輔助生殖科輔助生殖實(shí)驗(yàn)室技術(shù)操作規(guī)范

輔助生殖實(shí)驗(yàn)室技術(shù)操作規(guī)范第一章.精液檢查及精子制備第一節(jié)、精液常規(guī)檢查操作方法實(shí)驗(yàn)者收到取精杯后應(yīng)首先核對(duì)取精杯上姓名、編號(hào)是否與精液送檢單符合，同時(shí)核對(duì)精液送檢單上是否漏填重要信息，確認(rèn)無(wú)誤后方可接收。操作技術(shù)將在原按WHO第四版實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)手冊(cè)的基礎(chǔ)上過(guò)渡，逐步以WHO第五版實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)手冊(cè)(WHOlaboratorymanualfortheExaminationandProcessingofhumansemen，fifthedition)所規(guī)定的方法實(shí)施精液常規(guī)檢查，并以其規(guī)定格式出檢驗(yàn)報(bào)告。同一份精液標(biāo)本若有多個(gè)檢查項(xiàng)目，按各項(xiàng)目要求分別做標(biāo)本處理和檢驗(yàn)。(一)初步檢驗(yàn)：1．液化后精液檢查前應(yīng)認(rèn)真記錄：精液檢查通知單所提供的全部信息2．觀察記錄：精液量、顏色、粘稠度、Ph值及液化時(shí)間3．取液化精液10微升滴于潔凈載玻片上，用蓋玻片覆蓋后靜止片刻4．置生物顯微鏡下觀察精液大致狀況并記錄鏡下所見：圓細(xì)胞數(shù)(生殖道上皮細(xì)胞、生精細(xì)胞及白細(xì)胞)、紅細(xì)胞數(shù)和凝集團(tuán)塊等，并以個(gè)/HP表示。(二)操作方法：1．取液化后精液10微升，滴于MACRO計(jì)數(shù)板中央計(jì)數(shù)池內(nèi)，加蓋；2．置生物顯微鏡下觀察精子濃度及活力。具體方法如下：分別計(jì)數(shù)10個(gè)小格內(nèi)前向精子(PR)、非前向精子(NP)及不動(dòng)精子(IM)的數(shù)目，PR+NP+IM之和即為精子密度(×106/ml)，精子活力分別以PR精子、PR+NP精子占總精子數(shù)的百分比表示，計(jì)算方法為：PR/(PR+NP+IM)×100%，(PR+NP)/(PR+NP+IM)×100%。附精子活力分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：PR：前向運(yùn)動(dòng)精子，不考慮速度NP：各種形式的非前向運(yùn)動(dòng)精子IM：不動(dòng)精子(三)檢驗(yàn)后處理1．以清水沖洗MACRO計(jì)數(shù)板并用酒精棉簽擦拭；2．以酒精紗布擦拭顯微鏡臺(tái)面及實(shí)驗(yàn)臺(tái)面；3．一次性實(shí)驗(yàn)物品丟棄于指定地點(diǎn)；4．剩余標(biāo)本按規(guī)定進(jìn)行污物處理第二節(jié)、精子形態(tài)分析操作方法1．取液化后精液20微升，滴于載玻片一端(上方約1/3處)；2．用另一張載玻片置于滴有精液處與其形成30度角，均勻拉開液滴(詳見WHO實(shí)驗(yàn)手冊(cè))，室溫干燥；3．將干燥后的載玻片置于95%酒精中固定15分鐘，取出室溫干燥后行巴氏染色；4．100倍油鏡下行精子形態(tài)學(xué)分析，計(jì)數(shù)100~200條精子。結(jié)果描述：參閱WHO實(shí)驗(yàn)手冊(cè)正常形態(tài)率%異常形態(tài)率%(分別記錄：頭、體、尾及混合畸形率)第三節(jié)、精子低滲腫脹試驗(yàn)(HOS)(一)配制低滲腫脹液溶0.735g枸椽酸鈉Na3C6H5O7·2H2O和1.351g果糖于100ml蒸餾水中。將該溶液分裝于-20度凍存。用前解凍并充分混勻。(二)實(shí)驗(yàn)方法1．取1ml腫脹液于一只加蓋的Eppendorf管中，37度溫?zé)峒s5分鐘。加入0.1mL液化精液，并用吸管輕輕吹打混勻。2．在37度下至少保持30分鐘(注意：不要超過(guò)120分鐘)，相差顯微鏡下觀察精子細(xì)胞。3．計(jì)數(shù)200條精子，計(jì)算發(fā)生腫脹的精子所占百分比。精子尾部形狀發(fā)生變化的定義為精子腫脹。(三)結(jié)果描述腫脹精子所占百分比可以代表存活精子的比例。(四)注意事項(xiàng)1．某些精液標(biāo)本在置于HOS溶液前即有尾部卷曲的精子，因此要在放置于HOS溶液前觀察射出精液。處理后獲得的尾部卷曲精子的百分比減去未處理標(biāo)本中尾部卷曲精子的百分比，即可以得到HOS試驗(yàn)中出現(xiàn)反應(yīng)的精子的實(shí)際百分比。2．在臨床使用前，應(yīng)當(dāng)用老批號(hào)的HOS溶液對(duì)新批號(hào)的HOS溶液進(jìn)行校驗(yàn)，二者不應(yīng)有顯著性差異(配對(duì)t檢驗(yàn)P＞0.05)。如果差異顯著應(yīng)廢棄該批試劑，重新配制。全自動(dòng)精子分析系統(tǒng)使用說(shuō)明(西班牙SCA全自動(dòng)精液質(zhì)量分析系統(tǒng))全自動(dòng)精子分析系統(tǒng)可自動(dòng)探測(cè)精子運(yùn)動(dòng)軌跡，按WHO實(shí)驗(yàn)手冊(cè)內(nèi)CASA各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)，計(jì)數(shù)精子活率、活力、密度、直線運(yùn)動(dòng)速率等。系統(tǒng)由電腦軟件和顯微鏡兩部分組成。操作方法如下：(一)初步檢驗(yàn)：參見精液常規(guī)檢查操作方法相關(guān)部分。(二)自動(dòng)分析：1．開啟電腦→CASA分析軟件→建立新檔案(鍵入患者信息)→保存2．取液化精液10微升滴于精子計(jì)數(shù)板中央計(jì)數(shù)池內(nèi)，加蓋玻片→置相差顯微鏡下(10×)調(diào)節(jié)視野至圖像清晰3．