輔助生殖科體外受精-胚胎移植技術(shù)操作規(guī)范

第一部分體外受精-胚胎移植技術(shù)第一節(jié)1VF-ET概況和發(fā)展史體外受精-胚胎移植技術(shù)（inyitr。fertilizati。nandembry。transfer,IVF-ET）是人類輔助生殖技術(shù)（asis-tedrepr。ductiyetechn。l。gy,ART）的基本內(nèi)容和核心技術(shù)，俗稱"試管嬰兒"技術(shù)。1978年7月25日，世界首例試管嬰兒L。uiseBr。wn在英國劍橋誕生，成為20世紀(jì)醫(yī)學(xué)史上的里程碑。1985年4月和1986年12月，我國臺(tái)灣、香港先后誕生了兩地的首例試管嬰兒。1988年3月10日，大陸的首例試管嬰兒也在北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院張麗珠教授領(lǐng)導(dǎo)的生殖中心誕生。當(dāng)今國際上采用的助孕新技術(shù)多數(shù)是從IVF-ET衍生出來的。如果從schenck嘗試在體外完成受精和Heape將供體兔子的胚胎成功地移植到受體子體內(nèi)開始，哺乳類的胚胎移植技術(shù)已有了100多年的歷史。20世紀(jì)60年代初期，家兔卵體外受精科學(xué)試驗(yàn)首次成功，激發(fā)了胚胎學(xué)家Pr。f.R。bertG.Edwards想要嘗試進(jìn)行人卵體外受精的實(shí)驗(yàn)研究愿望，他與婦產(chǎn)科專家Mr.Patrickstept。e進(jìn)行了10多年的合作努力，歷經(jīng)百余次失敗后，終于利用腹腔鏡技術(shù)，獲取自然周期的1枚排卵前卵母細(xì)胞，體外受精后形成的胚胎移植獲得成功妊娠分娩。全球許多國家生殖專家對(duì)研究這項(xiàng)劃時(shí)代的新技術(shù)充滿熱情，相繼在印度、澳大利亞、美國、歐洲多國獲得成功臨床應(yīng)用。在世界首例試管嬰兒誕生30多年之后，2010年R。bertG.Edwards獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)，按照當(dāng)年諾獎(jiǎng)?lì)C獎(jiǎng)時(shí)估計(jì)，全世界已經(jīng)有約300萬個(gè)家庭通過IVF-ET技術(shù)得到自己的后代，試管嬰兒數(shù)量也達(dá)到了400萬個(gè)以上。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WH0）評(píng)估，世界上每7對(duì)夫婦中約有1對(duì)夫婦存在生殖障礙。我國近期調(diào)查，國內(nèi)不孕癥者占已婚夫婦人數(shù)的10%，比1984年調(diào)查的4.8%增加一倍多，發(fā)病率呈上升趨勢。臨床統(tǒng)計(jì)，不育患者中約20%的夫婦，不借助ART就根本無法生兒育女。在不孕癥病因中男性因素引起的不孕約占30%，女性因素約占50%，雙方因素約占20%。常規(guī)的或稱為傳統(tǒng)的IVF-ET技術(shù)主要是針對(duì)女性因素所致不孕癥或至少是在沒有嚴(yán)重的少弱精子癥時(shí)可以采用精子和卵混合培養(yǎng)方式完成體外受精，但對(duì)于曾經(jīng)嘗試常規(guī)受精但精卵未能自然結(jié)合，或因男性精子密度過低，活力較差等，或在評(píng)價(jià)精子功能后認(rèn)為不能自然受精時(shí)，可以借助卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射受精技術(shù)實(shí)現(xiàn)精卵結(jié)合完成受精過程。卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射技術(shù)1992年在比利時(shí)首獲成功臨床應(yīng)用，隨后這項(xiàng)技術(shù)迅速普及和發(fā)展，成為治療男性原發(fā)性生精低下，嚴(yán)重少弱畸精子癥，阻塞性無精子癥等所致不育的最主要手段。1983年，Tr。uns。nA報(bào)道首例經(jīng)凍融胚胎移植后成功妊娠分娩的試管嬰兒。如今，胚胎凍融技術(shù)已成為IVF中不可缺少的組成部分，胚胎凍融技術(shù)為充分利用促排卵周期形成的多余胚胎提供了保存和再利用的技術(shù)保障，避免胚胎浪費(fèi)，增加累計(jì)妊娠機(jī)會(huì)。另外，近年來凍融胚胎技術(shù)還用于因促排卵周期發(fā)生卵巢過度刺激等新鮮周期不適宜移植的情況時(shí)，將全部胚胎凍存，在隨后的自然月經(jīng)周期或人工周期進(jìn)行解凍胚胎移植，在更安全的情況下獲得更好的臨床結(jié)局。1991年英國學(xué)者開始將著床前胚胎遺傳學(xué)診斷技術(shù)（preimplantati。ngeneticdiagn。sis,PGD）用于臨床，這項(xiàng)技術(shù)是利用體外受精后形成的分裂球期胚胎的1個(gè)分裂球或囊胚期胚胎的少數(shù)滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的遺傳分析。在不孕不育患者中，部分夫婦不是表現(xiàn)為受孕困難，而是反復(fù)發(fā)生自然流產(chǎn)或有畸形胎兒出生，這些常與夫婦中某一方或雙方存在易造成流產(chǎn)的遺傳異常有關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)的人類遺傳病約4000余種，有些夫婦一方為異常染色體平衡攜帶者或性連鎖疾病攜帶狀態(tài)等，人群中存在這樣或那樣的遺傳缺陷。隨著單細(xì)胞分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展，特別是CGH和sNP芯片技術(shù)的推廣，PGD技術(shù)的應(yīng)用近年來得到快速發(fā)展，使那些因遺傳問題不能順利生育的夫婦有望得到正常后代，避免反復(fù)流產(chǎn)或畸形兒的出生。IVF-ET技術(shù)還成為研究人類生殖過程、遺傳病機(jī)制、干細(xì)胞定向分化等的重要臨床資源，而這些課題的深人研究積累經(jīng)驗(yàn)，必將推動(dòng)醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)的繼續(xù)發(fā)展。第二節(jié)體外受精.胚胎移植（1VF.ET）技術(shù)簡介將從母體取出的卵母細(xì)胞置于培養(yǎng)皿內(nèi)，利用適合人類卵母細(xì)胞生長的培養(yǎng)液進(jìn)行體外培養(yǎng)，加入經(jīng)體外分離處理選擇出的有活力的精子，這些精子在與培養(yǎng)液接觸過程中已經(jīng)被誘導(dǎo)完成了體外獲能過程，精子和卵在體外共同培養(yǎng)過程中完成精卵結(jié)合的受精過程，受精卵繼續(xù)發(fā)育成早早期胚胎后，選擇受精正常且發(fā)育正常的胚胎移植回母體子宮內(nèi)，胚胎著床并且經(jīng)歷"十月懷胎"后嬰兒分娩。由于卵母細(xì)胞受精和受精卵及胚胎發(fā)育的最初幾天（最晚至囊胚期）是在體外培養(yǎng)環(huán)境中完成的，體外受精-胚胎移植技術(shù)（IVF-ET）也被俗稱為"試管嬰兒技術(shù)"。IVF-ET技術(shù)的建立分為兩個(gè)部分，即臨床部分和體外受精胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室部分，分別承擔(dān)不同的工作，只有兩個(gè)部分高度默契配合才能有效完成這項(xiàng)技術(shù)的臨床實(shí)施。臨床部分主要任務(wù)是從需要接受IVF-ET治療的不孕婦女體內(nèi)取出成熟的（或經(jīng)體外培養(yǎng)后能夠發(fā)育成熟的）卵母細(xì)胞，以及把培養(yǎng)所得的胚胎移植回母體內(nèi)（子宮或輸卵管)。實(shí)驗(yàn)室部分則是把卵和精子在體外建立的培養(yǎng)環(huán)境中實(shí)現(xiàn)受精，并把受精卵培養(yǎng)成有活力的早早期胚胎。嚴(yán)重少弱精癥導(dǎo)致的男性不育，則需要借助ICsI技術(shù)輔助受精，所以又把精卵混合培養(yǎng)受精稱為常規(guī)體外受精。按照不孕癥病因不同，因男性或女性因素引起的不孕或不育在接受助孕治療時(shí)需選擇不同的治療方式。按照我國衛(wèi)生行政管理規(guī)定，開展體外受精輔助生殖技術(shù)及其衍生技術(shù)目前主要包括體外受精/胚胎移植、配子/合子輸卵管內(nèi)移植或?qū)m腔內(nèi)移植、卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracyt。plasmicsperminjecti。n,ICsI)、植入前胚胎遺傳學(xué)診斷（preimplantati。ngeneticdiagn。sis,PGD)、卵子贈(zèng)送、胚胎贈(zèng)送等，均需要經(jīng)過衛(wèi)生行政部門的審批后才能開展。對(duì)這些機(jī)構(gòu)的基本要求包括人員和技術(shù)能力、場地要求、專用基本設(shè)備等。第三節(jié)1VF.ET適應(yīng)證隨著IVF-ET技術(shù)的不斷完善和普及，這項(xiàng)技術(shù)目前幾乎成為不孕癥治療的最后一張王牌，從醫(yī)療實(shí)踐中需警惕技術(shù)濫用和盲目擴(kuò)大適應(yīng)證，但是當(dāng)經(jīng)過一定診治過程后認(rèn)為無法自然懷孕的時(shí)候，常常會(huì)轉(zhuǎn)向借助IVF-ET技術(shù)，幾年來IVF-ET的適應(yīng)證在逐漸擴(kuò)大。適應(yīng)證選擇是IVF-ET技術(shù)得以合理應(yīng)用的關(guān)鍵，對(duì)于有適應(yīng)證的患者夫婦還要評(píng)估其身體一般狀態(tài)和生育力狀態(tài)，當(dāng)身體健康狀態(tài)（健康體檢和傳染病排查）適合并能夠承受妊娠和分娩，且生育力評(píng)估后認(rèn)為具備實(shí)施IVF-ET最基本要求時(shí)，可以啟動(dòng)IVF-ET助孕治療后續(xù)流程。一、常規(guī)體外受精技術(shù)適應(yīng)證1.輸卵管堵塞或功能障礙引起精卵運(yùn)輸障礙導(dǎo)致的不孕在IVF技術(shù)出現(xiàn)之前，輸卵管因素引起的不孕主要通過輸卵管成型術(shù)復(fù)通輸卵管或期待治療，IVF技術(shù)為輸卵管因素不孕提供了直接針對(duì)病因的治療方法和較好的療效。2.子宮內(nèi)膜異位癥伴不孕內(nèi)膜異位癥常常伴有不孕，當(dāng)輸卵管通暢時(shí)，期待療法、促排卵或促排卵人工受精、甚至宮腹腔鏡手術(shù)處理等均為常用的治療方法。但是當(dāng)這些治療未能見效時(shí)，可以選擇IVF助孕。