàn)肺組織表面及切面有散在分布的灰白色小結(jié)節(jié),結(jié)節(jié)大小不等;顯微鏡下肺內(nèi)有典型的纖維性硅結(jié)節(jié)形成,在部分硅結(jié)節(jié)周?chē)闻萆掀ぜ?xì)胞和管上皮明顯增生,部分細(xì)胞顯不同程度不典型增生,肺間質(zhì)纖維化明顯。2、分別以肺纖維化肺組織cDNA為實(shí)驗(yàn)方(Tester),以正常肺組織為對(duì)照方(Driver),以正常肺組織cDNA為實(shí)驗(yàn)方(Tester),以肺纖維化肺組織cDNA為對(duì)照方(Driver)構(gòu)建了反向差異表達(dá)消減cDNA文庫(kù)(SNB)。經(jīng)過(guò)菌液PCR技術(shù)初步驗(yàn)證,插入片段大小主要分布于200-600bp之間。隨機(jī)挑取正向和反向消減文庫(kù)共52個(gè)含有插入片段的克隆進(jìn)行測(cè)序分析,共獲得47個(gè)有效差異表達(dá)cDNA片段。為證實(shí)這些基因確實(shí)存在差異表達(dá),采用半定量RT—PCR技術(shù)對(duì)隨機(jī)挑選的硅肺纖維化肺組織消減文庫(kù)中的SNA—11、SNA—28、SNA—43、SNA—48,正常肺組織消減文庫(kù)中的SNB—13、SNB—30、SNB—42進(jìn)行RT—PCR分析,結(jié)果顯示它們?cè)诠璺卫w維化肺組織和正常肺組織中的表達(dá)存在差異,根據(jù)圖像掃描定量分析,在兩組肺組織中基因表達(dá)量相差在2—5倍以上。3、生物信息學(xué)分析表明雙向消減cDNA文庫(kù)測(cè)序得到的47個(gè)陽(yáng)性克隆代表了35個(gè)基因,包含2個(gè)假想蛋白、4個(gè)推測(cè)的相似蛋白。其中大多數(shù)功能已知基因在細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)/運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞/機(jī)體防御、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯/表達(dá)調(diào)控、代謝等方面起重要作用。表明SSH技術(shù)是篩選差異表達(dá)基因的有效方法,對(duì)這些基因功能的步研究,有利于從另外的角度了解肺纖維化的機(jī)制。結(jié)論:1成功建立了典型大鼠慢性硅肺纖維化動(dòng)物模型。2建立了較高質(zhì)量的硅肺纖維化正反差異消