點(diǎn)擊密度活動(dòng)力分析→進(jìn)入分析界面→分析→保存結(jié)果(如果需要，可以做人工校正)→報(bào)告單(預(yù)覽或打印)→退出分析系統(tǒng)4．報(bào)告部分內(nèi)容記錄于《精液分析登記本》上，年終存檔保留。(三)分析后處理：參見精液常規(guī)檢查操作方法相關(guān)部分。第五節(jié)、抗精子抗體(MAR)檢測(cè)方法(一)原理：本試驗(yàn)以人IgG敏化綿羊紅細(xì)胞，用人IgG制備羊抗人IgG血清，采用MAR法檢測(cè)標(biāo)本中IgG類抗精子抗體。試劑由A液、B液和C液組成。(二)步驟：1．取液化精液10微升滴于載玻片上，加入A液10微升混勻，放置15秒；2．加入B液10微升混勻，覆以蓋玻片。分別在3分鐘和10分鐘后于生物顯微鏡(40×)或相差鏡下鏡檢，觀察運(yùn)動(dòng)精子表面是否黏附有敏化的紅細(xì)胞(sRBC)。(三)結(jié)果判定：1．精子表面無(wú)AsAb，可見精子在粘附的sRBC間自由泳動(dòng)，敏化sRBC間的凝集說(shuō)明試劑可靠。2．精子表面有AsAb存在，則敏化sRBC粘附于精子上并一同扭動(dòng)。在強(qiáng)陽(yáng)性情況下，凝集塊極為巨大，精子只在敏化sRBC形成的凝塊中扭動(dòng)。3．至少計(jì)數(shù)100條活動(dòng)精子，計(jì)算粘附有sRBC的活動(dòng)精子在總活動(dòng)精子中所占的百分比。4．陽(yáng)性率R=(粘附sRBC的活動(dòng)精子數(shù)/計(jì)數(shù)總活動(dòng)精子數(shù))×100%R≤10%，判定為陰性；R＞10%，陽(yáng)性；R≥40%，判定為強(qiáng)陽(yáng)性。(四)注意事項(xiàng)：1．試劑需室溫平衡后使用；2．A液使用前應(yīng)充分混勻；3．液化不良精液可用C液洗滌后檢測(cè)；4．標(biāo)本中活動(dòng)精子密度高時(shí)，應(yīng)適當(dāng)增加活動(dòng)精子計(jì)數(shù)的數(shù)目。第六節(jié)、細(xì)針附睪/睪丸穿刺取精術(shù)及精子制備常規(guī)(一)操作步驟：1．準(zhǔn)備10ml和5ml及1ml注射器各1支，2%利多卡因5-10ml。將5ml2%利多卡因注射在陰囊部精索內(nèi)，封閉精索神經(jīng)。2．術(shù)者用左手固定附睪，選擇無(wú)血管區(qū)以1ml注射器在睪丸表面及陰囊皮膚內(nèi)注入0.5ml2%利多卡因作局部麻醉后，以10ml注射器直接經(jīng)皮刺入附睪或睪丸后，邊持續(xù)負(fù)壓抽吸邊退出，利用負(fù)壓抽出附睪內(nèi)精子或睪丸內(nèi)曲細(xì)精管，取下放入含培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中間凹內(nèi)，立即轉(zhuǎn)交實(shí)驗(yàn)室處理。3．壓迫穿刺點(diǎn)至無(wú)出血，墊一塊紗布于內(nèi)褲里，患者即可下床行走，囑其2小時(shí)不做劇烈運(yùn)動(dòng)。(二)實(shí)驗(yàn)室處理：1．將培養(yǎng)皿內(nèi)的曲細(xì)精管用兩支1ml注射針挑動(dòng)，翻轉(zhuǎn)洗滌1~2次；2．將曲細(xì)精管疊加切割(撕碎)，使精子及其組織細(xì)胞游離于培養(yǎng)液中；3．用于臨床診斷可立即鏡檢(20×)觀察有無(wú)精子，活動(dòng)否，通知臨床醫(yī)生；4．用于臨床治療(ICSI)，混懸液吸入離心管中，靜置培養(yǎng)箱孵育30-60分鐘，直到用前反復(fù)吹打混勻，再靜置數(shù)分鐘，待大塊組織沉淀后將上層液體離心(1500轉(zhuǎn),10分鐘)后使用。第七節(jié)、伊紅試驗(yàn)(一)準(zhǔn)備試劑用9g/L氯化鈉水溶液配制5g/L的伊紅Y溶液。(二)試驗(yàn)方法1．將一滴新鮮精液與一滴伊紅溶液在載玻片上混勻，并覆以蓋玻片。30秒后在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。2．計(jì)數(shù)200條精子，并區(qū)分活精子與死精子。活精子不著色(白色)，死精子被染成紅色。(三)結(jié)果描述計(jì)數(shù)條活精子數(shù)條(%)死精子數(shù)條(%)第二章.宮腔內(nèi)人工授精的實(shí)驗(yàn)室處理第一節(jié)、取精取精前一般禁欲5-7天，過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短的禁欲時(shí)間均有礙精子的質(zhì)量，但對(duì)于精液差的病例可適當(dāng)延長(zhǎng)禁欲時(shí)間。取精時(shí)間安排在IUI前1-2個(gè)小時(shí)，取精在專用取精室中進(jìn)行，室內(nèi)配有雙人床或三人沙發(fā)，每日紫外線消毒、擦臺(tái)面。病人在取精過(guò)程中須保持取精室周圍環(huán)境安靜，以免造成精神緊張引起取精困難。若發(fā)生取精困難可以性交方式取精；有些男性不習(xí)慣醫(yī)院環(huán)境可在家取精并在半小時(shí)之內(nèi)將精液送至醫(yī)院，運(yùn)送過(guò)程中應(yīng)注意精液保溫。取精前患者丈夫先排尿沖洗下尿道，清洗雙手，將已寫上姓名及病史號(hào)的取精杯交患者丈夫并做如下交待：取精杯已消毒，勿污染杯內(nèi)壁，精液射入取精杯后應(yīng)立即將杯蓋旋緊盡快送實(shí)驗(yàn)室處理。實(shí)驗(yàn)室收到取精杯后應(yīng)記錄收到時(shí)間、核對(duì)姓名。逆行射精的取精方法：逆行射精主要表現(xiàn)為患者性交過(guò)程中有射精感，但沒有精液射出。若膀胱頸在將要射精時(shí)未能關(guān)閉，射出的精子可能會(huì)逆行進(jìn)入膀胱中，性交后在尿液中發(fā)現(xiàn)精子則可確診。對(duì)于逆行射精患者需要特殊處理，取精前口服碳酸氫鈉4克5-7天以堿化尿液，有利于保持尿液中精子的活動(dòng)力。不可服用咖啡及飲料，可以服茶水，服水的目的是使尿液的滲透壓降低，若有條件測(cè)量尿液的滲透壓，在尿液滲透壓達(dá)到280-320之間時(shí)取精最好，取精前測(cè)量尿液的PH值，應(yīng)在6.8-7.4之間。