對(duì)Ⅲ、N期內(nèi)膜異位癥來說，在盡可能清除病灶的同時(shí)，可能造成卵巢卵細(xì)胞池的消耗，影響IVF助孕時(shí)的成功率。一項(xiàng)對(duì)內(nèi)異癥不孕的回顧性研究結(jié)果顯示，手術(shù)治療后9個(gè)月的妊娠率24%，而在同時(shí)期內(nèi)接受兩次IVF助孕的累計(jì)妊娠率達(dá)70%。3.男性輕度少精、弱精癥當(dāng)妻子不孕，男方精液分析呈現(xiàn)一些精液參數(shù)不正?；蚰承┲笜?biāo)有輕度下降時(shí)，經(jīng)過體外分離技術(shù)處理后，精子總數(shù)和活力可達(dá)到進(jìn)行常規(guī)IVF所需要的數(shù)量，這種情況下IVF技術(shù)可作為一種治療選擇。對(duì)嚴(yán)重的少弱畸精子癥通常采用卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracyt。plas-micsperminjecti。n，ICsI)技術(shù)輔助受精。4.原因不明的不孕不明原因性不孕是指經(jīng)過包括腹腔鏡在內(nèi)的不孕癥病因排查仍不能找出不孕癥病因時(shí)所做的診斷。一般發(fā)生率在10%-20%，一些夫婦在診療或期待過程中成功自然受孕。不明原因多年未孕的夫婦有些會(huì)嘗試IVF助孕，雖然從整體的臨床妊娠率上看，這些夫婦與輸卵管因素不孕夫婦助孕結(jié)局無異，但其發(fā)生完全受精失敗的幾率高于輸卵管因素不孕夫婦，提示其精子或卵母細(xì)胞有潛在異常的可能性，對(duì)常規(guī)受精失敗的夫婦借助ICsI技術(shù)有望成功受精和得到可以懷孕的胚胎，說明自然受精障礙可能是部分夫婦的不孕病因。5.排卵功能障礙性不育最常見的排卵障礙是多囊卵巢綜合征（PC0s)，經(jīng)過數(shù)周期成功誘導(dǎo)排卵仍未受孕或誘發(fā)排卵困難，反復(fù)促排卵失敗時(shí)，控制性卵巢刺激和IVF可作為另一個(gè)治療選擇。雖然越來越多的證據(jù)證明IVF對(duì)治療PC0s不孕的有效性，但也同時(shí)存在發(fā)生0Hss風(fēng)險(xiǎn)大的問題，應(yīng)給予高度重視。部分PC0s婦女還存在促排卵周期卵泡發(fā)育不良的傾向，卵泡生長極緩慢或在發(fā)育過程中發(fā)生退化，這些病例可以嘗試未成熟卵體外成熟培養(yǎng)技術(shù)（inyitramaturati。n,IVM)，從直徑在10mm以下的竇卵泡內(nèi)取出未成熟卵母細(xì)胞，經(jīng)過體外成熟培養(yǎng)后行常規(guī)IVF或ICsI受精，在適應(yīng)證選擇合適，實(shí)驗(yàn)室和臨床技術(shù)成熟穩(wěn)定的情況下，可期待20%-30%的臨床妊娠率。6.其他因素引起的不孕IVF技術(shù)也可適用于如免疫性不孕，年齡因素引起的生育力下降，癌癥患者生育力儲(chǔ)備等情況。二、卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（ICsI)技術(shù)適應(yīng)證對(duì)嚴(yán)重的少、弱、畸精子癥、梗阻性無精子癥、生精功能障礙造成的精液中無精子，但在睪丸活檢組織中能分離出精子的情況下，ICsI技術(shù)是行之有效的助受精技術(shù)，ICsI受精的胚胎有與自然受精形成的胚胎相似的發(fā)育潛力。嚴(yán)重少弱精癥生精障礙的男性，約10%存在染色體和性異常，對(duì)這些病例進(jìn)行ICsI之前要先進(jìn)行染色體核型分析。嚴(yán)重少弱精子癥精液中分離的精子，阻塞性無精子癥附睪抽吸獲得的精子，生精嚴(yán)重低下男性睪丸組織中分離出的精子均可用于ICsI,并獲得較滿意的受精率。另外，對(duì)男性免疫性不育、有常規(guī)體外受精失敗史和精子結(jié)構(gòu)異常，如無頂體或頂體功能異常等也可使用ICsI技術(shù)助受精。ICsI技術(shù)是通過顯微操作，將一條精子注射到一個(gè)成熟的卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，從而輔助完成受精過程。針對(duì)男性因素不育發(fā)展的ICsI技術(shù)在生殖領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用愈來愈廣泛，其適應(yīng)證也不再僅僅局限于少弱精癥。目前，ICsI的主要適應(yīng)證有:①嚴(yán)重的少、弱、畸精癥。精液中有一定數(shù)量活力及形態(tài)良好的精子是保證常規(guī)受精的前提，如果精液質(zhì)量較差，選擇ICsI是最佳治療方案，因?yàn)镮CsI技術(shù)只要保證每枚成熟卵子有一條質(zhì)量較好的精子即可。②不明原因的常規(guī)受精失敗史。對(duì)于既往IVF存在常規(guī)受精失敗或受精率低于20%時(shí)，當(dāng)病人再次進(jìn)行IVF治療，通常建議此周期采用ICsI技術(shù)。③睪丸或附睪精子。對(duì)于一些需要通過手術(shù)從睪丸或附睪中獲取的精子，ICsI技術(shù)也能幫助這些男性利用較少的精子完成受精過程。④需要用PCR技術(shù)診斷的PGD周期。由于單細(xì)胞PCR技術(shù)難度大，準(zhǔn)確性要求高，為了為避免PCR擴(kuò)增時(shí)因顆粒細(xì)胞或精子導(dǎo)致的污染，針對(duì)PCR-PGD周期應(yīng)采用ICsI技術(shù)。第四節(jié)控制性促排卵與卵泡監(jiān)測一、常用控制性促排卵方案目前常用的控制性卵巢刺激方案分為GnRH激動(dòng)劑降調(diào)節(jié)方案和GnRH拮抗劑方案。GnRH激動(dòng)劑降調(diào)節(jié)方案又按照使用激動(dòng)劑起始時(shí)間不同分為長方案，即前一月經(jīng)周期黃體中期開始使用降調(diào)節(jié)藥物。短方案是從同周期月經(jīng)第2天開始使用降調(diào)節(jié)藥物，直至HCG日。超短方案是從同周期月經(jīng)第2天開始使用降調(diào)節(jié)藥物，3d后停用。在月經(jīng)來潮的第2天抽血測定基礎(chǔ)FsH、LH、E、P水平，當(dāng)這些激素水平在基礎(chǔ)狀態(tài)，B超檢查卵巢內(nèi)沒有0.8cm直徑的卵泡時(shí)，可以開始使用促性腺激素，一般劑量為每日150-300U。年齡在35歲以下，B超探測卵巢中基礎(chǔ)竇卵泡較多時(shí)從低劑量開始使用，年齡在35歲以上，基礎(chǔ)竇卵泡少，基礎(chǔ)FsH升高者，采用較高劑量起始。拮抗劑方案是從月經(jīng)周期第2-3天開始每日用促性腺激素150-300U,自使用促性腺激素第5-8天起，每天同時(shí)使用GnRH拮抗藥0.25mg,直至HCG日仍需要使用。GnRH-a長方案:從黃體中期開始使用GnRH-a。此時(shí)由于內(nèi)源性雌二醇和黃體酮水平較高，垂體處于生理抑制狀態(tài)，此時(shí)給GnRH-a一般不會(huì)造成促性腺激素的短暫升高，但有時(shí)仍會(huì)使黃體期延長。因此，長方案是利用GnRH-a對(duì)垂體的短暫促進(jìn)作用消失，垂體處于抑制狀態(tài)后，完全用外源性促性腺激素刺激卵巢。一般認(rèn)為，在月經(jīng)來潮2-4d后即可開始使用促性腺激素（或血雌二醇測定證明卵巢處于抑制狀態(tài)時(shí))，直到卵泡發(fā)育成熟使用HCG日為止，HCG使用后34-36h取卵。使用GnRH-a長方案時(shí)，需適當(dāng)增加促性腺激素的用量，每日用量為3-4支（每支75U)，可多達(dá)每日6支。另外，為能完全有計(jì)劃的安排取卵手術(shù)時(shí)間，可在用GnRH-a兩周后的任何時(shí)間開始給予促性腺激素。GnRH-a長方案是目前IVF-ET中應(yīng)用最多的促排卵方案，約占70%。GnRH-a短方案:從月經(jīng)周期第1-3天起使用GnRH-a,利用GnRH-a使垂體釋放內(nèi)源性促性腺激素的作用促進(jìn)卵泡發(fā)育，使用2-3d后開始使用促性腺激素，注射HCG日停止使用GnRH-a。短方案可減少促性腺激素用量和使用時(shí)間，降低治療費(fèi)用。但偶爾GnRH-a對(duì)前一周期黃體起到喚醒或挽救的作用，孕酮水平升高甚至形成黃體囊腫。這種情況需放棄本次周期治療。GnRH-a超短方案:GnRH-a開始時(shí)間與短方案相同，連續(xù)使用3d止，也有報(bào)道認(rèn)為連續(xù)使用7天能更有效地抑制LH峰提前出現(xiàn)。GnRH拮抗劑方案:不需要事先降調(diào)節(jié)，促排卵周期中卵泡發(fā)育到一定大小時(shí)應(yīng)用GnRH拮抗劑抑制內(nèi)源性LH峰，避免提前排卵。近10年來拮抗劑方案因簡單方便易控，在IVF卵巢刺激方案中占到的比重越來越大。二、控制性促排卵方案中常用藥物及作用1.降調(diào)節(jié)或拮抗內(nèi)源性LH峰的藥物（1）促性腺激素釋放激素激動(dòng)藥（GnRH-ag。nist,GnRH-a）:GnRH-a對(duì)促性腺激素釋放激素（GnRH）受體有更高的親和力，更為持久占據(jù)大部分的受體，使垂體的促性腺激素釋放激素受體大量損失并得不到補(bǔ)充，因而垂體不能對(duì)內(nèi)源性或外源性的GnRH進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)。使用GnRH-a一段時(shí)間后垂體的LH和FsH分泌顯著減少，呈藥物去垂體狀態(tài)，這種現(xiàn)象被稱為垂體的降調(diào)節(jié)。這種垂體抑制作用是可逆的，可隨停藥而恢復(fù)。在超排卵中使用GnRH-a有如下優(yōu)點(diǎn)。①抑制早發(fā)LH峰的發(fā)生，避免其對(duì)卵子的質(zhì)量的不良影響;②降低血漿內(nèi)的LH水平，對(duì)基礎(chǔ)LH水平增高的多囊卵巢綜合征的病人尤為合適;③GnRH-a用藥初期，受藥物作用影響出現(xiàn)一個(gè)短暫的血漿促性腺激素高峰，有刺激小竇卵泡生長的作用;GnRH-a分為短效制劑和長效制劑，短效制劑劑量為100mg/支，一般每日1次，每次1支，連續(xù)用藥8-10d垂體達(dá)到降調(diào)水平，以后每日用藥維持至HCG日停用。長效制劑劑量為3.75mg/支，為緩釋制劑，注射1支藥維持有效血藥濃度28-30d，我國生殖領(lǐng)域用長效制劑較為普遍，并且根據(jù)經(jīng)驗(yàn)常用半劑或1/3劑等作降調(diào)使用。（2）促性腺激素釋放激素拮抗藥（GnRH-antag。nist,GnRH-ant):可與GnRH受體結(jié)合，但不產(chǎn)生信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而阻斷GnRH對(duì)垂體的作用。目前應(yīng)用于輔助生殖臨床的拮抗劑有Centr。