逆行射精的患者需要特殊的容器來(lái)收集精液，手淫前排尿，不必完全排空膀胱，如果手淫中有精液射出應(yīng)收集于容器中，手淫后立即排尿或?qū)驅(qū)⒛蛞菏占诹硪粋€(gè)容器中。尿液樣本必須馬上處理，因?yàn)榧词乖诜昧酥靥妓猁}之后尿液仍是酸性的，幾乎會(huì)立即殺死精子。一旦樣本送到實(shí)驗(yàn)室，馬上測(cè)量及記錄尿液的體積及PH值。尿液樣本必須要充分混勻，因?yàn)樗谰訒?huì)下沉到容器的底部。所有的精子，即使是不動(dòng)的精子，都需要計(jì)數(shù)。將一滴尿液樣本滴在載玻片上進(jìn)行計(jì)數(shù)，如果精液數(shù)量足夠多，還應(yīng)滴一滴精液樣本在Maker板上進(jìn)行分析。對(duì)濃縮后的尿液及可能獲得的精液，采用密度梯度離心處理，尿液樣本以1500g離心10min。然后用新鮮的培養(yǎng)液重新懸浮沉淀。離心時(shí)，正常射出的精液(如果有的話)也應(yīng)進(jìn)行分析。從尿液中取得的沉淀也應(yīng)該在載玻片上或者M(jìn)aker板上分析其密度、活力以及形態(tài)。第二節(jié)、精液處理1.試劑：1)精子洗滌培養(yǎng)基：用于精液洗滌和培養(yǎng)的試劑很多，但有二點(diǎn)是共同的，第一，均含有人體蛋白，如白蛋白或血清；第二，均含有葡萄糖。這兩個(gè)成分是精子體外獲能所必需的。用于精液洗滌的培養(yǎng)基按其所含的緩沖劑不同分為兩大類，一類是以碳酸氫鈉做為緩沖劑，需在5%的二氧化碳?xì)怏w中保持pH值在7.4左右，但在空氣中很快變堿；另一類培養(yǎng)基含有低濃度碳酸氫鈉及高濃度的HEPES，這類試劑在空氣中pH變化很緩慢，可長(zhǎng)時(shí)間保持pH在7.4左右，但在5%二氧化碳環(huán)境中pH值變酸。以上兩類培養(yǎng)基均可用于精子洗滌，但有研究表明用含HEPES的培養(yǎng)基處理精子能更好地保護(hù)精子的功能，IUI妊娠率更高。目前精子洗滌培養(yǎng)基已商品化，有些出廠時(shí)已添加人體白蛋白(HSA)，有些需自己添加蛋白或血清。培養(yǎng)基可以是簡(jiǎn)單的平衡鹽溶液如人輸卵管液(HTF)、Earle‘s液(EBSS)、Tyrode’s液(T6)等，有些精子培養(yǎng)基配方很復(fù)雜，如Ham‘sF10。2)梯度離心試劑：目前用于梯度離心試劑很多，本中心使用的Isolate在出廠時(shí)滲透壓、pH值及梯度已調(diào)好并做過(guò)嚴(yán)格的生殖毒性檢測(cè)，用前只需預(yù)溫，現(xiàn)開現(xiàn)用。2.儀器及耗材1)儀器：離心機(jī)(水平式)、干熱培養(yǎng)箱、恒溫試管架、電動(dòng)加樣器、超凈工作臺(tái)、冰箱、試管架、顯微鏡、精子計(jì)數(shù)板。2)耗材：15ml尖底離心管、14ml圓底離心管、10ml刻度量管、9英寸無(wú)菌巴士德管、人工授精管(Tomcat)、1mlB-D注射器、5ml全塑料B-D注射器、酒精燈、硅膠接頭、載玻片、蓋玻片。3)精液冷凍保存設(shè)備及試劑、耗材：液氮、液氮罐、精液冷凍試劑、冷凍管等。3.處理前準(zhǔn)備1)取精前臨床工作人員應(yīng)通知實(shí)驗(yàn)室有關(guān)人員預(yù)溫處理精液所需的試劑及試管，打開超凈工作臺(tái)并準(zhǔn)備儀器。2)精液取出后應(yīng)盡快放35-37C恒溫培養(yǎng)箱中保溫，每5-10分鐘搖動(dòng)幾下促使精液液化。3)正常精液在30分鐘內(nèi)液化，若超過(guò)30分鐘仍不液化應(yīng)使用帶針頭的全塑料注射器反復(fù)抽吸精液直至精液液化。4)若精液中瓊脂樣顆粒多應(yīng)將精液倒入試管中垂直靜置一定時(shí)間待瓊脂樣顆粒沉入管底后吸取上層液體處理。5)精漿中含有受精抑制成分，應(yīng)盡早將精子從精漿中分離，精液一旦液化應(yīng)盡快處理，處理前取少許精液做常規(guī)檢查測(cè)量精子濃度、成活率及運(yùn)動(dòng)率，并根據(jù)檢查結(jié)果選擇處理方式。6)實(shí)驗(yàn)室工作人員在收到精液杯后應(yīng)仔細(xì)核對(duì)杯上的姓名和病史號(hào)，凡接觸精液的各種試管、巴士德管均需清楚標(biāo)記，接觸過(guò)病人體液的試劑不得再用于其他病人。精液中可能含有致病微生物，處理時(shí)工作人員應(yīng)戴一次性手套、口罩、帽子，處理精液后用75%的酒精或10%雙氧水擦洗臺(tái)面，超凈工臺(tái)應(yīng)定期消毒和細(xì)菌培養(yǎng)。4.精液處理方法1)調(diào)恒溫箱：溫度設(shè)定為35度2)試劑:Isolate、SSS、HTF-Hepes3)處理步驟：精液取出后置恒溫箱液化,同時(shí)將試劑及試管放恒溫臺(tái)預(yù)熱待精液液化后取少量精液計(jì)數(shù)，如果前向運(yùn)動(dòng)精子總量少于二百萬(wàn)不可用梯度離心，應(yīng)使用離心洗滌法。取一支15毫升尖底離心管，先加1毫升IsolateUP，后加1毫升IsolateDOWN,再加精液，200g離心20分鐘去上清,沉淀+1ml5%sssHTF-Hepes(不能碰壁)混勻200g離心5分鐘(或100g離心10分鐘)重復(fù)洗滌兩次去上清,沉淀加0.3-0.5ml5%SSSHTF-Hepes混勻取少量精子懸液計(jì)數(shù)B．上游法適應(yīng)癥基本同上，但是精液粘度高或不液化則不適宜用上游法，一般上游法的回收效率比非連續(xù)梯度離心要低。1)方法一：精子經(jīng)兩次洗滌后，棄上清，沉淀留管底，小心沿管壁加入5%SSSHTF-HEPES1ml傾斜45度置37度恒溫箱45分鐘，2)方法二：將精液標(biāo)本置試管底部，小心沿管壁加入含5%SSSHTF-HEPES1.5ml傾斜45度置37度培養(yǎng)箱孵育45分鐘，收集云霧狀上層培養(yǎng)液，經(jīng)兩次洗滌后沉淀用0.5ml洗精液懸浮做授精用。C．兩次洗滌法適用于前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)低于200萬(wàn)的病人，冷凍精液人工授精一般也用兩次洗滌法。一份精液加一份洗精液稀釋，200g離心5分鐘，沉淀加1ml洗精液懸浮，離心洗滌兩次后沉淀加0.3-0.4ml洗精液懸浮做授精用。第三節(jié)、授精人工授精前陰道超聲掃描看有無(wú)排卵。人工授精不需陰道消毒，但用無(wú)菌生理鹽水紗布擦洗陰道和頸管。將TOMCAT管預(yù)先做適當(dāng)?shù)膹澢?，接?mlB.D.注射器,并將注射器活塞推到底,核對(duì)精子無(wú)誤后將精子懸液吸入到授精管和注射器中。將授精管宮頸管輕輕插入到宮腔中，緩緩將精子懸液注入宮腔，輕輕退出授精管和窺陰器。授精后患者平臥一刻鐘。離院前向病人交代若有惡心、嘔吐、腹痛、嚴(yán)重腹脹、體重明顯增加等卵巢過(guò)度刺激癥狀應(yīng)立即復(fù)診。第四節(jié)、文件書寫IUI前簽定“夫精宮腔內(nèi)人工授精知情同意書”。按“不孕癥檢查常規(guī)”書寫病歷及作輔助檢查，促排卵或超排卵過(guò)程記錄在“治療單二”中，精液處理和授精過(guò)程記錄在“宮腔內(nèi)人工授精記錄單”中。若妊娠將妊娠過(guò)程記錄在“妊娠結(jié)局記錄單”中。第三章.體外受精-胚胎移植常規(guī)第一節(jié)、儀器準(zhǔn)備(最遲提前2天)胚胎實(shí)驗(yàn)室風(fēng)機(jī)、空調(diào)24小時(shí)不間斷運(yùn)行，室溫控制在24度(±2度左右)。取卵手術(shù)室、ET室使用結(jié)束后關(guān)閉風(fēng)機(jī)和空調(diào)，用前半小時(shí)打開。CO2培養(yǎng)箱:每日開箱前觀測(cè)箱溫(水銀精密溫度計(jì))每周一次使用CO2測(cè)定儀監(jiān)測(cè)培養(yǎng)箱的CO2濃度，記錄并同時(shí)記錄箱溫每周換水擦洗一次，并作記錄胚胎操作箱:每日觀測(cè)箱溫，并作記錄每周一次使用CO2測(cè)定儀監(jiān)測(cè)操作箱的CO2濃度，記錄并同時(shí)記錄箱溫對(duì)異常變動(dòng)要先報(bào)告實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人，再由負(fù)責(zé)人根據(jù)觀測(cè)情況進(jìn)行調(diào)動(dòng)，并在24小時(shí)內(nèi)觀測(cè)其是否恢復(fù)正常每日加水，每周一下班前清潔一次。第二節(jié)、試劑1.HTF和U-IVF:分裝于大、小試管，(HTF分裝10ml/大試管用于揀卵預(yù)培，U-IVF分裝1ml/小試管用于處理后精子培養(yǎng)用預(yù)培)，提前一天置于CO2培養(yǎng)箱平衡。用途:大試管液體用于洗卵,配授精盤(一般井皿每孔裝卵不超過(guò)8個(gè),根據(jù)卵的多少配1-2個(gè)盤)；小試管液體用于精子培養(yǎng)。2.ECM+10%SSS:9mlECM+1mlSSS，提前一天置于CO2培養(yǎng)箱平衡用途:用于制備分裂期胚胎培養(yǎng)皿。3.MB+10%SSS:9mlMB+1mlSSS，提前一天置于CO2培養(yǎng)箱平衡用途：制備囊胚期胚胎培養(yǎng)皿。4.如果用CSC培養(yǎng)基，則不需2.和3.培養(yǎng)基：CSC+10%SSS:9mlMB+1mlSSS，提前一天置于CO2培養(yǎng)箱平衡。用途：制備從受精卵至囊胚期的胚胎培養(yǎng)皿。5．沖針液:flushingmedium至少提前1天37℃預(yù)溫用途:用于沖洗卵泡。6．Isolate:用途:處理精液，用前配制，先批量分裝1mlLow液于多個(gè)尖底離心管，再在各Low面上輕輕加上Up液1ml備用。7．HTF-HEPES+10%SSS：9mlHTF-HEPES+1mlSSS，分裝于2個(gè)試管中(5ml/試管)，密閉，放4度冰箱備用。用途：用于精子洗滌，ICSI皿配盤。用量：每個(gè)病人5ml。第三節(jié)、所需物品巴斯德管,直徑為100mm的大平皿,35mm的小平皿，井皿,大試管,小試管,1ml注射器,吸頭,各種接頭,刻度離心管,毛細(xì)巴斯德管,試管架,煤氣噴燈,鑷子,電動(dòng)加樣器,紗布,取精杯，精液點(diǎn)樣濾紙等第四節(jié)、步驟1.提前一天：配制洗卵授精液、胚胎培養(yǎng)液、精子洗滌液等試劑,并將洗卵授精液、胚胎培養(yǎng)液置CO2培養(yǎng)箱中平衡過(guò)夜，精子洗滌液密閉置4度冰箱保存，沖針液置37℃預(yù)溫。授精盤配置方法：在超凈臺(tái)下按無(wú)菌操作要求將授精液(HTF)2ml加入井皿外圍，將HTF1.0ml加入井皿中央，外圍用于洗卵，中央用于授精。注意：受精盤的底座與蓋均應(yīng)用記號(hào)筆注明病人姓名及ART號(hào)。2.Day0:取卵當(dāng)天:(即注射HCG后36h)(1).開通二氧化碳?xì)怏w，待氣體濃度顯示穩(wěn)定后可測(cè)定培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度，并檢查胚胎操作箱溫度，作相應(yīng)校正。(2).根據(jù)當(dāng)天取卵例數(shù)，預(yù)溫相應(yīng)井皿、大平皿，并準(zhǔn)備相應(yīng)量紗布、1ml注射器。(3).取卵前準(zhǔn)備一支巴斯德管,，從培養(yǎng)箱取出洗卵液,將洗卵液放置于已預(yù)溫的井皿中配制洗卵盤，井皿外圍加液2ml，中央加液1ml。找卵過(guò)程中將找出的卵放于井皿外圍進(jìn)行清洗，應(yīng)注意將血細(xì)胞清洗干凈，必要時(shí)用1ml注射器切除污染的血塊、血斑及黃素化的顆粒細(xì)胞，撿卵結(jié)束時(shí)將已清洗干凈的卵冠丘復(fù)合體成批放于井皿中央培養(yǎng)。(4).取卵結(jié)束后丈夫取精，精液(精液杯已標(biāo)明病人姓名)置35℃恒溫箱液化，液化后盡快處理精液。若精液取出半小時(shí)后仍不液化，使用2ml全塑料注射器反復(fù)抽吸精液促使液化。取精前開始預(yù)溫Isolate、精子洗滌液、2支15ml尖底離心管(室溫)。精液處理方法：準(zhǔn)備兩支巴斯德管(標(biāo)明病人姓名),涂片鏡檢精液情況,根據(jù)精子的密度和活力適用不同每層厚度的梯度離心方法(如0.3ml,0.5ml,1ml，一般用1ml)。