relix和Ganirelix兩種。GnRH拮抗劑的作用特點(diǎn)是:①與垂體GnRH受體竟?fàn)幮越Y(jié)合;②使用后立即產(chǎn)生抑制效應(yīng)，降低Gn和性激素水平;③它的抑制效果呈劑量依賴型;④停藥后垂體立刻恢復(fù)反應(yīng)性。GnRH拮抗劑，每支劑量25ug,從卵泡直徑10mm或13mm以后開始，每日注射1次，每次1支拮抗劑，HCG日也要注射。2.人促性腺激素HMG和促卵泡素FsH生理狀態(tài)下，每個(gè)月經(jīng)周期卵巢中都有一批卵泡自發(fā)的進(jìn)人早期發(fā)育狀態(tài)，這種卵泡的自然募集過程大約是從前一個(gè)周期的最后一周開始，所能募集的卵泡數(shù)目與卵巢中剩余的原始卵泡中的卵母細(xì)胞數(shù)成正比，后者與婦女的年齡關(guān)系密切。受藥物刺激后開始發(fā)育的卵泡數(shù)目與自然募集的卵泡數(shù)相關(guān)，這些卵泡對(duì)FsH較敏感。因此，在決定發(fā)育卵泡的數(shù)目方面，年齡比FsH的使用劑量更為重要。個(gè)體對(duì)FsH的反應(yīng)在一定時(shí)期是比較恒定的，可根據(jù)刺激周期E2峰值分為高反應(yīng)和低反應(yīng)兩種類型，高反應(yīng)者獲得卵母細(xì)胞的數(shù)目和妊娠的機(jī)會(huì)均高于低反應(yīng)者。要預(yù)測卵巢的反應(yīng)性，可在月經(jīng)初期測定血清FsH水平，如果內(nèi)源FsH水平在較高水平（20U/ml)，說明卵巢已處于絕經(jīng)前狀態(tài)，對(duì)促性腺激素反應(yīng)差。最初的IVF-ET是利用自然周期取卵，但每個(gè)周期只能得到一個(gè)卵。為了提高妊娠率，目前在實(shí)施IVF-ET技術(shù)時(shí)，多采用控制性卵巢刺激法獲得多個(gè)卵母細(xì)胞，使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)藥或者拮抗藥避免卵泡成熟時(shí)內(nèi)源性LH峰出現(xiàn)造成提前排卵，給予超生理劑量人類促性腺激素，使一次促排卵周期能有多個(gè)卵泡發(fā)育，獲得多個(gè)可用于受精的卵母細(xì)胞，以獲得較多可移植的胚胎。在實(shí)施控制性卵巢刺激促超排卵過程中，須每日或間斷用陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育數(shù)目、大小，同時(shí)監(jiān)測血中雌二醇水平，血或尿LH變化，以便適時(shí)調(diào)整用藥，當(dāng)雙側(cè)卵巢中有2或3個(gè)較大卵泡直徑達(dá)到18mm直徑時(shí)，確定卵泡成熟，給予5000-10000UHCG一次性注射，HCG后36h，發(fā)育好的卵泡中卵母細(xì)胞核成熟，此時(shí)應(yīng)該安排收獲取卵在促排卵技術(shù)用于IVF治療的最初階段，氯米芬和人絕經(jīng)期促性腺激素（HMG）聯(lián)合是最常用的方案，應(yīng)用這種方案比自然周期增加了獲卵數(shù)。HMG是從絕經(jīng)后婦女尿中提取的促性腺激素，每支含有75UFsH和75ULH。人重組促性腺激素r-FsH自1993年以后陸續(xù)開始在世界各地的IVF促排卵方案中廣泛應(yīng)用，其具有不含LH、高純度、劑量和生物活性穩(wěn)定等特點(diǎn)，利用基因工程工廠化生產(chǎn)，且藥品來源充足。促性腺激素給藥劑量因個(gè)體卵巢儲(chǔ)備狀態(tài)不同而異，對(duì)卵巢儲(chǔ)備好的年輕女性（30歲以下)，或者有多囊樣卵巢時(shí)，日用藥劑量，特別是起始劑量應(yīng)在150U或以下;而對(duì)年齡在38歲以上，基礎(chǔ)FsH升高卵巢儲(chǔ)備較差的病例，日用藥量或起始劑量可在300U或以上。在卵泡監(jiān)測過程中如果發(fā)現(xiàn)被刺激生長的卵泡數(shù)不足或生長緩慢時(shí)，可適當(dāng)增加促性腺激素劑量，而當(dāng)刺激出的卵泡數(shù)目過多時(shí)，應(yīng)適當(dāng)減少用藥量，降低發(fā)生卵巢過度刺激綜合征的風(fēng)險(xiǎn)。3.絨毛膜促性腺激素HCG一般來說，當(dāng)B超監(jiān)測到兩側(cè)卵巢中有3個(gè)以上卵泡達(dá)到18mm直徑以上時(shí)，提示卵泡已發(fā)育至排卵前狀態(tài)，為誘發(fā)卵泡中卵母細(xì)胞細(xì)胞核減數(shù)分裂開始，一次性注射HCG5000-10000U,HCG可替代排卵前內(nèi)源性LH峰，使卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，并在用藥后36h左右處于第二次減數(shù)分裂中期，此時(shí)的卵母細(xì)胞即稱之為成熟卵母細(xì)胞，具備了與精子結(jié)合受精的功能。在拮抗劑方案中，也可使用GnRH-a對(duì)垂體的激動(dòng)作用，觸發(fā)垂體迅速大量釋放LH,誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟。三、促排卵周期卵泡發(fā)育的監(jiān)測1.實(shí)時(shí)超聲觀察卵泡發(fā)育超聲觀察在監(jiān)測卵泡發(fā)育過程中起到重要作用，可同時(shí)觀察卵泡的大小和數(shù)目，特別是陰道超聲的使用大大方便了醫(yī)生和患者，具有簡單、直觀、可靠等特點(diǎn)。從月經(jīng)周期第8天左右開始每日或隔日觀察一次，測定并記錄發(fā)育卵泡的數(shù)目、直徑以及子宮內(nèi)膜的發(fā)育情況。在使用促性腺激素促排卵時(shí)，當(dāng)2個(gè)以上卵泡直徑達(dá)到16mm以上，可作為卵泡發(fā)育成熟的一項(xiàng)重要指標(biāo)，此時(shí)子宮內(nèi)膜厚度至少應(yīng)在8mm以上。超聲監(jiān)測作為一種聲像學(xué)檢查，對(duì)其結(jié)果應(yīng)當(dāng)進(jìn)行鑒別分析，可利用動(dòng)態(tài)觀察的辦法鑒別小囊腫和發(fā)育中的卵泡，但有時(shí)小囊腫也隨月經(jīng)周期或受藥物刺激而長大，必要時(shí)結(jié)合雌二醇水平進(jìn)行鑒別，也可在卵泡早期或前一周期的黃體后期做一次超聲檢查，排除小囊腫存在。2.血清雌二醇測定血清雌二醇（E2）水平取決于卵泡大小和發(fā)育卵泡的數(shù)目。隨著卵泡發(fā)育，顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的雌激素增加，當(dāng)最大卵泡直徑達(dá)18mm,且血清雌二醇水平達(dá)到平均每個(gè)卵泡直徑15mm時(shí)為500pm。l,要考慮注射HCG誘導(dǎo)排卵，E2水平達(dá)3000mU/L以上，B超顯示多個(gè)卵泡發(fā)育時(shí)，取卵后發(fā)生嚴(yán)重的卵巢過度刺激綜合征風(fēng)險(xiǎn)增加，需要警惕，必要時(shí)可采取全胚胎凍存措施，避免發(fā)生遲發(fā)型中、重度卵巢過度刺激綜合征。第五節(jié)取卵術(shù)和精子采集一、B超引導(dǎo)下穿刺抽吸卵泡取卵超聲引導(dǎo)下行經(jīng)陰道取卵是指在陰道超聲探頭引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺抽吸卵泡取卵，這項(xiàng)技術(shù)是1983年首先由Gleicher等開始使用的（圖18-2)。目前陰道超聲取卵已取代腹腔鏡取卵成為最常用的取卵方式。取卵時(shí)，患者采取截石位，用生理鹽水沖洗陰道或先用含碘溶液沖洗，然后再用生理鹽水沖洗。有些情況下還可在取卵術(shù)前后用抗生素預(yù)防感染。陰道取卵所使用的超聲探頭一般為高頻陰道探頭（7MHz)，帶有穿刺引導(dǎo)支架。穿刺針內(nèi)徑120-140um,穿刺針尖部鋒利，且在靠近針尖部經(jīng)過特別加工處理，超聲下清晰可見此處回聲增強(qiáng)。穿刺針沿著針導(dǎo)進(jìn)入，抽吸卵泡負(fù)壓100-120mmHg,當(dāng)針尖位置在卵泡中心且隨著卵泡液吸出卵泡塌陷說明穿刺準(zhǔn)確，旋轉(zhuǎn)針頭有助于徹底吸空卵泡，必要時(shí)可用培養(yǎng)液沖洗卵泡1次或2次。一個(gè)卵泡抽吸完畢后，穿刺針可繼續(xù)向前穿刺鄰近卵泡。每次取出穿刺針后都要用培養(yǎng)液抽吸沖洗穿刺針和管道系統(tǒng)，常有卵和凝血塊存留其中。超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵具有簡便、快捷，不用全身麻醉和并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，但仍有可能發(fā)生出血，器官損傷（膀胱、腸管、骼血管等)，以及術(shù)后感染等危險(xiǎn)。因此在穿刺時(shí)必須肯定該結(jié)構(gòu)是在卵巢輪廓之內(nèi)，且從三維徑線上看是球形結(jié)構(gòu)。卵巢和卵泡深藏于盆腔內(nèi)，如何在排卵前將卵取出曾經(jīng)困擾著這項(xiàng)技術(shù)的開展。當(dāng)已經(jīng)掌握了哺乳動(dòng)物體外受精技術(shù)的Edwards教授遇到了婦科內(nèi)鏡技術(shù)專家stept。e教授時(shí)，碰撞出的利用腹腔鏡微創(chuàng)技術(shù)取卵的火花，成就了人類歷史上的一個(gè)醫(yī)學(xué)奇跡，第一例試管嬰兒由此誕生。陰道B超引導(dǎo)下卵泡穿刺取卵術(shù)是目前最常用的取卵方式。取卵術(shù)前可使用鎮(zhèn)痛劑或采用靜脈麻醉讓患者在無痛苦狀態(tài)下結(jié)束穿刺取卵術(shù)。一般情況下穿刺兩側(cè)卵泡取卵可在約10min內(nèi)完成，B超引導(dǎo)下卵泡穿刺取卵術(shù)簡便易行、痛苦小、創(chuàng)傷小、易接受、可以多次進(jìn)行等特點(diǎn)，對(duì)IVF技術(shù)的普及應(yīng)用起到了有力的推動(dòng)作用。經(jīng)陰道超聲取卵可采用局麻和鎮(zhèn)靜劑或使用短效靜脈麻醉劑，后者必須同時(shí)開放靜脈直到取卵結(jié)束麻醉恢復(fù)后才能讓病人離院。麻醉中要密切監(jiān)測患者生命體征，盡量避免各種麻醉并發(fā)癥的發(fā)生。所謂穿刺取卵手術(shù)，實(shí)為穿刺抽吸卵泡液，抽出的卵泡內(nèi)容物送至IVF實(shí)驗(yàn)室，在實(shí)體顯微鏡下從卵泡液中收集卵冠丘復(fù)合物。取卵手術(shù)前，IVF實(shí)驗(yàn)室需要了解每一個(gè)病人并核對(duì)其詳細(xì)資料，書寫采卵記錄單，在患者清醒時(shí)與患者核對(duì)夫妻雙方姓名和女方出生年月日等。卵泡抽吸取卵時(shí)抽出的卵泡液為草黃色清亮液體，當(dāng)混合少量血液時(shí)變?yōu)榧t色，其中懸浮一些細(xì)胞團(tuán)塊或有透明狀黏液。