取一支如前批量準(zhǔn)備的Isolate液管,標(biāo)注病人信息，加入2ml精液(.加入精液量依精子濃度、活力而定，一般為2ml。若精液差，可采用多管離心，每管加精液1-2ml)。200g離心15分鐘后仔細(xì)去上清,留沉淀,換管將沉淀移入到干凈預(yù)溫的梯度離心管中，加1mlHTF-HEPES洗滌精液，輕輕搖勻,200g離心5分鐘,或者100g離心10分鐘,洗滌2次后去上清,加入適量精子培養(yǎng)液(分裝于小試管的1mlU-IVF)，取少許精子懸混液計(jì)數(shù)精子濃度，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將精子濃度調(diào)整到300萬(wàn)/ml-1000萬(wàn)/ml，將處理好的精子置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少半小時(shí)方可授精。(5).取卵后4-6小時(shí),將授精盤取出,每個(gè)井皿中央加精子30萬(wàn)條，混勻，立體顯微鏡下再次觀察精子密度待確定密度合適時(shí)置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。授精時(shí)間應(yīng)根據(jù)卵的成熟度決定，若卵很成熟應(yīng)在取卵后4小時(shí)授精；若卵中度成熟在取卵后5小時(shí)授精；若卵成熟度差應(yīng)延遲到8小時(shí)后授精。(6).配制生長(zhǎng)液滴皿,(皿的底座與蓋均應(yīng)標(biāo)明病人姓名，皿蓋要標(biāo)ART號(hào))CO2培養(yǎng)箱平衡過(guò)夜3.Day1:(1).去除顆粒細(xì)胞,即拆蛋,將受精卵移入已預(yù)溫平衡的CSC胚胎培養(yǎng)皿中,1個(gè)/液滴,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)(2).于倒置顯微鏡下觀察受精情況4.Day2Day3:胚胎觀察并冷凍/移植(1).觀察胚胎，并做好記錄。(2).挑選優(yōu)質(zhì)胚胎冷凍或者移植,非優(yōu)質(zhì)胚胎囊胚培養(yǎng)(3).裝胚胎(詳見胚胎移植常規(guī)):將注射器與移植管旋緊,即可裝胚胎,順序?yàn)?10mm液體→3-5mm空氣→胚胎+液體10mm→3-5mm空氣→2mm液體5.囊胚培養(yǎng)：(如果是連續(xù)培養(yǎng)基CSC培養(yǎng)，則可省略該兩次配盤及轉(zhuǎn)盤操作)(1)．Day2下午及Day4下午配置MB囊胚培養(yǎng)液滴皿，(皿的底座與蓋均應(yīng)標(biāo)明病人姓名)CO2培養(yǎng)箱平衡過(guò)夜。(2)．Day3下午將需要囊胚培養(yǎng)的胚胎移至囊胚培養(yǎng)液中，觀察并做好記錄。(3)．Day5上午觀察胚胎并做好記錄。(4)．Day5下午冷凍優(yōu)質(zhì)囊胚，未成囊胚胎轉(zhuǎn)移至新的囊胚培養(yǎng)液中培養(yǎng)。第四章.卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射常規(guī)卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(IntrocytoplasmicSpermInjection，ICSI)是治療嚴(yán)重男性因素不孕患者的最有效治療方法，在輔助生殖技術(shù)中占有重要地位。ICSI的操作方法在各實(shí)驗(yàn)室雖有細(xì)微差異，但目前尚無(wú)足夠的資料證明各實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)過(guò)程及操作方法上的區(qū)別會(huì)對(duì)妊娠結(jié)果有影響。本文將重點(diǎn)介紹本中心進(jìn)行ICSI的實(shí)驗(yàn)程序。第一節(jié)、儀器配置及注射前準(zhǔn)備(一)儀器配置1．進(jìn)行ICSI操作時(shí)應(yīng)使用高分辨率的倒置顯微鏡，目前有多種品牌的高檔倒置顯微鏡能滿足ICSI的操作要求，但選購(gòu)時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面：1)必須配置Hofman或微分干涉(DIC或Nomarski)光學(xué)系統(tǒng)。目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用的是Hofman光學(xué)系統(tǒng)，雖然微分干涉光學(xué)系統(tǒng)的分辨率比Hofman分辨率高，但微分干涉系統(tǒng)必須使用玻璃培養(yǎng)皿且價(jià)格昂貴，因而較少使用。2)配4倍，10倍，20倍物鏡，方便操作。3)使用萬(wàn)能載物臺(tái)4)安裝恒溫加熱裝置，如恒溫加熱板或恒溫加熱箱2．顯微操作儀顯微操作儀的作用是將大幅度的動(dòng)作轉(zhuǎn)換為微細(xì)的動(dòng)作，其質(zhì)量的好壞會(huì)直接影響操作的方便性。目前國(guó)內(nèi)外使用最多的是日本Narishige公司生產(chǎn)的液壓顯微操作儀，這種顯微操作儀由粗動(dòng)定位及精細(xì)操作兩部分儀器構(gòu)成，前者為機(jī)械式或電動(dòng)控制，其工作距離大，但不精密。后者為液壓控制，其工作距離小，精密度在一定范圍內(nèi)可調(diào)，能進(jìn)行X、Y、Z三個(gè)方向運(yùn)動(dòng)，并有萬(wàn)向搖柄能在水平面任意方向運(yùn)動(dòng)，萬(wàn)向搖柄有直立式及懸吊式兩種可根據(jù)個(gè)人習(xí)慣選擇。顯微操作儀應(yīng)與所配的倒置顯微鏡匹配，如果顯微鏡使用恒溫加熱箱，恒溫箱必須與顯微操作儀匹配。3．顯微注射儀進(jìn)行卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射時(shí)用顯微注射儀控制注射針 (microinjectionneedle)及持卵針(holdingpipette)內(nèi)的液體運(yùn)動(dòng)，因此顯微注射儀的好壞決定ICSI的成敗。