將卵泡液倒人圓皿中，肉眼可辨認(rèn)直徑約3-5mm的透明狀黏液團(tuán)，其中針尖大小的白點(diǎn)即為卵冠丘復(fù)合物（0C)。如肉眼未發(fā)現(xiàn)0C,需要在低倍顯微鏡下仔細(xì)辨認(rèn)和尋找。由于卵母細(xì)胞很容易受到溫度、pH以及滲透壓等變化的影響，受外界環(huán)境的變化損傷卵母細(xì)胞將呈現(xiàn)出受精障礙或影響受精后胚胎的活力，因此需要快速的將采集到的0C轉(zhuǎn)移至預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，置于5%或6%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。卵母細(xì)胞的質(zhì)量可以通過顆粒細(xì)胞、卵丘放射冠形態(tài)以及卵子的形態(tài)等方面來評(píng)估。倒置鏡下還可以觀察到不同時(shí)期卵子的特點(diǎn)。GV期卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見生殖泡，GV期的卵子不具備受精能力。MI期卵子生殖泡消失，但沒有排出第一極體，MI期卵子如能體外成熟，可以受精。MⅡ期卵子是卵子的成熟時(shí)期，鏡下可見第一極體，此期卵子受精率高。二、精子采集女方取卵同時(shí)或取卵后2h內(nèi)安排男方取精，取精前應(yīng)該需禁欲3-5d。取卵日男方手淫方式取精，精液放人"無菌無毒"的專用取精杯中。取出的精液立即傳人相應(yīng)的精子實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室人員要認(rèn)真核對(duì)夫婦姓名后接受標(biāo)本和進(jìn)行精子分離處理。處理前精液在室溫下要液化30min后進(jìn)行處理精液。處理精液的目的是去除精漿，集中活動(dòng)的精子并使之獲能。常用的精液處理方法有上游法和密度梯度離心法。處理后的精子調(diào)整好密度后，以每個(gè)卵子對(duì)應(yīng)10萬-50萬條精子的比例進(jìn)行受精。對(duì)于少弱精癥患者或手術(shù)獲取精子的患者需要通過ICsI技術(shù)實(shí)施受精過程。正常精液在分離后可得到數(shù)百萬或千萬個(gè)以上活精子，可用于實(shí)施常規(guī)體外受精。嚴(yán)重少弱精患者分離出的活動(dòng)精子少，需要通過卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射輔助受精。三、手術(shù)取精對(duì)于阻塞性無精子癥，或嚴(yán)重生精障礙可從睪丸曲細(xì)精管中分離出精子患者的，借助經(jīng)皮睪丸穿刺或附睪穿刺法取精，抽出的附睪液或睪丸組織在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，分離出精子。睪丸或附睪中得到的精子一般不足以進(jìn)行常規(guī)受精，需借助卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射受精。第六節(jié)體外受精和胚胎評(píng)估將取到的卵泡液注人培養(yǎng)皿，肉眼快速辨認(rèn)含卵細(xì)胞及其外周的透明帶、放射冠的卵冠丘復(fù)合物。在解剖鏡下確認(rèn)有卵細(xì)胞存在后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)已預(yù)置受精培養(yǎng)液并在C02培養(yǎng)箱平衡過夜，找到的卵在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h，按每1ml受精培養(yǎng)液含有10萬左右活動(dòng)精子的濃度進(jìn)行受精，經(jīng)過用培養(yǎng)液洗滌離心上游等過程分離出的精子是已經(jīng)被誘導(dǎo)完成獲能過程的精子，在分離出的精子數(shù)量和質(zhì)量符合常規(guī)受精標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，采取精子和卵混合培養(yǎng)的受精方式，這種方式受精更符合生理狀態(tài)下精子和卵自然選擇的過程。當(dāng)男方為嚴(yán)重少弱畸精子癥患者，或者是手術(shù)獲取的睪丸或附睪精子時(shí)，需要采取卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射輔助受精。另外，當(dāng)精液精子分離不滿意，或有過常規(guī)受精失敗史的夫婦，也可選擇單精子注射受精的方式。體外受精后16-18h觀察有無原核形成，并更換卵裂期培養(yǎng)液。對(duì)于常規(guī)受精的卵子需要吹打去除顆粒細(xì)胞才能觀察到原核。正常受精可以看見卵子中有兩個(gè)相同大小的圓形結(jié)構(gòu)，即雌雄原核。同時(shí)還可以在卵周隙觀察到第二極體。近年來有學(xué)者利用原核評(píng)分評(píng)估胚胎發(fā)育潛能。在觀察受精時(shí)，通常會(huì)遇見無原核出現(xiàn)或僅見單個(gè)原核出現(xiàn)的情況，甚至有時(shí)還會(huì)有多個(gè)原核出現(xiàn)的情況。無原核出現(xiàn)或出現(xiàn)單原核的情況不一定意味著受精失敗，有可能為孤雌激活、延遲受精或者是雌雄原核出現(xiàn)不同步等情況。多精子受精后可以觀察到3個(gè)或3個(gè)以上原核，這樣的胚胎不能用于移植。目前胚胎的選擇仍然以形態(tài)學(xué)評(píng)估應(yīng)用最為廣泛。形態(tài)學(xué)特征對(duì)胚胎質(zhì)量的評(píng)價(jià)見表18-1。表18-1體外受精人早期胚胎質(zhì)量評(píng)價(jià)分級(jí)形態(tài)特征細(xì)胞碎片1分裂球大小均等，透亮無2分裂球大小不均10%3分裂球大小不均10%-50%4分裂球大小不均50%體外受精后胚胎在第5天時(shí)發(fā)育到囊胚期，隨著體外培養(yǎng)體系的完善，特別是專供囊胚培養(yǎng)的培養(yǎng)液的使用，囊胚培養(yǎng)和移植受到推崇，囊胚移植有利于進(jìn)一步行胚胎選擇。如果有優(yōu)質(zhì)囊胚形成，囊胚移植可得到更好的臨床妊娠率，選擇性單囊胚移植更能夠在最大限度減少多胎的情況下，保持較滿意的臨床妊娠率。第七節(jié)胚胎移植（embry。transfer,ET)取卵后第2-3天卵裂球期胚胎和第5-6天的囊胚期胚胎都可進(jìn)行胚胎移植。囊胚移植比較符合自然受精胚胎進(jìn)入子宮的時(shí)間，且在現(xiàn)有體外培養(yǎng)條件下，能發(fā)育至囊胚說明胚胎具有生命力，移植成功率高。一次移植的胚胎數(shù)以2枚或3枚為宜。我國相關(guān)規(guī)定，35歲以下病人，第一次接受IVF-ET治療時(shí)移植2個(gè)胚胎，年齡大或反復(fù)不成功的病例，最多移植3個(gè)胚胎。增加胚胎移植數(shù)，妊娠率雖略有增加，但多胎率卻會(huì)隨之顯著增加。為減少多胎妊娠帶來的危害，推薦選擇性單囊胚移植，有較高的妊娠率，又可以降低多胎率。在早期胚胎發(fā)育過程中，透明帶逐漸變薄;擴(kuò)張的囊胚使得透明帶進(jìn)一步變薄，進(jìn)而突破透明帶，囊胚孵出，然后完成著床過程。透明帶結(jié)構(gòu)或者功能異常時(shí)，均會(huì)影響卵子受精和胚胎發(fā)育以及著床等過程。這種情況下可在胚胎移植前借助透明帶打孔或削薄等輔助孵化技術(shù)幫助胚胎孵出和著床。輔助孵化技術(shù)是否能幫助胚胎孵出，仍存爭議，應(yīng)嚴(yán)格把握輔助孵化適應(yīng)證。較為公認(rèn)的適應(yīng)證有:高齡患者（40歲以上)、透明帶增厚、數(shù)次胚胎移植未妊娠（3次以上）的患者等。胚胎移植是用專用移植管裝載要移植的胚胎，經(jīng)陰道從宮頸口送人子宮內(nèi)的過程，提高移植者的熟練度和技巧有助于獲得更好地臨床結(jié)局，移植管進(jìn)入子宮腔后釋放胚胎的位置應(yīng)在距宮底部10-15mm處，B超引導(dǎo)下移植也許有助于更準(zhǔn)確的觀察移植位置。IVF的成功應(yīng)是獲得單胎妊娠并分娩。胚胎能否著床取決于胚胎質(zhì)量及子宮內(nèi)膜的容受性。胚胎移植的目的是將胚胎安全的運(yùn)送到子宮腔內(nèi)。胚胎移植前，移植醫(yī)師和實(shí)驗(yàn)室人員以及護(hù)士都要認(rèn)真核對(duì)夫婦姓名，避免因疏忽導(dǎo)致的嚴(yán)重錯(cuò)誤。將移植后剩余的分裂球期胚胎或者囊胚期可移植胚胎要進(jìn)行冷凍保存，凍存胚胎的常用方法有程序冷凍和玻璃化冷凍，保存在液氮中。第八節(jié)黃體支持和妊娠隨訪一、黃體支持由于控制性促排卵抑制內(nèi)源性LH分泌，抽吸取卵術(shù)時(shí)又將一定數(shù)量的卵泡顆粒細(xì)胞帶出，以及多個(gè)卵泡發(fā)育引起的雌孕激素比值不合理等，在IVF-ET后一般都采用添加黃體酮的方法進(jìn)行黃體支持。目前可供選擇的黃體酮制劑有肌內(nèi)注射黃體酮，陰道內(nèi)使用的黃體酮凝膠或膠丸，口服黃體酮片等，使用劑量為肌內(nèi)注射黃體酮60mg/d，或雪諾酮凝膠90mg/d。黃體支持從取卵日開始，取卵術(shù)后當(dāng)日即使用黃體酮，若該周期移植后未懷孕，在移植后2周經(jīng)過血HCG測定為陰性時(shí)可以停藥，如診斷懷孕后最好要用至移植后8-10周，無出血、腹痛等，應(yīng)逐漸減量至停用。二、妊娠隨訪IVF-ET術(shù)后隨訪包括幾個(gè)方面，首先是妊娠隨訪，在移植后12-14d抽血查血中HCG水平，能診斷妊娠則要繼續(xù)用藥1-2周后復(fù)查HCG,此時(shí)HCG又一次呈現(xiàn)數(shù)倍甚至數(shù)十倍上升，移植后4周以上B超上可看到宮內(nèi)正常發(fā)育的胚胎的原始胎心管搏動(dòng)，診斷為活胎宮內(nèi)妊娠。于中孕期，最好還有一次隨訪，了解妊娠進(jìn)展情況，分娩后隨訪要了解分娩孕周、新生兒出生體重、身長、有無畸形等，對(duì)于孩子出生后健康狀態(tài)、智力、體能、身體發(fā)育等都應(yīng)該是IVF-ET后出生嬰兒的長期觀察隨訪項(xiàng)目。臨床妊娠率或分娩率是目前評(píng)估IVF-ET技術(shù)實(shí)施后是否獲得療效的最重要的指標(biāo)。但是，因IVF-ET后是否能夠獲得生育子女機(jī)會(huì)在很大程度上受女方年齡，生育力儲(chǔ)備等因素的影響。治療后的妊娠率在年輕的預(yù)后好的病例中可期待40%-50%的活嬰率。而在年齡大、不孕原因復(fù)雜、卵巢儲(chǔ)備差以及存在子宮容受性差等問題的病例，雖經(jīng)過嚴(yán)格的調(diào)整治療，臨床妊娠率和獲得活嬰的機(jī)會(huì)仍然很低。