國(guó)內(nèi)外大多數(shù)單位使用微米注射儀進(jìn)行顯微注射。4．?dāng)z錄像裝置配備450線以上的攝像頭和監(jiān)視器，配備高清晰度像機(jī)。5．防震平臺(tái)高頻震動(dòng)會(huì)使顯像模糊，增加注射難度，如果所在實(shí)驗(yàn)室有震源干擾，應(yīng)使用氣墊臺(tái)進(jìn)行防震。本中心進(jìn)行卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射的儀器配置如下：OlympusIX71倒置顯微鏡配4倍明視野物鏡，20倍及40倍Hofman物鏡NikonTE300倒置顯微鏡配4倍明視野物鏡，10倍及20倍Hofman物鏡OlympusIX-IBM恒溫箱及恒溫加熱控制儀NarishigeMMN-1機(jī)械式顯微控制儀兩個(gè)進(jìn)行粗動(dòng)定位NarishigeMMO-202N油壓操作儀兩個(gè)進(jìn)行微細(xì)操作UT-2關(guān)節(jié)兩個(gè)HT-7持針管兩個(gè)HamiltonGastight螺旋注射器一支控制持卵針內(nèi)的液體運(yùn)動(dòng)JVCTK-C1381攝像頭JVCBM-H1400PN監(jiān)視器(二)顯微注射針進(jìn)行ICSI時(shí)使用兩種顯微注射針：即持卵針及顯微注射針。顯微注射針由外徑1毫米、內(nèi)徑0.78毫米的硼硅玻璃毛細(xì)管拉制而成，管尖內(nèi)徑5微米，外徑7微米。管末端平面與毛細(xì)管縱軸呈30-45度的夾角，并拉成小刺(spike)，管末端約1毫米長(zhǎng)的毛細(xì)管與管體折成一定夾角，一般為35度。持卵針也由外徑1毫米，內(nèi)徑0.78毫米的硼硅玻璃毛細(xì)管拉成，管尖外徑70-120微米,管尖開口15-30微米，管末端平面與毛細(xì)管縱軸垂直，管末端約1毫米長(zhǎng)的毛細(xì)管與管體折成一定夾角，一般為35度。目前商品化的顯微注射針有多種品牌，相互之間有一定的細(xì)微差別，本中心使用的是HUMAGEN生產(chǎn)的35度夾角的顯微注射針。(三)儀器安裝及調(diào)試新購(gòu)買的倒置顯微鏡及顯微操作系統(tǒng)在安裝完畢后需進(jìn)行反復(fù)的調(diào)試，包括Hoffman系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、恒溫裝置的調(diào)節(jié)及顯微操作儀的調(diào)節(jié)。對(duì)顯微操作儀進(jìn)行調(diào)節(jié)的目的是使其X、Y、Z各向運(yùn)動(dòng)達(dá)到最大，持針管和顯微鏡載物臺(tái)的夾角應(yīng)和所選購(gòu)的顯微注射針的夾角一致，以使安裝后的顯微注射針的前端毛細(xì)管基本與水平面平行。第二節(jié)、卵細(xì)胞漿內(nèi)精子注射的適應(yīng)癥ICSI是治療嚴(yán)重少、弱精癥的有效手段，凡經(jīng)IVF治療受精率低于50%的病例均是ICSI的適應(yīng)癥。近年來(lái)由于ICSI技術(shù)的改進(jìn)及對(duì)ICSI操作本身安全性的肯定使ICSI的適應(yīng)癥已逐漸擴(kuò)大。對(duì)于無(wú)前次IVF受精率的資料作參考的病例在考慮是否進(jìn)行ICSI前應(yīng)行精子回收實(shí)驗(yàn)，若回收實(shí)驗(yàn)達(dá)到IVF的標(biāo)準(zhǔn)則不考慮ICSI，若回收實(shí)驗(yàn)仍不能決定是否進(jìn)行IVF或ICSI，則一部分卵子行IVF，一部分卵子行ICSI。1．精液中正常形態(tài)精子超過(guò)10%且回收活動(dòng)精子超過(guò)50萬(wàn)條可進(jìn)行常規(guī)IVF，若受精率低于50%在下一個(gè)周期做ICSI。2．精液中正常形態(tài)精子不超過(guò)10%但回收活動(dòng)精子超過(guò)50萬(wàn)條則部分卵作IVF部分卵作ICSI，如果IVF受精率超過(guò)50%在下一個(gè)周期作IVF。3．回收活動(dòng)精子低于50萬(wàn)條或精液中偶見精子行ICSI。4．睪丸或附睪取精病例作ICSI。5．免疫珠實(shí)驗(yàn)超過(guò)50%的精子頭結(jié)合IgA抗體則行IVF加ICSI。6．前次IVF受精率低于50%行ICSI。7．不明原因不孕癥經(jīng)超排卵加宮腔內(nèi)人工授精三個(gè)周期未妊娠者行IVF加ICSI。8．卵子質(zhì)量差或胚胎質(zhì)量差均不是ICSI的適應(yīng)癥。第三節(jié)、ICSI操作程序(一)取卵前日：1．配PVP：1支PVP干粉(Irvinescientific)加1mlHepes緩沖的人輸卵管液(HTF-Hepes，IrvineScientific或InVitrocare)注意不要加蛋白，加液后靜置兩小時(shí)以上，待完全溶解后轉(zhuǎn)入小試管中放置于4度冰箱，可使用一個(gè)月，使用前37度預(yù)溫后即可使用。本中心使用即用型10%PVP溶液(IrvineScientific)。2．配透明質(zhì)酸酶：1瓶透明質(zhì)酸酶(Sigma，H-4272每瓶約30mg)加入30mlU-IVF(UniversalIVFMedium，Origio)配成每毫升800單位濃度，按每管1ml分裝，-20度冷凍可長(zhǎng)期保存。解凍后放4度冰箱可使用一月，使用前放二氧化碳培養(yǎng)箱平衡過(guò)夜，拆蛋時(shí)每1ml拆蛋液加1-2滴800IU/ml透明質(zhì)酸酶即為濃度為20-40IU/ml的工作液。如果拆蛋過(guò)程無(wú)二氧化碳控制則應(yīng)使用HTF-Hepes配制透明質(zhì)酸酶，配制濃度及保存方法同上，但使用前不可放二氧化碳培養(yǎng)箱平衡，臨用前放37度恒溫箱平衡即可使用，使用方法同上，但使用的拆蛋液為含Hepes的HTF。本中心除顯微注射過(guò)程外其他胚胎操作過(guò)程均在二氧化碳控制下進(jìn)行，以下描述為本中心進(jìn)行ICSI操作的具體過(guò)程。3．