雖然已經(jīng)有很大的提高，但總體來說，目前IVF-ET治療后的活嬰分娩率為25%-35%。IVF-ET后懷孕的病例中自然流產(chǎn)發(fā)生率在10%左右、而且宮外孕的風(fēng)險(xiǎn)較大，特別是容易存在宮內(nèi)宮外合并妊娠或?qū)m外多部位妊娠等復(fù)雜情況，在妊娠隨訪檢查中，要特別謹(jǐn)慎。多胎妊娠是IVF-ET后又一妊娠高危因素，鑒于多胎妊娠帶給母嬰的多重危險(xiǎn)，生殖領(lǐng)域近年來越來越多的主張進(jìn)行選擇性單胚胎移植。第九節(jié)人類生育力的冷凍保存隨著生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，配子和胚胎的低溫保存技術(shù)已經(jīng)成為IVF-ET領(lǐng)域中常規(guī)技術(shù)之一。一、人類胚胎冷凍保存和復(fù)蘇技術(shù)IVF治療過程中，由于應(yīng)用了促排卵藥物，在一個(gè)周期內(nèi)可以獲得數(shù)個(gè)卵母細(xì)胞，受精后可以獲得數(shù)個(gè)胚胎;一次移植可以使用2枚或3枚胚胎，那么將剩余的胚胎凍存，可以最大程度保護(hù)患者的利益。隨著囊胚培養(yǎng)技術(shù)逐漸成熟，囊胚冷凍近年來發(fā)展迅速。二、人類配子及性腺組織體外保存（生殖儲(chǔ)備）技術(shù)精子冷凍包括精液精子冷凍、睪丸或附睪精子冷凍、睪丸組織冷凍等。精液精子冷凍技術(shù)簡單穩(wěn)定，對(duì)于一些無精癥患者來說，在手術(shù)活檢睪丸或附睪診斷是否有生精功能的同時(shí)，可以將存在精子患者的組織或精子冷凍，待日后IVF治療時(shí)使用;這樣既減輕了患者的痛苦，又提高了這些患者的精子利用率。另外，對(duì)于一些年輕的惡性腫瘤患者在放化療前凍存精液，可以保存其生育力。卵子凍融技術(shù)是近年來生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。雖然胚胎凍融技術(shù)已經(jīng)十分成熟，但是一些特殊的情況，例如取卵日無法獲得精子、宗教信仰問題、卵子庫建立等均需要凍存卵子。卵子是人類最大的細(xì)胞，凍存過程中容易形成冰晶導(dǎo)致細(xì)胞損傷致使復(fù)蘇率降低。目前針對(duì)卵子的凍存主要應(yīng)用玻璃化凍存技術(shù)凍存MⅡ期卵母細(xì)胞。卵子在凍存前需要?jiǎng)兂w粒細(xì)胞。隨著腫瘤治療的進(jìn)展，許多惡性腫瘤患者生存期得到了大幅度的提高。但是在惡性腫瘤治療的過程中，放、化療都不可避免地會(huì)損傷性腺組織。對(duì)于男性患者來說，可以凍存精液保存其生育力，對(duì)于年輕女性腫瘤患者來說，除了可以保存卵子、胚胎，還可以凍存卵巢組織。由于凍存卵巢組織比凍存配子或胚胎復(fù)雜得多，因而目前臨床上尚未廣泛開展。

第二部分體外受精-胚胎移植及其衍生技術(shù)第一節(jié)體外受精.胚胎移植技術(shù)體外受精-胚胎移植技術(shù)，包括培養(yǎng)基的準(zhǔn)備、卵子的收集、精液的處理、體外受精操作、胚胎培養(yǎng)、胚胎評(píng)估以及選擇和移植等技術(shù)。一、常規(guī)體外受精（一）培養(yǎng)液的準(zhǔn)備培養(yǎng)基是卵子體外發(fā)育成熟以及完成受精和胚胎發(fā)育的主要環(huán)境，在37℃C02培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)基可以為卵子提供一個(gè)恒定的溫度和pH,同時(shí)為卵子提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)。依據(jù)不同的發(fā)育階段使用的培養(yǎng)液主要有受精液、卵裂期培養(yǎng)液、囊胚培養(yǎng)液和移植液。目前商品化培養(yǎng)基有很多種，使用時(shí)要依據(jù)培養(yǎng)基的要求設(shè)置C02培養(yǎng)箱的C02濃度，以維持胚胎發(fā)育的適宜pH,目前所用的大多數(shù)培養(yǎng)液，需要用5%-7%的C02平衡使培養(yǎng)液的pH達(dá)到7.20-7.45的水平。但胚胎培養(yǎng)液中的碳酸和碳酸氫鹽緩沖體系不一定是唯一左右培養(yǎng)液pH的系統(tǒng)，培養(yǎng)液中還存在其他的共輒酸堿對(duì)共同參與緩沖系統(tǒng)的平衡。不同批號(hào)的同一培養(yǎng)基pH也可能存在差異，單獨(dú)這個(gè)差異可能不足以影響胚胎的發(fā)育，但如果因?yàn)榕囵B(yǎng)箱C02濃度的偏移加大了這個(gè)差異或是加上其他因素，綜合起來就會(huì)損傷胚胎的發(fā)育潛能。胚胎自身調(diào)節(jié)pH的能力是有限的，細(xì)胞外pH（pHe）的變化會(huì)對(duì)細(xì)胞造成應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)pH（pHi)變化影響酶的活性、膜的轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白的合成、糖酵解、關(guān)鍵的代謝以及細(xì)胞的分裂、分化。鼠胚pHi從7.25降至7.1時(shí)，可導(dǎo)致胎鼠的體重和身長降低。為方便跟蹤每個(gè)胚胎的發(fā)育情況，目前采用的培養(yǎng)多是微滴式單胚胎培養(yǎng)，亦即將液體制備成20-50ul的微滴，每個(gè)微滴培養(yǎng)一枚胚胎。為防止微滴液體的揮發(fā)而引起滲透壓的變化，可采用礦物油覆蓋培養(yǎng)基，覆蓋礦物油還可以減少體外操作時(shí)溫度和pH的波動(dòng)范圍，建立一道介于培養(yǎng)液滴與外界環(huán)境的屏障，減少空氣中塵粒及細(xì)菌污染，同時(shí)維持液滴的三維空間。但也研究認(rèn)為礦物油會(huì)吸收液體內(nèi)一些脂溶性因子，向液體內(nèi)擴(kuò)散一些不明但可能影響到胚胎發(fā)育的有害物質(zhì)。礦物油也可能存在一些不明的有毒物質(zhì)會(huì)影響正常發(fā)育，如保存條件等都會(huì)增加這種可能性。為減少礦物油自身可能帶來的潛在危害，也有人認(rèn)為礦物油經(jīng)培養(yǎng)基洗滌過濾后更有利于胚胎的體外發(fā)育，清洗過程有利于去除水溶性毒素物質(zhì)，因此礦物油在使用前進(jìn)行質(zhì)量控制試驗(yàn)是十分必要的。為了培養(yǎng)液得到充分的平衡，達(dá)到胚胎發(fā)育所需的pH,一般在使用的前一天下午準(zhǔn)備培養(yǎng)液微滴，使其隔夜平衡。培養(yǎng)基完全平衡需要的時(shí)間因培養(yǎng)基的體積以及有無油覆蓋而不同，研究發(fā)現(xiàn)覆蓋油的50ul的培養(yǎng)基需要8h才能完全平衡。（二）卵母細(xì)胞的采集與評(píng)估1.試劑與耗材（1）卵泡沖洗液:具有緩沖能力的培養(yǎng)基，主要用于卵泡抽吸系統(tǒng)，取卵時(shí)卵泡以及卵丘復(fù)合體的沖洗。（2）礦物油:覆蓋用于體外操作的液體或體外培養(yǎng)的液滴。（3）受精液:存放收集的卵冠丘復(fù)合體（。cytec。r。nacumulusc。mplex,0Cs)。（4）人血清白蛋白或血清蛋白替代物。所有液體以及蛋白的添加都需提前準(zhǔn)備，需要平衡的需充分平衡。（5）材料與設(shè)備:直徑60mm、35mm培養(yǎng)皿，15ml試管、移液管、移液槍、巴氏吸管;試管保溫架、熱板、顯微鏡、C02培養(yǎng)箱。2.卵子的回收（1）取卵、選卵前開啟所有的設(shè)備，并確認(rèn)各設(shè)備設(shè)置參數(shù)正常，如熱板設(shè)置溫度。（2）在獲得卵泡液后，迅速將卵泡液倒人60mm培養(yǎng)皿內(nèi)，在體式顯微鏡下識(shí)別并挑出0Cs。（3）將0Cs移人洗卵液洗滌2次或3次，盡可能除去黏附在卵丘顆粒細(xì)胞上的血塊，將洗滌后的0Cs轉(zhuǎn)人受精或成熟培養(yǎng)基中。根據(jù)顆粒細(xì)胞和卵丘放射冠的形態(tài)初步評(píng)估卵子的成熟度并孵育2-6h，以促使卵子的進(jìn)一步成熟，等待受精。3.0Cs的評(píng)估卵冠丘復(fù)合物成熟度評(píng)價(jià)應(yīng)記錄顆粒細(xì)胞著色情況（正常、稍深、深)，顆粒細(xì)胞量（少、正常、稍多、多)，顆粒細(xì)胞松散程度（致密、稍密、正常、松散)，卵子體積（小、稍小、正常)，放射冠清楚程度等。（1）退化或閉鎖卵:很少有細(xì)胞附著于透明帶上。很可能沒有丘細(xì)胞形成。相應(yīng)的卵泡膜細(xì)胞小，很少。（2）不成熟卵:卵細(xì)胞呈深色，放射冠完全沒有分散開，卵丘細(xì)胞緊密排列在一起，顏色偏深或卵丘細(xì)胞團(tuán)很小。（3）接近成熟的卵:卵細(xì)胞外觀顏色變淺，放射冠已呈不同程度的分散，卵丘細(xì)胞排列變稀松，顏色變淺。（4）成熟卵:卵細(xì)胞外觀顏色很淡，形狀為規(guī)則的圓形，放射冠呈完全分散狀，卵丘細(xì)胞團(tuán)通常較大、排列松散、顏色很淡。（5）過熟卵:卵細(xì)胞顏色變深，放射冠充分?jǐn)U展，或塊狀，變黑，折光性較差。但外周的卵丘細(xì)胞團(tuán)很小或缺失。卵泡膜顆粒細(xì)胞變黑。目前對(duì)0Cs評(píng)估并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，有關(guān)其評(píng)估的價(jià)值也存在很大的爭議。有研究認(rèn)為顆粒細(xì)胞以及放射冠狀細(xì)胞的擴(kuò)展與受精率、卵裂率和臨床妊娠率無關(guān)。而顆粒細(xì)胞粘有血塊的出現(xiàn)與卵母細(xì)胞中心顆?；嘘P(guān)，對(duì)卵母細(xì)胞的受精和囊胚形成率有負(fù)面影響。也有研究認(rèn)為冠狀細(xì)胞的形態(tài)與體外發(fā)育潛能和囊胚質(zhì)量、受精和妊娠有關(guān)。4.卵母細(xì)胞的成熟度評(píng)估如果顆粒細(xì)胞致密或卵子體積較小，可考慮先用透明質(zhì)酸酶去除顆粒細(xì)胞，評(píng)估卵子的成熟度，以確定是受精或進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。對(duì)于ICsI受精，去除顆粒細(xì)胞評(píng)估卵母細(xì)胞的成熟度是必須的一步。當(dāng)去除卵母細(xì)胞周圍的卵丘顆粒細(xì)胞后，根據(jù)生發(fā)泡是否破裂和第一極體是否釋放可明確判斷卵子成熟狀態(tài)，同時(shí)對(duì)卵胞質(zhì)、第一極體、卵周隙和透明帶的形態(tài)變化可更直觀準(zhǔn)確地觀察（圖19-1)。（1）退化或閉鎖卵:有任何形式的核（第一極體、GV泡或兩者均無)。胞質(zhì)呈棕色至黑色，形狀很不規(guī)則。透明帶呈鋸齒狀。（2）GV（germinalVesicle）期卵:細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)尚未消失，卵胞質(zhì)中可見一個(gè)完整的球形核稱為GV,胞核大，含有核膜和單個(gè)折光的核仁。規(guī)則或不規(guī)則的胞質(zhì)，中心稍許變黑并呈顆粒狀。（3）MI（metaphaseI）期卵:細(xì)胞核結(jié)構(gòu)消失，第一極體尚未排出。胞質(zhì)圓形，淺色，有時(shí)有小顆粒。（4）MⅡ（metaphaseⅡ）期卵:細(xì)胞核結(jié)構(gòu)消失，第一極體排出。胞質(zhì)勻稱，淺色，顆粒均勻。（5）過熟型卵:完整或碎裂的第一極體。胞質(zhì)圓形對(duì)稱，變黑或呈顆粒狀，有時(shí)甚至可見空泡。圖19-1卵母細(xì)胞成熟度評(píng)估 （三）精液的準(zhǔn)備、處理1.取精前準(zhǔn)備男方在女方采卵的當(dāng)天取精，取精前核對(duì)其身份證、結(jié)婚證證實(shí)其夫婦身份，在取精杯蓋和側(cè)面記錄患者及丈夫的姓名。患者禁欲3-7d，超過或短于這個(gè)時(shí)限可能導(dǎo)致結(jié)果異常。精液標(biāo)本最好通過手淫方式采集到準(zhǔn)備好的專用容器中。容器要保證無菌。為減少污染機(jī)會(huì)，在射精前打開蓋子，射精后立即蓋好蓋子，不要接觸容器的內(nèi)表面。2.正常精液的處理方法精液的處理方法選擇，要求操作方法簡易;能夠在獲得較多活動(dòng)精子的同時(shí)又能有效地去除有害的生物活性物質(zhì)或活性氧化物;不造成精子損傷或改變精子的生理功能。但很少有一種方法完全滿足上述要求。目前IVF中精液的處理方法有上游法和密度梯度離心法。（1）上游法:利用活動(dòng)精子具有向培養(yǎng)液中擴(kuò)散的能力，從而將活動(dòng)的精子與死精子、凝集精子、白細(xì)胞及雜質(zhì)分開。①取卵前一天，把加有蛋白的洗精液和受精液放置于C02培養(yǎng)箱內(nèi)平衡過夜。②精液取出后，根據(jù)精液的量和質(zhì)量準(zhǔn)備2-4個(gè)試管。每個(gè)試管中添加1ml的精液，然后在精液上面加入2ml平衡好的受精液。將試管置于37℃、6%C02培養(yǎng)箱內(nèi)30-60min。③在不觸及底層的情況下將試管內(nèi)上層液體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)潔凈的試管內(nèi)，添加3-5ml平衡好的受精液混勻并離心。1400轉(zhuǎn)/min,5min。④去除上清液，添加平衡好的G-IVF至3ml左右，混勻，并重復(fù)離心。⑤去除上游管的上清液，根據(jù)精子樣本的質(zhì)量，用0.5-1ml平衡好的受精液收集所有精子團(tuán)，混勻，檢查所獲精子的活力以及密度。⑥用平衡好的受精液稀釋精子至想要的密度，加精時(shí)根據(jù)精子的密度以及加精的密度決定加入的量。（2）密度梯度洗精法:根據(jù)不同濃度的梯度液具有不同的密度，在離心狀態(tài)下，將精液中的細(xì)胞成分按密度不同進(jìn)行分離。與上游法比較，密度梯度離心法可回收更多形態(tài)正常的精子，并明顯增加精子的活力和體外生存能力，尤其對(duì)精液嚴(yán)重異常者更能體現(xiàn)其優(yōu)越性。①在15ml離心管中添加1.5ml的下層梯度液，再在其表層緩慢加入1.5ml上層梯度液。②將孵化了30min的精液1.5-5ml加入裝有梯度液的離心管內(nèi)。③以800轉(zhuǎn)/min,離心20min。④去除上清液，將精子團(tuán)轉(zhuǎn)人裝有3ml洗精液的離心管中，混勻，離心（1400轉(zhuǎn)/min,5min)。⑤棄上液，將底部精子懸液轉(zhuǎn)人已經(jīng)平衡的3ml受精液的離心管內(nèi)離心（1400轉(zhuǎn)/min,5min)。⑥去上清，將底部含精子沉淀物輕輕混勻后，轉(zhuǎn)人裝有0.4-0.6ml的受精液的圓底管的底部，置于C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵化以備受精用。（四）體外授精與受精觀察（圖19-2)受精是指精子與卵子結(jié)合成為一個(gè)受精卵的過程，體內(nèi)受精發(fā)生于輸卵管的壺腹部。體外受精簡言之就是將從體內(nèi)獲得的配子在體外完成受精。受精卵經(jīng)體外培養(yǎng)發(fā)育成早期胚胎或囊胚后再移回婦女圖19-2體外受精后受精情況體內(nèi)又稱為胚胎移植技術(shù)。受精是嚴(yán)格有序的生理過程，包括精卵識(shí)別、精子發(fā)生頂體反應(yīng)并穿過透明帶、精卵質(zhì)膜融合、卵子激活、雌雄原核形成與融合并最終啟動(dòng)分裂。常規(guī)的體外受精:卵子取出后經(jīng)體外培養(yǎng)約4h（2-8h均可)即可受精。亦有人按HCG注射時(shí)間計(jì)算，HCG后約40h受精。受精時(shí)加入精子密度不宜過高，因?yàn)榉巧硇缘母呙芏染涌赡軙?huì)影響卵子發(fā)育。若是采用50ul的微滴受精，那么每個(gè)卵子加入5000-10000條精子都可獲得相似的受精率和妊娠結(jié)局。體外受精完全不同于體內(nèi)受精，在體內(nèi)能夠最終達(dá)到卵子周圍的精子只有幾十至數(shù)百條，而體外受精需要高出數(shù)百倍的精子以保證受精率，如此高密度的精子與卵子長時(shí)間的共培養(yǎng)，可能會(huì)影響卵子的發(fā)育潛能，如精子代謝產(chǎn)物、活性氧化物等。因此有人提出了縮短精卵共培養(yǎng)時(shí)間，亦即短時(shí)受精，短時(shí)受精精卵共培養(yǎng)時(shí)間從1-6h不等。與傳統(tǒng)的隔夜受精相比，短時(shí)受精減少了由高密度的精子可能帶來的危害，且文獻(xiàn)報(bào)道，短時(shí)受精并不影響受精率，部分文獻(xiàn)報(bào)道可提高胚胎的質(zhì)量和妊娠結(jié)局。而短時(shí)受精時(shí)對(duì)受精的早期判斷，可以為受精失敗或IVF低受精的卵子及時(shí)采取挽救措施，如行補(bǔ)救ICsI。Kuczynski等對(duì)IVF受精24h后失敗的卵子再次ICsI受精，盡管可以獲得受精和胚胎，但胚胎的質(zhì)量很低，胚胎移植后沒有獲得妊娠。認(rèn)為此時(shí)補(bǔ)救ICsI是不值得的。雖說其他研究者在此時(shí)間段有成功妊娠的報(bào)道，但成功率都很低。卵子最早出現(xiàn)的易觀察受精特征是排出第二極體，研究表明，ICsI后2-4h約有22%卵子釋放極體，4h時(shí)約有66%。6-8h會(huì)出現(xiàn)原核。而卵子暴露于精子2-4h后，約有90%在6h后釋放第二極體。因此，有人采用4-6h短時(shí)受精盡早對(duì)受精與否進(jìn)行判斷，以及時(shí)行補(bǔ)救ICsI。Chen等首次報(bào)道了短時(shí)受精聯(lián)合早期補(bǔ)救ICsI的應(yīng)用，與遲補(bǔ)救相比，可獲得更好的臨床結(jié)局，同時(shí)避免了IVF受精失敗周期的取消。早期補(bǔ)救ICsI可以獲得同常規(guī)ICsI接近的妊娠率。但由于卵子可能存在一個(gè)最佳受精時(shí)機(jī)和卵子老化問題，因此補(bǔ)救的時(shí)機(jī)非常重要。另外，因受精后6h左右是精卵相互作用形成原核的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)對(duì)卵子的機(jī)械性操作是否干擾了正常受精程序及其安全性一直備受關(guān)注。受精觀察:觀察受精的時(shí)間是在受精后16-20h，一般在16-18h檢查是否存在原核，以原核的有無以及數(shù)目分為0PN（即未出現(xiàn)PN,受精狀態(tài)不明)，1PN受精，2PN受精，多PN受精（≥3PN受精)，如圖19-2。而出現(xiàn)2PN且卵周隙內(nèi)有2個(gè)極體的受精被認(rèn)為是正常受精。檢查受精情況后，將正常受精的胚胎移人卵裂期培養(yǎng)基培養(yǎng)。若是進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，在受精后的第3天需要將培養(yǎng)基更換為囊胚培養(yǎng)基。二、合子與胚胎質(zhì)量評(píng)估（一）合子評(píng)估原核評(píng)分是胚胎序列評(píng)分和選擇的重要組成部分，僅按原核的數(shù)目分為正常和異常受精是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。雌雄原核的排列和核仁的數(shù)目、分布與胚胎的發(fā)育潛能密切相關(guān)。合子發(fā)育是一動(dòng)態(tài)過程:原核早期核仁小、多，隨機(jī)分布在原核內(nèi)，但隨著時(shí)間的進(jìn)行，核仁聚集重排，因此觀察時(shí)間非常重要。ICsI原核評(píng)分和胚胎質(zhì)量的相關(guān)性要高于IVF胚胎，其原因可能是與ICsI相比，IVF受精時(shí)間不清。現(xiàn)行被廣泛參照的原核評(píng)分方法是2000年sc。t等提出Z分級(jí)，受精后16-18h觀察原核根據(jù)原核及核仁的大小、數(shù)目和分布情況，原核分為Z1-4級(jí)。Z1級(jí):核仁在原核交界處線性排列，每個(gè)原核中的核仁數(shù)目不少于3個(gè)，且兩原核之間的核仁數(shù)目相差不超過3個(gè);Z2級(jí):核仁的數(shù)目相等，均不少于3個(gè)，但核仁均勻分散于原核中;Z3級(jí):兩原核形態(tài)不同，核仁的數(shù)目不同或核仁的分布不同，核仁只在一個(gè)原核中排列成行，在另一原核中核仁分散排列;Z4級(jí):兩原核大小不等且分離或不分布于合子的中央。（二）早卵裂期評(píng)估第一次卵裂的正常啟動(dòng)預(yù)示著卵子的后續(xù)發(fā)育能力，早卵裂的胚胎更傾向于發(fā)展為優(yōu)質(zhì)胚胎，選擇早卵裂胚胎用于移植其妊娠率和植入率更高。Ciray等提出胚胎卵裂早期的形態(tài)對(duì)胚胎的發(fā)育潛能更具預(yù)測價(jià)值，較早卵裂且伴較多碎片的胚胎與晚卵裂胚胎的發(fā)育潛能最差。不是所有早期卵裂胚胎都具有良好的發(fā)育潛能，只有早期卵裂過程中形成正常單核卵裂球的胚胎更傾向于發(fā)育成為優(yōu)質(zhì)胚胎，且植入率更高，提示卵裂早期卵裂球分裂的正常啟動(dòng)對(duì)胚胎進(jìn)一步發(fā)育具有重要意義。文獻(xiàn)報(bào)道觀察早期卵裂的時(shí)間多是在受精后25-27h。也有研究采用實(shí)時(shí)成像系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，過早發(fā)生卵裂（受精后不到20h)的胚胎妊娠結(jié)局并不好。