拆蛋液：U-IVF加10%SSS(SerumSubstitutiveSupplement，IrvineScientific)5ml放二氧化碳培養(yǎng)箱平衡過(guò)夜。4．注射液：HTF-Hepes加10%SSS5ml分裝在兩個(gè)小試管中，分別為3ml、2ml分別作洗精及注射用，用前溫度平衡。5．礦物油：4ml礦物油用前溫度平衡6．其他試劑：取卵液、沖針液等同體外受精7．生長(zhǎng)液：ECM或CSC液加10%SSS做生長(zhǎng)液，用前配成微滴置二氧化碳培養(yǎng)箱平衡過(guò)夜，顯微注射結(jié)束后將注射卵轉(zhuǎn)入其中培養(yǎng)。8．若行睪丸穿刺或活檢取精則需準(zhǔn)備HTF-Hepes+10%SSS10ml及U-IVF或HTF+10%SSS2ml(用前平衡6小時(shí)以上)(二)取卵當(dāng)日1.取卵同體外受精。2.精液處理：由于少、弱精癥患者精子體外存活時(shí)間短一般精液處理時(shí)間選擇在顯微注射前,精液處理完畢后應(yīng)盡快做顯微注射以免注射前精子死亡，對(duì)于嚴(yán)重少弱精的病例應(yīng)特別注意。1)常規(guī)ICSI精液處理：兩次離心洗滌。操作步驟如下：精液充分液化后加入1-2mlHTF-Hepes+10%SSS吹打均勻，1500轉(zhuǎn)離心3-5分鐘，去上清后沉淀加入HTF-Hepes重懸，再次離心洗滌，最后用0.3-0.5mlU-IVF或HTF+10%SSS重懸沉淀(根據(jù)沉淀多少?zèng)Q定加入的液體量)，取少許精子懸混液顯微鏡下觀察精子濃度，培養(yǎng)箱中放置備用。2)附睪精子處理：兩次離心洗滌，步驟同上。3)睪丸穿刺或活檢組織處理：一般在取卵日上午進(jìn)行經(jīng)皮細(xì)針睪丸穿刺抽取睪丸組織，睪丸組織在HTF-Hepes+10%SSS中漂洗去除血細(xì)胞后移入1-2ml干凈的HTF-Hepes中，用一次性1ml注射器針頭切碎，懸濁液置倒置顯微鏡下觀察證實(shí)有活動(dòng)精子后，將懸濁液離心洗滌兩次，0.1-0.3mlU-IVF或HTF+10%SSS重懸沉淀(根據(jù)精子數(shù)量多少?zèng)Q定加入的液體量)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱備用。提前進(jìn)行睪丸穿刺的優(yōu)點(diǎn)是，睪丸組織中未成熟精子經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，可提高精子的活動(dòng)力及活動(dòng)率使顯微注射過(guò)程更加順利。經(jīng)細(xì)針睪丸穿刺未找到精子的病例仍可進(jìn)行睪丸切開活檢，有時(shí)能獲得足量的活動(dòng)精子。3．拆蛋：拆蛋的目的是用透明質(zhì)酸酶消化卵冠丘復(fù)合體外層的卵丘，然后用機(jī)械的方法除掉卵母細(xì)胞外的放射冠使卵母細(xì)胞暴露。拆蛋的時(shí)間為取卵后3-4小時(shí)。拆蛋程序：1)準(zhǔn)備工作：預(yù)溫一塊中心皿，一支巴士德管，兩支毛細(xì)玻璃管(一支內(nèi)徑比卵稍細(xì)，另一支內(nèi)徑比卵稍粗)。2)配拆蛋盤：操作箱通二氧化碳后取出在二氧化碳培養(yǎng)箱中已平衡的拆蛋液(U-IVF或HTF+10%SSS)及透明質(zhì)酸酶儲(chǔ)備液，分別在中心皿中心和外圍處加拆蛋液1ml，用巴士德管加3滴透明質(zhì)酸酶儲(chǔ)備液于中心孔中，吹打均勻。3)消化卵丘：將卵冠丘復(fù)合體放入中心孔中(每次3-5個(gè))用巴士德管反復(fù)吹吸約10秒，然后盡快將外周包有放射冠的卵細(xì)胞轉(zhuǎn)入中心皿外圍的無(wú)透明質(zhì)酸酶的拆蛋液中，等待除去放射冠。因?yàn)橥该髻|(zhì)酸酶的長(zhǎng)時(shí)間作用對(duì)卵子可能有潛在的損害，所以卵子與透明質(zhì)酸酶接觸的時(shí)間應(yīng)盡可能的短，洗滌時(shí)從上一個(gè)孔帶入下一孔的液體應(yīng)盡可能的少。重復(fù)此步驟直至所有的卵冠丘復(fù)合體的卵丘被消化。4)除去放射冠：用已拉好的內(nèi)徑稍細(xì)的毛細(xì)玻璃管吹吸卵放射冠復(fù)合體，使放射冠脫離卵母細(xì)胞，待所有的卵母細(xì)胞放射冠均除去后，用內(nèi)徑稍粗的毛細(xì)玻璃管將卵子ECM洗滌液中洗滌3-5次，最后轉(zhuǎn)入ECM培養(yǎng)液滴中，放回二氧化碳培養(yǎng)箱中待用。4．安裝顯微針：將石蠟油注入兩側(cè)顯微注射儀的管道中排盡其中的氣泡。在4倍物鏡下安裝持卵針，調(diào)節(jié)UT-2關(guān)節(jié)并旋轉(zhuǎn)持針管使持卵針末端部分處于水平位并與X軸平行。按同樣的方法安裝注射針。兩側(cè)顯微針安裝完畢后將兩針升起，兩針高度應(yīng)超過(guò)注射盤的高度。5．準(zhǔn)備顯微注射盤：1)在拆蛋前預(yù)溫一個(gè)Falcon35mm的培養(yǎng)皿，預(yù)溫PVP、注射液及石蠟油。2)由于注射盤液滴很小，為減少液體揮發(fā)，作注射盤時(shí)動(dòng)作應(yīng)迅速，事先應(yīng)準(zhǔn)備好所需的各種物品及試劑，液滴作好后應(yīng)迅速加石蠟油完全覆蓋。3)本中心用35mm培養(yǎng)皿蓋作注射盤，液滴形狀、大小及分布如下圖，液滴分布應(yīng)在直徑25mm的區(qū)域：說(shuō)明：1-11號(hào)液滴為注射液，直徑2-3mm，每滴放卵1-2個(gè)12號(hào)液滴為PVP13號(hào)液滴為注射液，放置精子14號(hào)液滴為注射液，用于洗卵，面積約5*10mm2由于注射盤深度約5mm，因此各液滴厚度應(yīng)低于2mm注射盤作好后，將卵轉(zhuǎn)移到14號(hào)液滴中，清洗后將成熟的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1-11號(hào)液滴中，每滴1-2個(gè)卵。自12號(hào)液滴右下角將精子懸液緩緩加入其中，加入量視精子濃度而定，但沉淀擴(kuò)散的范圍不超過(guò)液滴轉(zhuǎn)折處。6．準(zhǔn)備注射系統(tǒng)1)將作好的注射盤置于倒置顯微鏡載物臺(tái)上，下調(diào)注射針及持卵針直至接近石蠟油的表面。