（三）D2/D3胚胎評(píng)估分裂期胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)估指標(biāo)主要包括:胚胎的發(fā)育速度（卵裂球數(shù)目)、卵裂球的均一度、胚胎碎片數(shù)量與分布、胚胎的色澤與胞質(zhì)形態(tài)、透明帶與卵周隙狀態(tài)等。胚胎的發(fā)育速度與其種植力密切相關(guān)，研究認(rèn)為D2移植發(fā)育為4細(xì)胞胚胎可以獲得較高的妊娠率，D3移植≥8細(xì)胞胚胎妊娠率顯著高于8細(xì)胞胚胎，Rac。wsky等認(rèn)為D3發(fā)育為8細(xì)胞的胚胎妊娠率最高。卵母細(xì)胞從激活到受精、到第一次卵裂以及胚胎基因組的激活都嚴(yán)格地按照本身固有的生理時(shí)鐘發(fā)育，可能預(yù)示胚胎具有較高的發(fā)育潛能。2010年多國專家在伊斯坦布爾召開了有關(guān)胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估的會(huì)議，對(duì)胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估提出了共識(shí)性建議（表19-1)。卵裂球的胞質(zhì)形態(tài)對(duì)胚胎的質(zhì)量評(píng)估也很重要，胞質(zhì)中出現(xiàn)的特征性表現(xiàn)如細(xì)胞顆粒粗或粗顆粒區(qū)域集聚、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)集聚、空泡等對(duì)胚胎的發(fā)育潛能的影響值得關(guān)注。細(xì)胞期胚胎分級(jí):1級(jí)胚胎卵裂球大小均勻，形狀規(guī)則，透明帶完整，胞質(zhì)均勻、清晰，胚胎內(nèi)碎片10%;2級(jí)胚胎卵裂球大小略不均勻，形狀略不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片10%-20%;3級(jí)胚胎卵裂球大小明顯不均勻，可有明顯的形狀不規(guī)則，胞質(zhì)可有明顯顆粒現(xiàn)象，碎片21%-50%;4級(jí)胚胎為不可用胚胎，細(xì)胞大小嚴(yán)重不均勻，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆粒現(xiàn)象，碎片超過50%。表19-1受精后合子/胚胎的觀察時(shí)間及理想發(fā)育速度觀察內(nèi)容觀察時(shí)間(受精后)發(fā)育速度D原核D1細(xì)胞;早期卵裂早期卵裂2D23D34D4 517±1h23±1h26±1h(ICsI)28±1h(IVF)44±1h68±1h92±2h116±2h原核期50%為1細(xì)胞(20%在2細(xì)胞)2細(xì)胞4細(xì)胞8細(xì)胞桑甚胚囊胚多核和空泡是胚胎卵裂球常見的一種形態(tài)學(xué)特性。有多核卵裂球的胚胎，其種植潛能降低，染色體異常率高，卵裂球是否出現(xiàn)多核可能比碎片更能預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能。空泡會(huì)影響囊胚形成，空泡形成越遲，對(duì)囊胚形成的影響越大。也有研究認(rèn)為，由滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集而形成的空泡并不影響妊娠率，而影響流產(chǎn)率和嬰兒出生體重?？张輰?duì)妊娠結(jié)局的影響可能依賴于空泡出現(xiàn)的時(shí)機(jī)以及空泡大小、數(shù)量等。目前胚胎的評(píng)估主要采用的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，該種方法具有一定的局限性，主觀性較大，無法準(zhǔn)確的評(píng)估胚胎的發(fā)育潛能。胚胎研究工作者一直致力于探索一些能夠客觀評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育潛能、同時(shí)又是非侵人性的對(duì)胚胎無損傷的檢測手段和觀察指標(biāo)，如代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)，以期準(zhǔn)確評(píng)估胚胎的內(nèi)在質(zhì)量。2010年一篇有關(guān)人類早期胚胎在基因組激活之前的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察的胚胎動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，從受精至D2之間三個(gè)動(dòng)態(tài)、無創(chuàng)性評(píng)估參數(shù):第一次減數(shù)分裂的時(shí)間長度、第一次有絲分裂結(jié)束到第二次開始的時(shí)間間隔以及第二次和第三次分裂的時(shí)間間隔，可以很好的預(yù)測囊胚的形成，近年對(duì)胚胎發(fā)育的動(dòng)力學(xué)研究越來越多，胚胎發(fā)育的動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)評(píng)估將是未來胚胎評(píng)估的一個(gè)方向。三、胚胎移植胚胎可在受精后的第1天原核期到第6天囊胚期內(nèi)移植，但多數(shù)在第3天移植。結(jié)合胚胎的發(fā)育速度，綜合考慮原核、早期卵裂以及細(xì)胞期的評(píng)分，選擇出形態(tài)學(xué)上最優(yōu)的胚胎用于移植。按現(xiàn)有規(guī)定，35歲以下不育者接受第一次助孕者移植胚胎數(shù)不超過2個(gè)，35歲以上，或第二次以上接受助孕者移植胚胎數(shù)不超過3個(gè)。隨著IVF-ET技術(shù)的提高，較高的IVF多胎妊娠率已引起關(guān)注，而控制多胎妊娠最有效的措施便是減少移植胚胎的數(shù)目。目前，選擇性單胚胎移植正在被推廣，尤其是在一些歐洲國家，單胚胎移植的比率越來越高。由于目前尚未完善、準(zhǔn)確的胚胎評(píng)估方法選擇出真正具有發(fā)育潛能的胚胎用于單胚胎移植，單胚胎移植會(huì)降低單次移植周期妊娠率。受到國內(nèi)政策和實(shí)際國情的影響，如國內(nèi)缺少相關(guān)的規(guī)定和法律，且患者完全承擔(dān)費(fèi)用，以及人們對(duì)多胎妊娠危害的認(rèn)識(shí)淡薄，國內(nèi)開展單胚胎移植還存在很大的困難，但越來越多的中心正嘗試對(duì)那些預(yù)后較好的患者選擇性的施行單胚胎移植，尤其是單囊胚移植。（一）胚胎移植所需試劑與材料1.預(yù)先平衡好的盛有胚胎移植培養(yǎng)液的雙井皿。2.IVF工作站。3.氣體與培養(yǎng)箱（飽和濕度、37℃、6%C02)。4.1ml無菌注射器、胚胎移植管。（二）胚胎移植操作步驟1.將待移植的胚胎移至移植液中，在不同的地方多洗幾遍，以便洗掉胚胎周圍的卵裂期培養(yǎng)液。2.將1ml注射器與胚胎移植管連接起來，并旋緊以防漏氣。3.反復(fù)抽吸注射器數(shù)次，再空吸少許體積。先吸一段液體，再吸一段空氣，再吸胚胎，最后再吸一段空氣及少許液體，總體積小于20ul;將轉(zhuǎn)載好胚胎的移植管小心拿至移植室移植。4.將裝有胚胎的導(dǎo)管送到移植室，待外導(dǎo)管進(jìn)入宮腔內(nèi)后，將移植管通過外套管送人子宮腔內(nèi)，將胚胎與移植液緩慢注人宮腔。5.移植結(jié)束后將移植管送回培養(yǎng)室，用導(dǎo)管吸取少許培養(yǎng)基，吹打人培養(yǎng)皿，在鏡下仔細(xì)檢查是否有剩余胚胎。若發(fā)現(xiàn)有遺漏的胚胎則需在另一個(gè)新的培養(yǎng)基中洗凈再次吸人胚胎進(jìn)行移植。6.記錄移植情況，包括時(shí)間、移植管型號(hào)、進(jìn)宮腔情況、有無出血及黏液等。7.胚胎移植結(jié)束后，選擇剩余胚胎中適于冷凍者進(jìn)行冷凍保存。第二節(jié)體外受精.胚胎移植的衍生技術(shù)一、卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracyt。plasmicsperminjecti。n,1Cs1)（一）概述為了提高IVF受精率以及改善男性因素的體外受精的結(jié)局，人們嘗試多種改進(jìn)的體外受精的方法，如方便精子穿透卵子透明帶，到達(dá)質(zhì)膜與卵子結(jié)合，采取透明帶開孔（z。nadriling,ZD)、部分透明帶切除 （partialz。nadisecti。n，PZD)、透明帶下授精（subz。nalinseminati。n,sUZI)，但這些方法并未能改善卵子的正常受精率、妊娠結(jié)局。ICsI越過了自然受精時(shí)精卵的識(shí)別和結(jié)合步驟，以一種侵人性方式將精子注人卵子內(nèi)。1962年，Hiram。t。首次應(yīng)用該技術(shù)成功使海膽卵母細(xì)胞受精，隨后Lin將ICsI技術(shù)應(yīng)用在小鼠卵子受精上，1988年Iritani等首次報(bào)道ICsI動(dòng)物的出生。1992年比利時(shí)布魯塞爾自由大學(xué)，Palerm。等報(bào)道了世界首例人類經(jīng)ICsI技術(shù)受精胚胎移植后獲得妊娠成功，標(biāo)志著ICsI技術(shù)在人類輔助生殖技術(shù)中的應(yīng)用獲得重大突破。ICsI技術(shù)受精缺少精子的穿透與精卵的自然融合，而是以一種侵人性操作將精子注人卵子，由此引起的卵母細(xì)胞激活也有別于IVF受精，其產(chǎn)生的Ca2+振蕩的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間和IVF受精卵母細(xì)胞的激活存在差異。最初有研究者認(rèn)為，ICsI操作過程中回抽胞質(zhì)，可激發(fā)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的流動(dòng)，形成Ca2+振蕩，激活卵母細(xì)胞，后有人證明，強(qiáng)烈回抽胞質(zhì)可引起Ca2+振蕩，但其強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間不足以激活卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞的激活依賴于精子來源的卵母細(xì)胞激活因子，對(duì)活化因子到底是什么生物化學(xué)物質(zhì)，目前沒有完全的結(jié)論。文獻(xiàn)報(bào)道大部分人認(rèn)為可能是磷酸脂酶（ph。sph。lipaseCzeta,PLC-5)。PLC-5分布于精子頂體后區(qū)的核周鞘，位于頂體赤道段的質(zhì)膜下。不孕夫婦中近30%源于男性因素不孕，ICsI技術(shù)的應(yīng)用，為男性因素不育患者提供了獲得子代的機(jī)會(huì)。對(duì)于少弱畸精癥以及梗阻性無精癥患者的受精率顯著提高，可以獲得同IVF相近的妊娠率。但人們對(duì)ICsI技術(shù)安全性的擔(dān)憂從未停止過，主要考慮率是ICsI違背了自然受精的精卵結(jié)合的受精過程，以及ICsI作為一種侵人性操作，人為的選擇精子對(duì)精子的質(zhì)量的篩選存在一定的盲目性。有研究認(rèn)為ICsI的出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)增加，但這可能是精子原因?qū)е拢荌CsI技術(shù)操作本身引起，因?yàn)镮CsI助孕的患者中部分是嚴(yán)重少、弱、畸精，這些患者的精子自身可能存在某些缺陷，從而增加了后代出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)。（二）卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射的適應(yīng)證和禁忌證1.ICsI適應(yīng)證（1）嚴(yán)重的少、弱、畸精癥。（2）不可逆的梗阻性無精癥。（3）生精功能障礙（排除遺傳疾病缺陷所致)。（4）免疫性不育。（5）既往常規(guī)IVF受精失敗。（6）精子無頂體或頂體功能異常。（7）需行植入前胚胎遺傳學(xué)檢查。2.ICsI禁忌證（1）男女一方患有嚴(yán)重的精神疾患、泌尿生殖系統(tǒng)急性感染、性傳播疾病。（2）患有《母嬰保健法》規(guī)定的不宜生育的、目前無法進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷的遺傳性疾病。（3）任何一方具有吸毒等嚴(yán)重不良嗜好。（4）任何一方接觸致畸量射線、毒物、藥物并處于作用期。（5）女方子宮不具備妊娠功能或嚴(yán)重軀體疾病不能承受妊娠。（三）卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射的基本步驟1.儀器設(shè)備（1）顯微鏡:倒置顯微鏡、顯微操作儀、立體顯微鏡。（2）如果需要自制注射針和固定針（持卵針)，需要特定的制針設(shè)備，如拉針儀、煅針儀、磨針儀。2.耗材及試劑（1）耗材:培養(yǎng)皿、巴氏德吸管、移液管、移液器、顯微操作針（持卵針、注射針)。（2）試劑:礦物油、HsA或sPs、含HEPEs或M0Ps的緩沖培養(yǎng)基、透明質(zhì)酸酶、PVP、胚胎培養(yǎng)液。3.ICsI操作前的準(zhǔn)備（1）卵子的準(zhǔn)備:操作前，采用透明質(zhì)酸酶溶液（80U/ml)去除卵母細(xì)胞外圍卵丘顆粒細(xì)胞，去除程度以能夠看清卵胞質(zhì)形態(tài)和第一極體而不影響顯微注射為宜。鏡下辨別卵母細(xì)胞成熟度。挑出成熟卵 （MⅡ）待ICsI受精。（2）精子的準(zhǔn)備①少弱精者精液可用密度梯度離心法處理，嚴(yán)重少弱精者可將液化后的精液采用微量密度梯度離心法或直接對(duì)精液原液離心處理。②行附睪穿刺抽吸取精時(shí)，應(yīng)在注射針筒中預(yù)先吸人1ml培養(yǎng)液，抽吸附睪液后，連同1ml培養(yǎng)液注人培養(yǎng)皿中，這樣防止少量的附睪液粘在穿刺針筒中損失掉;另一方面也便于觀察抽吸液中精子的濃度，但這樣又稀釋抽吸液，因此常需離心（1000rpmx10min）后使用，若其中活動(dòng)精子計(jì)數(shù)較高，如每個(gè)高倍鏡下多于10條精子也可直接使用。③用睪丸精子ICsI時(shí)，先將曲細(xì)精管用兩張玻片或兩支針?biāo)核椋賹⒋嘶鞈乙何穗x心管中，靜置培養(yǎng)箱孵育一段時(shí)間，直到用前，反復(fù)吹打混勻，再靜置數(shù)分鐘，待大塊組織沉淀后，將上層液體離心 （1000rpmx10min）后使用。（3）ICsI操作皿的準(zhǔn)備①取Falc。n1006培養(yǎng)皿1個(gè)，吸適量PVP,在皿中做出3個(gè)10ul微滴，兩側(cè)做出條形微滴，條形微滴下端加少量的精子懸液，以讓精子自由游動(dòng)至上端。如是嚴(yán)重少弱精或是睪丸/附睪精子，不用制作條形PVP微滴，直接將精子懸液制作條形微滴即可。②在PVP的上方做3-6個(gè)10ul、含5%HsA的緩沖培養(yǎng)基微滴，用已經(jīng)平衡的礦物油覆蓋后置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)備用。盡可能縮短制作操作皿的時(shí)間，因?yàn)槲⒌误w積較小，極易因揮發(fā)而改變液體的滲透壓。（4）安裝、調(diào)節(jié)顯微注射系統(tǒng)①打開顯微鏡、顯微操作系統(tǒng)及載物臺(tái)熱板;確保所有操作控制都恢復(fù)至原有的可控操作內(nèi)，可以平穩(wěn)的、舒適的開展操作。②安裝顯微固定針和注射針。如是液體介質(zhì)控制的系統(tǒng)，應(yīng)避免注射針管道系統(tǒng)中有氣泡，因氣泡將影響到顯微注射的準(zhǔn)確性。調(diào)節(jié)注射裝置，以使其可靈活地控制抽吸。③4倍物鏡下下調(diào)固定針與注射針，依次調(diào)節(jié)其角度與位置，使兩者針頭相對(duì)并與載物臺(tái)平行，前后左右移動(dòng)操作針，10倍、20倍物鏡下檢查所裝操作針的移動(dòng)范圍。 （5）ICsI顯微操作①將已選好的MⅡ卵轉(zhuǎn)人ICsI操作皿的緩沖培養(yǎng)基微滴中。②將盛有卵子的操作皿放置于調(diào)好的顯微操作儀的熱臺(tái)上﹔在低倍鏡下調(diào)節(jié)顯微鏡焦距使操作皿內(nèi)微滴的邊緣清晰可見。③將注射針降人ICsI操作皿的圓形PVP微滴，調(diào)節(jié)顯微鏡使注射針清晰可見，同時(shí)吸人少量PVP進(jìn)入注射針﹔將注射針移人含有精子的條形PVP微滴中，選擇精子并將選擇的精子吸人注射針，轉(zhuǎn)人圓形PVP微滴，將精子放置于操作皿底部。④制動(dòng)∶用注射針在精子尾部的中段或下段輕壓，迅速回拉注射針，劃過精子，使精子制動(dòng)﹔或在壓住精子后，保持注射針的高度不變，左右移動(dòng)注射針使精子制動(dòng)，在移動(dòng)注射針的過程中可以觀察到精子尾部輕微的轉(zhuǎn)動(dòng)。不要用力過猛或反復(fù)多次制動(dòng)，否則精子會(huì)黏附在培養(yǎng)皿底部使吸取精子困難，如是發(fā)生此類情況，應(yīng)放棄該精子，重新選擇精子并制動(dòng)。制動(dòng)過中精子尾部膜破裂被認(rèn)為有利于卵子的激活。⑤通常是從精子尾部吸人被制動(dòng)的精子，也可以根據(jù)習(xí)慣從頭部吸人（也可以省去步驟⑤、⑥，直接在含有精子的條形PVP微滴中制動(dòng)精子）。⑥降下固定針至微滴中，并輕撥動(dòng)卵子，使第一極體位于6點(diǎn)或12點(diǎn)處，固定卵子。調(diào)節(jié)顯微操作針和卵膜至同一水平面，將注射針中的精子推至針尖處，注射針從卵子3點(diǎn)鐘處穿人透明帶并繼續(xù)進(jìn)針，至中心或越過中心位置。由于卵膜的彈性，進(jìn)針處卵膜出現(xiàn)漏斗狀，但卵膜仍未破裂，此時(shí)仍不能注射精子，需輕微回吸注射針以確認(rèn)膜破裂。一旦刺破卵膜可見到胞質(zhì)和精子的一個(gè)快速反流的過程或可見卵膜回彈現(xiàn)象，之后將精子注人卵子胞質(zhì)內(nèi)，盡量減少進(jìn)入卵子中的PVP液。⑦退出注射針，將注射后的卵子在受精和卵裂培養(yǎng)基中洗滌數(shù)次，移人卵裂培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。⑧注射后卵子的培養(yǎng)。將ICsI后的卵子于卵裂培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-18h后，在倒置顯微鏡下檢查原核數(shù)目及形態(tài)。出現(xiàn)兩個(gè)原核、同時(shí)卵周隙可見兩個(gè)極體被視為正常受精。胚胎培養(yǎng)、觀察及移植同IVF。（四）ICsI的臨床結(jié)果ICsI可以顯著提高由男性因素導(dǎo)致不孕患者的受精率和妊娠結(jié)局，但Nangia等在對(duì)2004一2008年多中心數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示∶對(duì)于非男性因素、僅輸卵管結(jié)扎患者中實(shí)施ICsI,降低臨床妊娠率和活產(chǎn)率。但也有人認(rèn)為ICsI并不降低妊娠率。ICsI可用于補(bǔ)救IVF受精失敗的卵母細(xì)胞，稱之為“補(bǔ)救ICsI”或“l(fā)ateICsI”,此類補(bǔ)救一般在受精后的第2天執(zhí)行，其受精率可達(dá)50%以上，但由于卵母細(xì)胞老化，獲得的胚胎質(zhì)量以及移植后的妊娠結(jié)局都很差。目前，很多中心采取“早期補(bǔ)救ICsI”,即取卵當(dāng)日以受精后的卵母細(xì)胞排出第二極體來盡早對(duì)受精與否進(jìn)行判斷，以便對(duì)IVF失敗的卵母細(xì)胞盡快行ICsI。早期補(bǔ)救ICsI可以獲得和ICsI相近的受精率和妊娠率。（五）ICsI的安全性問題由于ICsI違背了自然受精過程，且是一種侵人性的操作，人們對(duì)ICsI的安全性問題的擔(dān)憂一直沒有停止過。ICsI不像IVF技術(shù)那樣在廣泛應(yīng)用到人類之前有多年的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，ICsI技術(shù)因臨床迫切需要而被迅速傳播﹔ICsI技術(shù)失去了精卵結(jié)合過程中對(duì)精子的自然篩選，人為選擇的精子在質(zhì)量上存在極大的盲目性，此外ICsI操作可能造成卵母細(xì)胞的機(jī)械損傷，無論ICsI過程中使用的PVP是卵母細(xì)胞本沒有的物質(zhì)，注人的PVP去向以及其長期的影響都是令人擔(dān)憂的問題。現(xiàn)已有ICsI技術(shù)使Y染色體上的與精子發(fā)生相關(guān)的基因缺陷及其他遺傳問題傳給男性子代的案例。結(jié)合胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)，選擇性生女孩，可以避免遺傳缺陷后代的出生。目前，對(duì)ICsI安全性研究的報(bào)道并不一致，有的結(jié)果顯示，ICsI技術(shù)并不增加?jì)雰合忍煨曰蔚陌l(fā)生率，也有一些調(diào)查發(fā)現(xiàn)，ICsI后代染色體異常的發(fā)生率要高于正常生育的嬰兒，出生缺陷的發(fā)生率也較IVF高。最新的一篇文獻(xiàn)顯示，ICsI出生缺陷為9.9%，高于IVF的7.2%和自然妊娠的5.8%，在經(jīng)過多變量校正