2)移動(dòng)視野至14號(hào)液滴，將石蠟油注入持卵針中至管尖，然后將持卵針下降到14號(hào)液滴中，吸入約5毫米液體，再將注射針升高到石蠟油表面以上。3)移動(dòng)視野到PVP液滴，將石蠟油注入到注射針中至管尖,注射針下降到PVP液滴中，吸入少許PVP到注射針內(nèi)，待針內(nèi)壓力平衡后即可開始顯微注射。7．卵細(xì)胞漿內(nèi)精子注射1)移動(dòng)注射針至13號(hào)液滴左側(cè)邊緣，將形態(tài)正常的活動(dòng)精子吸入到注射針內(nèi)，移動(dòng)注射針至PVP液滴將精子排入其中。2)用注射針針尖壓住精子尾部，將注射針迅速劃過(guò)精子尾部使精子制動(dòng)。精子制動(dòng)的目的是破壞精子尾部的細(xì)胞膜而使其激活卵子，有利于受精。3)將注射針針尖對(duì)準(zhǔn)已制動(dòng)精子的尾端緩緩將精子吸入到注射針內(nèi)。每次可吸入1-2條精子，注射1-2枚卵子，2條精子之間的距離一般超過(guò)三個(gè)精子的長(zhǎng)度。4)將注射針移到1-11號(hào)液滴中，下降持卵針將待注射的MⅡ期卵母細(xì)胞輕輕吸住，用注射針轉(zhuǎn)動(dòng)卵母細(xì)胞將極體放在6點(diǎn)或12點(diǎn)處，然后將卵母細(xì)胞吸緊。調(diào)節(jié)顯微鏡焦點(diǎn)對(duì)卵母細(xì)胞赤道部聚焦，調(diào)節(jié)注射針位置使注射針與卵母細(xì)胞赤道部在同一個(gè)平面，將注射針輕輕按壓于卵母細(xì)胞上證實(shí)卵母細(xì)胞與注射針在同一個(gè)平面后將最前端的一個(gè)精子輕輕推至針口然后將注射針刺入卵母細(xì)胞內(nèi)，刺入深度約為卵母細(xì)胞直徑的三分之二，在精子排出前先回吸胞漿直至胞漿在針管內(nèi)快速流動(dòng)時(shí)立即將精子連同吸出的胞漿注入到卵母細(xì)胞內(nèi)，一旦精子頭部進(jìn)入胞漿即可將注射針輕輕退出到卵母細(xì)胞外?；匚麧{的目的是為了破壞細(xì)胞膜保證精子注入到細(xì)胞漿內(nèi)。注入精子時(shí)流入胞漿內(nèi)的PVP量應(yīng)盡可能的少。5)將固定在持卵針上的卵母細(xì)胞輕輕松開再固定另一個(gè)待注射的卵母細(xì)胞重復(fù)以上步驟直至所有的MII期卵子均被注射。6)注射完畢后將已注射的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)液滴清洗3次后按每滴1枚卵子進(jìn)行培養(yǎng)。7)注射后12-20小時(shí)檢查是否受精，一般受精后48小時(shí)進(jìn)行全胚胎冷凍或新鮮胚胎移植。第五章.卵子輔助激活常規(guī)一、卵子輔助激活指征既往ICSI不受精或者受精率低的患者。二、激活試劑配制購(gòu)置西格瑪?shù)膇onomycin粉劑1mg，使用DMSO溶解后，分裝于1.5mlEP管，每支EP管分裝10μl，每管含ionomycin0.01μmol，置于-20℃冰箱保存。注意分裝保存時(shí)將液體拍打至管底，方便使用時(shí)精確取液。三、步驟準(zhǔn)備井皿、200μl移液器、1000μl移液器、毛細(xì)巴氏德管、U-IVF(ECM/MB亦可)、分裝后的激活試劑ionomycin。1)使用1000μl移液器，在井皿中央加入990μlU-IVF試劑2)從冰箱中取出分裝有10μlionomycin的EP管，盡量在管內(nèi)液體未完全溶解時(shí)打開EP管蓋，防止溶解后液體在開蓋時(shí)有濺出。3)使用200μl移液器從井皿中央吸取少量U-IVF，用于溶解EP管內(nèi)液體。4)將溶解后液體打回井皿中央并吹打均勻5)再次吸取少量U-IVF沖洗EP管管壁，沖洗后液體打回井皿中央6)配制后的激活試劑終濃度為10μmol/L7)ICSI后1小時(shí)，將需要卵子輔助激活的卵子使用毛細(xì)巴氏德管移入配制好的激活試劑中，計(jì)時(shí)10min。8)從激活試劑中取出卵子，放入不含激活試劑的U-IVF中吹打沖洗數(shù)次，放回胚胎培養(yǎng)生長(zhǎng)盤9)做好卵子輔助激活相關(guān)記錄第六章.玻璃化冷凍解凍常規(guī)一、冷凍解凍試劑配制ES:7.5%EG+7.5%DMSO-20%SSSmHTF7.5mL過(guò)濾EG+7.5mLDMSO+20mLSSS+65mLmHTF=100mLVS:15%EG+15%DMSO+0.58Msucrose-20%SSSmHTF15mLEG+15mLDMSO+19.8gsucrose(約11.5mL)+20mLSSS+38.5mLmHTF=100mL過(guò)濾解凍1液:1Msucrose-20%SSSmHTF配2份34.2gsucrose(約20mL)+20mLSSS+60mLmHTF=100mL過(guò)濾解凍3、4液:20%SSSmHTF配2份20mLSSS+80mLmHTF=100mL無(wú)需過(guò)濾解凍2液:0.5Msucrose-20%SSSmHTF60mL解凍1液+60mL解凍3、4液=120mL解凍2液無(wú)需過(guò)濾最終解凍1液140mL,解凍2液120mL,解凍3、4液140mL二、冷凍操作常規(guī)1將ES和VS在室溫下(20-25°C)預(yù)溫至少30分鐘備用.在試劑預(yù)溫的時(shí)間內(nèi),準(zhǔn)備冷凍過(guò)程需要的其它物品,如1-2L泡沫盒(裝適量液氮)、巴斯德吸管、鑷子、四孔板、定時(shí)器、加樣器和Tip頭等等.2使用前,將上述兩種試劑輕輕上下倒置3次,以保證溶液充分混勻.3在中心井皿的中央孔加入0.5mLES.4從培養(yǎng)箱中移出裝有待冷凍胚胎的培養(yǎng)皿.5小心將胚胎移入ES液面上,讓其自由下落至皿底,再輕輕轉(zhuǎn)換位置3次.胚胎進(jìn)入ES液后會(huì)發(fā)生皺縮,然后逐步恢復(fù)至原來(lái)的容積,此時(shí)表明平衡過(guò)程完成.一般情況下,D2-D3卵裂期胚胎在ES液內(nèi)的平衡時(shí)間為5-10分鐘,囊胚的平衡時(shí)間為8-10分鐘.若囊胚行人工皺縮,則可平衡時(shí)間固定為5分鐘.6胚胎在ES液中平